Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50117

⸱

9 ноября 2012 г.

 ,  , 
1Department of Physics, Lawrence University

В этой статье

Краткое содержание

Метод измерения длины сохранение или жесткость на изгиб биополимеров описано. Метод использует кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа экспериментально определить сохранением длины отдельных микротрубочек и адаптируется к актина на основе скользящих анализов.

Аннотация

Микротрубочки цитоскелета являются полимерами, которые играют важную роль в делении клеток, клеточной механики и внутриклеточного транспорта. Каждая из этих функций требует микротрубочек, которые являются жесткими и прямыми достаточно, чтобы охватить значительную часть клетки диаметра. В результате, длина микротрубочек настойчивость, мера жесткости, активно исследуется в течение последних двух десятилетий 1. Тем не менее, открытыми остаются вопросы: короткие микротрубочки в 10-50 раз менее жесткими, чем длинные микротрубочки 2-4, и даже долго микротрубочек измерили сохранением длины, которые зависят от порядка 5-9.

Здесь мы представляем метод для измерения длины микротрубочек настойчивость. Метод основан на кинезин управляемые скольжением микротрубочек анализа 10. Благодаря сочетанию редких флуоресцентные маркировки отдельных микротрубочек с одной отслеживание частиц отдельных флуорофоров прикреплены к микротрубочек, Glidinг траектории одной микротрубочки отслеживаются с нанометрового уровня точности. Сохранение длины траектории так же, как сохранение длины микротрубочек в соответствии с условиями 11. Автоматизированное отслеживание используется для создания микротрубочек траекторий из флуорофоров к отдельным микротрубочки, и сохранением длины этой траектории рассчитывается с использованием процедуры, написанные на IDL.

Эта техника быстро реализуемым, и способны измерять сохранение длиной 100 микротрубочек в один день эксперимента. Метод может быть расширен для измерения длины настойчивость в различных условиях, в том числе сохранением длины в зависимости от длины вдоль микротрубочек. Кроме того, анализ процедур, используемых может быть продлен до миозина на основе действующего скольжение анализы, чтобы измерить длину сохранение нитей актина, а также.

Введение

Цитоскелет, сеть биополимеров, обнаруживающаяся в большинстве эукариотических клеток, играет важную роль в организации клетки, внутриклеточном транспорте и механике клетки. Механические характеристики биополимеров цитоскелета (преимущественно актина и микротрубочек) в значительной степени определяют механические характеристики клетки в целом12. Поскольку механика всей клетки может служить признаком здоровых и больных клеток13,14, а также участвовать в клеточной подвижности15, механические свойства лежащих в ее основе компонентов цитоскелета являются активной областью исследований на протяжении последних двух десятилетий1.

Гибкость (или жесткость) биополимеров характеризуется длиной персистентности — длиной полимера, который изгибается примерно на один радиан под воздействием тепловых флуктуаций при температуре окружающей среды. Для измерения длины персистентности было разработано множество методов16; например, активные методы, предполагающие изгиб полимера с помощью гидродинамического потока, оптических ловушек или электрических полей4,17,18, а также пассивные методы, основанные на измерении флуктуаций свободных полимеров в растворе5,6. Однако активные измерения требуют специализированного оборудования для приложения заданных сил на микрометровом масштабе, а измерения свободных флуктуаций могут быть затруднены из-за диффузии молекул за пределы плоскости фокусировки используемого микроскопа.

В данной статье мы описываем дополнительный пассивный метод измерения длины персистенции микротрубочек, полимеров цитоскелета. Метод основан на анализе скольжения, который гарантирует, что полимер всегда остается в фокальной плоскости19. Кроме того, метод предполагает отслеживание отдельных флуорофоров, permanently прикрепленных к изучаемому полимеру, что позволяет детально охарактеризовать конкретные участки вдоль полимера.

Схематическое изображение метода представлено на Рисунке 1. Кинезин перемещается специфически к «+» концу микротрубочек, поэтому в анализе скольжения микротрубочки движутся однонаправленно. Свободный конец микротрубочки, находящийся за пределами последнего прикрепленного кинезина, может колебаться под воздействием тепловых сил окружающего раствора. По мере продвижения микротрубочки вперед ее конец колеблется до тех пор, пока связывание с новой молекулой кинезина дальше по стеклянному предметному стеклу не зафиксирует определенное колебание. Поскольку кинезин очень прочно связывает микротрубочки, микротрубочка вынуждена следовать по траектории своего переднего конца. Следовательно, статистические флуктуации, зафиксированные в траектории микротрубочки, совпадают со статистическими флуктуациями свободного конца микротрубочек11, и, таким образом, могут быть использованы для расчета персистентной длины согласно20

Уравнение статического равновесия; ⟨cosθ_s⟩=e^(-s/l_p). Формула для научного анализа.
где lp — персистентная длина микротрубочки, θs — угол между касательными к траектории, разделенными длиной контура s, а <> обозначает усреднение по всем парам положений, разделенных длиной контура s.

