Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Мы демонстрируют использование простого Микрожидкостных установки, в которых один перспективных дрожжевых клеток можно проследить на протяжении всей своей жизни. Микрофлюидный чип использует размер разницы между матерью и дочерью клетки с использованием массива micropads. После загрузки, клетки в ловушке под этими micropads, поскольку расстояние между MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). После процедуры загрузки, культуры среда непрерывно пропускают через чип, который не только создает постоянный и определенной среде на протяжении всего эксперимента, но и вымывает новые дочерние клетки, которые не сохраняются под колодки из-за их меньшего размера. Установка сохраняет материнских клеток настолько эффективно, что в одном эксперименте до 50 отдельных клеток можно контролировать в полностью автоматическом режиме в течение 5 дней или, если необходимо, дольше. Кроме того, отличные оптические свойства микросхемы обеспечивают высокуюРазрешающая способность клеток в течение всего процесса старения.
Введение
Почкующихся дрожжей является важной моделью для организма старение исследования 1. До недавнего времени изучение репликативного старения в клетках дрожжей не было трудоемкий процесс, требующий вскрытия методом, в котором каждая почка не удалены вручную из материнской клетки 2,3. Чтобы решить эту проблему, мы недавно представили новую установку микрожидкостной возможность отслеживать отдельные клетки матери на протяжении всей своей жизни 4.
В нашем микрофлюидный чип, дрожжевые клетки оказались в ловушке под мягкие на основе эластомеров micropads (см. Рисунок 1). Непрерывный поток среднего смывает новообразованных дочерних клеток и обеспечивает клетки со свежими питательные вещества. В одном эксперименте, до 50 материнские клетки можно наблюдать в полностью автоматическом режиме на протяжении всего их репликативной продолжительности жизни. В связи с превосходными оптическими свойствами микрофлюидного чипа, можно одновременно контролировать различные аспекты биологии клетки дрожжей (например, с помощью флуоресцентных белков).
По сравнению с классическим методом вскрытия, микрожидкостной установки обеспечивает существенные преимущества. Это обеспечивает определенную и постоянную среду в течение всего эксперимента старения. Она не требует дорогого специализированного оборудования и может быть запущен на любой микроскоп оснащен автоматизированной фокус и покадровой способностей, а также контроля температуры для выращивания клеток. Производства и эксплуатации микрожидкостных чипов можно узнать в течение нескольких дней. Кроме того, клетки могут быть непосредственно загружены с экспоненциально растущей культуры, преимущество над другими недавно опубликованных Микрожидкостных методу 5, который требует биотинилирования материнских клеток. В сочетании с высоким разрешением, описанные здесь способ может быть использован для измерения постепенных изменений в клеточной морфологии, экспрессии белка и локализация во время старения дрожжей беспрецедентным образом. Способность кдолгосрочный мониторинг отдельных клеток также предоставляет уникальные возможности для исследования дрожжей клеточного цикла.
Этот метод в последнее время были оптимизированы, чтобы удалить биотинилированием из протокола 16, который был опубликован в то время как эта рукопись была в обзоре.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Производства и изготовления пресс-формы кремниевых пластин
Микрофлюидных чипы создаются из формы кремниевой пластины производства мягкой литографии. Эти пластины могут быть использованы многократно производить микрожидкостных чипов. Желательно, чтобы производство соответствующих пластин осуществляется группа, специализирующаяся на микрофлюидики 6.
Пластина выполнена в двухступенчатом процессе фотолитографии с использованием двух различных слоев негативного фоторезиста SU-8 7. Нижний слой используется для генерации области ячейки захвата (SU-8 2002; высота 3-4 мкм), тогда как каналы выполнены с верхним слоем (SU-8 2010, высота 10 мкм). Впечатление от процесса производства пластин можно найти в Хуанг и др. 8. Чертежи микрожидкостных чипов может быть получена из авторов, а также советы о том, как получить соответствующие пластины.
