Методическая статья

Простой и эффективный способ для подготовки яичек клеточные суспензии

DOI:

10.3791/50102

⸱

4 августа 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Biología Molecular, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable (IIBCE), 2Servicio de Citometría de Flujo y Clasificación Celular (SECIF), Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable, 3Sección Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad de la República

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Роман протокол для механической подготовки яичек клеточные суспензии от грызунов материала, избегая ферментов и моющих средств, описан. Метод очень прост, быстр, воспроизводимым, и оказывает хорошее качество клеточные суспензии, которые подходят для сортировки потоков и экстракции РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Семенниках млекопитающих очень сложных органов, которые содержат более 30 различных типов клеток, в том числе соматических клетках яичек и различных стадиях половых клетках. Эта неоднородность является важным недостатком относительно изучения основы сперматогенеза у млекопитающих, в виде чистого или обогащенного популяции клеток на определенных стадиях развития спермы необходимы для большинства молекулярного анализа 1.

Различные стратегии, такие как 2,3 Staput, центробежные Отмучиванием 1, и проточной цитометрии (FC) 4,5 были использованы для получения обогащенных или очищенной популяции клеток яичек, с тем чтобы дифференциальных исследований экспрессии генов.

Это требует, чтобы клетки в суспензии в течение наиболее обогащения / очистки подходов. В идеальном случае клеточной суспензии будет представитель исходной ткани, имеют высокую долю жизнеспособных клеток и несколько multinucleates - которые имеют тенденцию формировать из-засинцитиальный природе эпителия семенных 6,7 - и отсутствие скопления клеток 1. Предыдущие доклады свидетельствуют, что яичек клеточные суспензии подготовленный исключительно механическим способом слипаются легче, чем те, трипсинизированных 1. С другой стороны, ферментативные процедуры с РНКазы и / или дезагрегации ферментов, как трипсин и коллагеназу приводят к конкретным деградации макромолекул, что является нежелательным для некоторых последующих применений. Идеальный процесс должен быть как можно короче и включают минимальные манипуляции, так как для достижения хорошей сохранности макромолекул интереса, таких как мРНК. Текущие протоколы для приготовления суспензии клеток из твердых тканей обычно времени, весьма зависит от оператора, и может выборочно повредить определенные типы клеток 1,8.

Протокол, представленные здесь сочетает в себе преимущества высокой воспроизводимостью и очень кратко механической дезагрегации сbsence ферментативной обработки, что приводит к хорошим качеством клеточных суспензий, которые могут быть использованы для анализа методом проточной цитометрии и сортировки 4 и скрытые исследования экспрессии гена 9.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление клеточных суспензий

  1. Жертвоприношение образца, которые будут использоваться в соответствии с рекомендациями специализированных комитетов, таких как IACUC или эквивалент (в Уругвае, Национальная комиссия по экспериментов на животных [НКАЭ]). В нашем случае передозировки пентобарбитала вводили.
  2. Проанализируйте яичках после стандартных утвержденных процедур и разместить их в 96 мм стеклянная чашка Петри на льду, содержащую 10 мл ледяной DMEM с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки.
  3. Снимите белочной оболочки и нарезать декапсулируется яички на квадратные заготовки из 2 - 3 мм с каждой стороны.
  4. Эти части затем обрабатываются в Medimachine, автоматизированной механической мясорубки, где ткань в разбивке внутри одноразового единица содержит перфорированный из нержавеющей стали с плоским экраном и металла ротора. Для этого, 1 место мл холодной дополнен DMEM и 4 - 5 из этих частей в 50 мкм одноразовые аппарата включите disaggregator, и процесс в течение 50 сек следуя простым инструкциям от производителя.
  5. Восстановление полученной клеточной суспензии из разбивки устройства с помощью 3 - 5 мл шприц без иглы.
  6. Фильтруют через 50 мкм нейлоновую сетку, предварительно пропитанные 0,5 мл DMEM, дополненный.
  7. Суспензию фильтруют еще раз, используя пропитанную 25 мкм нейлоновую сетку, и место на льду.
  8. Всего в камере Нойбауэра и настроить сотовые концентрации до 1 - 2 х 10 7 клеток / мл DMEM дополнена. По крайней мере, 4 х 10 7 клеток / грамм материала яичка обычно получаются.
  9. Наконец, добавьте NDA (2-нафтол-6 ,8-дисульфокислоты, двухкалийна соль) до конечной концентрации 0,2%, чтобы предотвратить слипание клетки.
  10. Дополнительно: проверить жизнеспособность клеток яичек клеточные суспензии имеющейся в продаже комплект для жизнеспособности клеток животных, следуя инструкциям производителя.