В самом анализе скольжения используется кинезин, биотинилированный по coiled-coil21 и специфически связанный со стеклянным предметным стеклом посредством стрептавидин-биотинового комплекса. Такое крепление гарантирует, что моторные домены свободны для связывания с микротрубочками и их перемещения. Для отслеживания траекторий микротрубочки подвергают редкому мечению органическими флуорофорами22,23 — метки должны быть достаточно редкими, чтобы отдельные флуорофоры были различимы с помощью флуоресцентной микроскопии одиночных молекул. Отслеживание одиночных флуорофоров осуществляется с помощью процедур анализа изображений, написанных на языке IDL. Траектории каждого флуорофора, связанного с конкретной микротрубочкой, автоматически объединяются в общую траекторию микротрубочки24. Вычисляются тангенциальные углы θ для каждой точки вдоль траектории; на основе этих тангенциальных углов рассчитывается значение <cosθs> для каждой длины контура s. Наконец, эти данные аппроксимируются по уравнению 1 для определения длины персистенции данной микротрубочки или множества микротрубочек в одном анализе скольжения.

Данный метод достаточно надежен для работы с микротрубочками, подготовленными в широком диапазоне условий (с различными стабилизирующими агентами или другими малыми молекулами, связанными с микротрубочками, со связанными микротрубочко-ассоциированными белками (MAPs) или в различных вязких растворах). В нашей лаборатории эта методика использовалась для характеристики персистентной длины микротрубочек в зависимости от положения вдоль микротрубочек, а также микротрубочек с различными стабилизирующими агентами. Основным ограничением является то, что микротрубочки должны поддерживать подвижность кинезина. Поскольку кинезин является устойчивым моторным ферментом, это ограничение достаточно мягкое. Заменив микротрубочки актином, а кинезин — ферментом семейства миозина, можно измерить персистентную длину актина с помощью той же методики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Микротрубочек Gliding анализа растворов

Подготовка перед анализом скольжения.

  1. Полимеризации 0,5 мг микротрубочек редко помечены яркой органических флуорофоров 22. Концентрацией целевой метки составляет 1 флуорофора в микрометра микротрубочек, или маркировки плотности примерно 1 флуорофора на 1500 димеров тубулина. Хранить при комнатной температуре, защищенном от света алюминиевой, фольги на срок до двух недель.
  2. Очищают биотин-кинезин 21 на примерно 1 мкм. Хранить при -80 ° C в 5 мкл аликвоты для использования в отдельных экспериментах.
  3. Подготовка буфере (AB) 50 мМ imidiazole, 50 мМ хлорид калия (KCl), 4 мМ хлорида магния (MgCl 2), 2 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты (EGTA), рН 6,7. Стерильный фильтр и хранить при 4 ° C.
  4. Растворите биотинилированного бычьего сывороточного альбумина (БСА биотин) до 2 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца.Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С на срок до одного месяца.
  5. Растворите стрептавидином (SA) до 10 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при температуре от -80 ° С в 20 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
  6. Растворите α-казеин до 5 мг / мл в AB. Фильтр с 0,2 мкм фильтр шприца. Хранить при -80 ° C в 100 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение двух недель.
  7. Растворите дитиотреитол (DTT) в деионизированной воде при 200 мМ. Хранить при -20 ° C в 100 мкл аликвоты, использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
  8. Растворите паклитаксел (PT) в ВЭЖХ-класса диметилсульфоксид (ДМСО) при 4 мМ. Магазин в 10 мкл аликвоты при -80 ° C долгосрочной перспективе, -20 ° C краткосрочной перспективе. Использовать в течение 8 часов оттаивания. Может быть замораживать.
  9. Растворите глюкозы в деионизированной воде при 120 мг / мл. Хранить в 100 мкл аликвоты при -20 ° C. Может быть замораживать.
  10. Расстояниерешить аденозинтрифосфата (АТФ) в деионизированной воде при 150 мМ, рН 7,0. Хранить в 5 мкл аликвоты при -80 ° C, использовать в течение 8 часов оттаивания.
  11. Подготовка 100x кислород складе 25 по растворению 10.000 единиц оксидаза глюкозы и 156000 единиц каталазы в 600 мкл буфера для анализа общего. Центрифуга на микроцентрифуге для осаждения твердых частиц; супернатанта с фильтром 0,2 мкм шприц. Хранить при температуре от -80 ° С в 10 мкл аликвоты в течение длительного времени, при 4 ° С в течение одной недели.

2. Микротрубочек Gliding анализа, же препарат Solution Day

Подготовка решений в 2.1-2.6 в день эксперимента. С практикой решений 2.2-2.6 могут быть получены в течение поток-элементный стирки. Если не указано иное, держать растворов на льду.

  1. Подготовка AB, 1 мл буфера для анализа с 10 мкл DTT складе (AB 2 мМ DTT). Хранить при комнатной температуре.
  2. Подготовка био-BSA буфере, 40-му, Л смеси 1:1 биотин-BSA акции и AB. Хранить при комнатной температуре.
  3. Подготовка BSA буфера, смешивая 645 мкл AB с 5,5 мкл BSA (1 мг / мл BSA в AB). Хранить при комнатной температуре.
  4. Подготовка SA буфера, смешивая 57 мкл AB с 3 мкл складе стрептавидина (0,5 мг / мл стрептавидином в AB). Хранить при комнатной температуре.
  5. Подготовка α-казеин буфера, смешивая 200 мкл BSA буфера, 50 мкл складе казеина и 0,8 мкл 15 мкМ АТФ (1 мг / мл α-казеина, 0,8 мг / мл BSA, 50 нМ ATP в AB). Хранить при комнатной температуре.
  6. Подготовка флуоресценции анти-отбеливателя буфера, смешивания 95 мкл α-казеин буфера, 2,5 мкл складе глюкозы, 1 мкл 100x кислород смеси, 1 мкл складе паклитаксел, 1 мкл 2-меркаптоэтанол (βME). Добавить βME под вытяжным шкафом. Использование флуоресценции анти-отбеливателя буфера в течение 1 часа подготовки. ОСТОРОЖНО: βME является высокотоксичным и пахнет ужасно. Будьте уверены, чтобы открыть только под вытяжным шкафом. Хранить бутылки вотсутствие света, свет разлагается βME и его способность снижать фотообесцвечивания.

3. Микротрубочек Gliding анализа

  1. Построить около четырех потоков полосы между 24 × 60 покровное мм и 22 х 22 мм покровным использованием вакуумной смазки, выдавливается из шприца через кончика пипетки, в качестве прокладки. Каждый поток полосы должна быть примерно 10 мкл объема (масштаба последующие тома соответственно).
  2. Вымойте 10 мкл био-BSA буфера в каждой полосе. Инкубировать 5 мин, чтобы BSA, чтобы покрыть стеклянные поверхности.
  3. Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного биотина-BSA, продолжая блокировать поверхности скольжения. Используйте Kimwipe или фильтровальной бумагой, чтобы удалить буфер из противоположную сторону проточной камеры, будучи уверенным, чтобы не допустить пузырьков воздуха, чтобы пройти через проточную камеру.
  4. Вымойте 15 мкл SA-буфер в каждой полосе. Подождите 10 минут, или до 2 часов. Стрептавидин будет связываться с поверхностью связанного биотина BSA.
  5. Промойте каждую полосу в три раза с 15 мкл буфера BSA для удаления свободного SA, продолжая блокировать поверхности скольжения.
  6. Промойте каждую полосу с 15 мкл α-казеин буфера. α-казеин помогает блокировать дальнейшее неспецифического связывания кинезина и микротрубочки к стеклу.
  7. Развести кинезин до 10 нм в α-казеин буфера и мыть каждую полосу с 15 мкл этого кинезин - α-казеин решение. Подождите 15 минут (или до часа) для биотинилированного кинезин специфически связываться с поверхностью связанных стрептавидином. Кинезин двигателя областях будет оставаться свободным связывать микротрубочек.
  8. Развести паклитаксела до 40 мкм в комнатной температуре α-казеин буфера, и мыть каждую полосу с 15 мкл этого раствора, чтобы смыть бесплатно кинезина и для предварительной загрузки каждого потока камера с паклитакселом решение для предотвращения деполимеризации микротрубочек с. Холодная также деполимеризует микротрубочки, поэтому убедитесь, что действия происходят при комнатной температуре с комнатным temperatuповторного решения.
  9. Развести флуоресцентно меченые микротрубочки 1:100-1:1,000 флуоресценции анти-отбеливателя буфера с 1 мМ АТФ. Вымойте 15 мкл в одну полосу и наблюдать в течение 30 мин.