2. Проточной цитометрии

ve_content "> Мы использовали Becton-Dickinson FACSVantage проточной цитометрии оснащен когерентной аргоновый ионный лазер настроен на излучающих на длине волны 488 нм для анализа клеток, окрашенных с высокой концентрацией йодида пропидий (PI). (вопрос о входе в PI нефиксированной Клетки в состоянии стресса была решена в другом месте 9,10).

  1. Для окрашивания PI, добавьте флуорохромом в конечной концентрации 50 мкг / мл к суспензии клеток, и инкубировали в течение 10 мин при 0 ° C в темноте.
  2. Мощность лазера установлен в 100 мВт и 575/26 полосовой фильтр используется для сбора PI-испускаемых флуоресценцию в FL2.
  3. Мы проводим измерения с FC 70 мкм сопла. Для сортировки сперматоцит населения, установить режим сортировки в Normal-R или Normal-C, с использованием 3 капли отсортированы как конверт. Хранить образца и сбор труб на 3 - 4 ° С с помощью холодильной установки. Регулировка образец дифференциального анализа клетки со скоростью от 500 до 1500 в секунду.
  4. Используйте CellQuest программного обеспечения (BD) для анализаследующими параметрами: прямого рассеяния (FSC-H); бокового рассеяния (SSC-H); полной излучаемой флуоресценции или широтно-области (FL2-А), и длительность флуоресценции или широтно-импульсной (FL2-W).

Кроме того, мы использовали витальным красителем Hoechst 33342 до конечной концентрации 5 мкг / мл и инкубировали в течение 10 мин при 37 ° С в темноте. Сотовые анализ проводили с помощью MoFlo цитометра (DakoCytomation), снабженный УФ волны возбуждения лазера, работающего на 25 мВт и с помощью 70 мкм сопла. Данные манипуляции проводили с саммита v4.3 программное обеспечение (DakoCytomation).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пример хорошо дезагрегированных суспензии клеток крысы семенников приготовленные с протоколом, описанным здесь показана на рисунке 1.

По сравнению с ферментативной процедуры 6,8 и в ранее описанных механических методов дезагрегирования 2, один представленный здесь происходит гораздо быстрее, требует меньше обработки, легко воспроизводимы (не зависит от оператора), а также оказывает дефицитный клеточного дебриса (особенно по сравнению с другими механичес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптимизированный метод, описанный здесь позволяет получать суспензии клеток с грызунами ткани яичек в очень быстрым и воспроизводимым образом, избегая фермента и моющее средство лечения и поддержания хорошей целостности клеток и типа пропорции. Краткость процедуры (15 мин участок включает рассечение яичка, ткани резки и обработки), минимальной обработкой участие, и отсутствие ферментативного лечения являются одними из основных преимуществ. Все это могло бы объяснить и хорошая сохранность коротких макромолекул жизни, что...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана CSIC (I + D проектом C022) и PEDECIBA. Авторы хочу поблагодарить Мариэле Bollati и Валентина Порро из отдела клеточной биологии (Institut Pasteur Монтевидео) за их щедрую о сотрудничестве сортировщика MoFlo ячейки, а Merial-Монтевидео мягко предоставляя все свинки образцы, используемые в этом проекте. Рисунок 1 была воспроизведена с разрешения BioMed Central; рисунках 2 и 3, а в таблице 1 с разрешения С. Karger AG, Базель, а 4 и 5 были воспроизведены или адаптированы с разрешения John Wiley & Sons, Inc (авторские права принадлежащие Wiley- Blackwell, 2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Система MedimachineBD340587
Medicon unit (50 μ m)BD340591
установка Filcon (50 μ m)BD340603
DMEMGibco430-2100
Фетальная сыворотка теленкаPAAA11-151
NDAChemos BmbH277081
H– chst 33342Sigma-Aldrich14533Стоковый раствор 5 мг/мл; используется в конечной концентрации 5 мкм; г/мл
Пропидия йодидSigma-Aldrich287075Стоковый раствор 1 мг/мл; используется в конечной концентрации 50 мкм; г/мл

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
  2. Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
  3. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
  4. Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
  5. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602(2011).
  6. Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
  7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
  8. Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
  9. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
  10. Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
  11. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
  12. Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Testicular Cell SuspensionMechanical DisaggregationFlow CytometryCell Population SortingRodent Testis PreparationCell Viability StainingDNA Content AnalysisGene Expression StudiesCell Clumping PreventionNon Enzymatic Method

Похожие статьи