4. Сбор данных

  1. Соблюдайте микротрубочек скольжения с помощью флуоресцентной микроскопии; микроскопа способна решить одну флуорофоры, такие как коммерческие или домашние сборка установки TIRF требуется 26 (рис. 2).
    Микротрубочек должно быть движение с помощью двигателя кинезин на подложке примерно в 0,5 мкм / с, в зависимости от температуры. Если поле-обзора микроскопа составляет 50 мкм, индивидуальные микротрубочки должны быть видны в течение примерно 100 секунд. Установите интенсивность освещения таким образом, чтобы одна флуорофоров не photobleach быстрее, чем 100 сек. При использовании лазерного возбуждения, мощность установки примерно 3-5 мВт является целесообразным.
  2. Сбор последовательности изображений для анализа. 600 изображений в5 Гц (2 мин общего числа) работает хорошо. Использование последовательности достаточно долго, что микротрубочки пройти все поле-обзора.

5. Анализ данных

Рутинной IDL, get_lp.pro , прилагается. Эта процедура возвращает значение сохранения длины на основе всех микротрубочек скольжения в данной последовательности изображений. Либо запустить эту процедуру на каждой последовательности изображений, изменение параметров интенсивности в зависимости от настройки микроскопа, или выполните следующие действия:

  1. Отслеживать каждого флуорофора прикреплены к микротрубочек создать флуорофора траектории.
  2. Смешайте все траектории флуорофоры на данный микротрубочек в общую траекторию микротрубочек, повторите для каждого микротрубочек в последовательности изображений (рис. 3).
  3. Расчет касательной углом друг к точке вдоль траектории (рис. 4), И вычислить θ S> в формуле. 1 путем усреднения косинус угла разница для каждой пары точек, разделенных пути длиной S (рис. 5). Найти сохранением длины для одного микротрубочек или группы микротрубочек путем установки θ S> к уравнению. 1, взвешивание отдельных точек данных в соответствие, число независимых значений соз θ с, которые используются для вычисления среднего.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Снимок из анализа скольжения показан на Рисунке 2. Оптимальная плотность микротрубочек составляет 1-10 микротрубочек на поле зрения; значительно большее количество приведет к ошибкам отслеживания, так как микротрубочки будут пересекаться друг с другом. График 11 траекторий микротрубочек из анализа скольжения на Рисунке 2 представлен на Рисунке 3. Типичные траектории имеют длину от 10 до 30 μm; в некоторых траекториях имеются разрывы в местах пересечения одной микротрубоч...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Постоянство измерений длины являются хорошей характеристикой механических свойств отдельных биополимеров. В этой статье мы описали метод измерения с сохранением длины микротрубочек. Как отмечалось во введении, этот метод легко распространить на изучение механических свойств микротрубочек в различных условиях просто путем изменения реагентов, температуры и вязкости в заключительном этапе анализа скольжения, 3,9, или путем полимеризации микротрубочек, шаг 1,1, в различных условиях.

Сама методи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы благодарим Мелисса Klocke за помощь подготовке Рисунок 1 и Анна Ratliff для демонстрации протокол. Эта работа была поддержана Research Corporation по науке улучшению.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты
imidazoleSigma-AldrichI2399
хлорид калияSigma-AldrichP9541
хлорид магнияSigma-AldrichM8266
EGTASigma-AldrichE3889
BSACalbiochem126615
биотинилированный BSAThermo Scientific29130
α-казеинSigma-AldrichC6780
стрептавидинThermo Scientific21125
дитиотрейтолSigma-AldrichD0632
паклитакселLC LaboratoriesP-9600
глюкозооксидазаSigma-AldrichG2133
каталазаSigma-AldrichC100
глюкозаSigma-AldrichG8270
АТФSigma-AldrichA2383
2-mercapt– танолSigma-AldrichM3148Токсичный. Покупайте небольшое количество.
24X60 мм No1 1/2 покровное стеклоVWR48393-252
22X22 мм No1 покровное стекло GoldSeal3306
Высоковакуумная смазкаDow-CorningNA
Equipment
Микроскоп TIRFmanyNAМикроскоп TIRF, использованный в этом методе, был самодельным.
IDL (программное обеспечение)ExelisNAМожет заменить MATLAB, ImageJ или другое программное обеспечение для анализа изображений.

Ссылки

  1. Hawkins, T., Mirigian, M., Selcuk Yasar, M., Ross, J. L. Mechanics of microtubules. Journal of biomechanics. 43, 23-30 (2010).
  2. Pampaloni, F., et al. Thermal fluctuations of grafted microtubules provide evidence of a length-dependent persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U S A. 103, 10248-10253 (2006).
  3. Taute, K. M., Pampaloni, F., Frey, E., Florin, E. L. Microtubule dynamics depart from the wormlike chain model. Physical review letters. 100, 028102(2008).
  4. Van den Heuvel, M. G., de Graaff, M. P., Dekker, C. Microtubule curvatures under perpendicular electric forces reveal a low persistence length. Proceedings of the national academy of sciences U.S.A. 105, 7941-7946 (2008).
  5. Gittes, F., Mickey, B., Nettleton, J., Howard, J. Flexural rigidity of microtubules and actin filaments measured from thermal fluctuations in shape. Journal of cell biology. 120, 923-934 (1993).
  6. Brangwynne, C. P., et al. Bending dynamics of fluctuating biopolymers probed by automated high-resolution filament tracking. Biophysical journal. 93, 346-359 (2007).
  7. Cassimeris, L., Gard, D., Tran, P. T., Erickson, H. P. XMAP215 is a long thin molecule that does not increase microtubule stiffness. Journal of cell science. 114, 3025-3033 (2001).
  8. Valdman, D., Atzberger, P. J., Yu, D., Kuei, S., Valentine, M. T. Spectral analysis methods for the robust measurement of the flexural rigidity of biopolymers. Biophysical. 102, 1144-1153 (2012).
  9. van Mameren, J., Vermeulen, K. C., Gittes, F., Schmidt, C. F. Leveraging single protein polymers to measure flexural rigidity. Journal of physical chemistry b. 113, 3837-3844 (2009).
  10. Hua, W., Chung, J., Gelles, J. Distinguishing inchworm and hand-over-hand processive kinesin movement by neck rotation measurements. Science. 295, 844-848 (2002).
  11. Duke, T., Holy, T. E., Leibler, S. "Gliding assays" for motor proteins: A theoretical analysis. Physical review letters. 74, 330-333 (1995).
  12. Mehrbod, M., Mofrad, M. R. On the significance of microtubule flexural behavior in cytoskeletal mechanics. PLoS one. 6, e25627(2011).
  13. Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Kelley, M. W., Chadwick, R. S. Cytoskeletal changes in actin and microtubules underlie the developing surface mechanical properties of sensory and supporting cells in the mouse cochlea. Development. 139, 2187-2197 (2012).
  14. Gal, N., Weihs, D. Intracellular Mechanics and Activity of Breast Cancer Cells Correlate with Metastatic Potential. Cell biochemistry and biophysics. , (2012).
  15. Volokh, K. Y. On tensegrity in cell mechanics. Mol. Cell Biomech. 8, 195-214 (2011).
  16. Kasas, S., Dietler, G. Techniques for measuring microtubule stiffness. Current nanoscience. 3, 85-96 (2007).
  17. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical journal. 90, 1687-1696 (2006).
  18. Venier, P., Maggs, A. C., Carlier, M. F., Pantaloni, D. Analysis of microtubule rigidity using hydrodynamic flow and thermal fluctuations. Journal of biological chemistry. 269, 13353-13360 (1994).
  19. van den Heuvel, M. G., Bolhuis, S., Dekker, C. Persistence length measurements from stochastic single-microtubule trajectories. Nano letters. 7, 3138-3144 (2007).
  20. Phillips, R., Kondev, J., Theriot, J. Physical biology of the cell. , Garland Science. (2008).
  21. Berliner, E., Young, E. C., Anderson, K., Mahtani, H. K., Gelles, J. Failure of a single-headed kinesin to track parallel to microtubule protofilaments. Nature. 373, 718-721 (1995).
  22. Anderson, E. K., Martin, D. S. A fluorescent GTP analog as a specific, high-precision label of microtubules. Biotechniques. 51, 43-48 (2011).
  23. Hyman, A. Preparation of modified tubulins. Methods in enzymology. 196, 478-485 (1991).
  24. Lee, I. Curve reconstruction from unorganized points. Computer aded geometric design. 17, 161-177 (2000).
  25. Yildiz, A. Myosin V walks hand-over-hand: Single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
  26. Friedman, L. J., Chung, J., Gelles, J. Viewing dynamic assembly of molecular complexes by multi-wavelength single-molecule fluorescence. Biophysical. 91, 1023-1031 (2006).
  27. Smith, C. S., Joseph, N., Rieger, B., Lidke, K. A. Fast, single-molecule localization that achieves theoretically minimum uncertainty. Nature Methods. 7, 373-375 (2010).
  28. Nitzsche, B., Ruhnow, F., Diez, S. Quantum-dot-assisted characterization of microtubule rotations during cargo transport. Nature. 3, 552-556 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

IDL
Жесткость на изгиб измерений биополимеров Использование Gliding Анализы
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.