- Как только пластина получается, вырезать один кусок Tough-тегов десятичногоо тонкие полоски около 0,5 мм 3 мм скальпелем и поместить их тщательно на пластине немного сверху на структуру канала между входным каналам и MicroPad массив (рис. 2А). Это приведет к образованию большого дополнительного канала в каждый чип, который не будет использован только во время нагрузки сотовой ячейки, но также важно для стабильной работы микрофлюидного устройства.
- Обложка блюдо Петри стекло с двойным слоем из алюминиевой фольги и поставить пластину в чашке Петри. Алюминиевой фольги предотвратит PDMS от бега между пластины и чашки Петри. Если PDMS делает ползают между пластин и стеклянном блюде Петри, пластина станет постоянно закреплен в чашке Петри. Хотя пластины по-прежнему полезной, это не будет возможно заменить стеклянную чашку Петри в случае его поломки и PDMS должны быть вырезаны впоследствии.
2. Производство микрожидкостных чипов
- Поставьте пустую пластиковуючашку на баланс и тарирования. Залить 40 г PDMS базы в пластиковый стаканчик (на 12 см в диаметре стеклянном блюде Петри). Добавить PDMS отвердителя с пипеткой в AW / W соотношении 1:10, т.е. около 4 мл.
- Смешайте PDMS и отвердитель тщательно в течение нескольких минут. Это может быть сделано с одноразовой пластиковой пипетки, которая использовалась для пипетки отверждающего агента. Важно, чтобы смесь хорошо перемешивают до заливки его в верхней части пластины. Плохое смешивание может привести части PDMS не для полимеризации.
- Налейте PDMS на верхней части пластины в стеклянную чашку Петри.
- Смешивание PDMS с отвердителя приведет к образованию пузырьков воздуха в смеси PDMS. Эти пузырьки должны быть удалены перед PDMS полимеризуется. PDMS можно дегазировать после заливки его в верхней части пластины, поместив чашку Петри в эксикаторе соединен с вакуумным насосом. С помощью этой установки, она занимает около 30 минут, чтобы удалить все пузырьки из смеси.
- Полимеризуйте йэлектронной PDMS путем размещения чашки Петри с пластины в верхней части горячей плите при 120 ° С в течение 1 ч и затем при 65 ° С в течение еще одного часа.
- Удалите алюминиевую фольгу вместе с пластины и полимерные PDMS от стеклянном блюде Петри. Снимают с алюминиевой фольгой и тонкий остаточный слой полимеризованного PDMS от задней пластины. Слоем PDMS на верхней части пластины могут быть отделены от подложки, подняв ее тщательно.
- Поместите слой PDMS с ног на голову (с каналами вверх) на скамейке и вырезать одну конструкции чипа запечатленный на PDMS тщательно с помощью скальпеля. Попытка сохранить около 3 мм PDMS вокруг краев каналов для улучшения крепления кристалла к покровным стеклом позже.
- Удар отверстия в PDMS на концах вход, выход и боковой канал (Фиг.2А), нажимая на 20 калибра Luer заглушки все путем PDMS в прямой форме.
Убедитесь, что чип PDMSдо сих пор лежит вверх ногами на скамейке в то время как пробивая отверстия. Это предотвращает PDMS от прилипания к внутренней поверхности канала, что может привести к закупорке канала.
- После штамповки каждое отверстие, снимите колонку PDMS в Luer заглушки с помощью пинцета перед тем как вынуть заглушку снова. Колонка PDMS могли бы остаться и блокировать точно пробил дыру.
- Очистить поверхности кристалла от частиц пыли и остаточной PDMS путем размещения скотча на нем и немедленно удаления ленты снова. Аналогичным образом очистить покровного стекла, к которому чип будет прикреплен.
- Положите очищенный чипа и покровного стекла под УФ лампой UV-Настольная Озон чище. Сторон, которые должны быть соединены друг с другом должны быть готовы к лампе.
- Проэкспонируйте PDMS и покрывают стеклом с ультрафиолетовым светом в течение 6-8 мин и непосредственно после этого положить чип на покровное стекло путем размещения открытых поверхностей друг на друга.
- Аккуратно нажмите вокруг сторон чипасодействовать крепления PDMS с покровным стеклом и для удаления пузырьков воздуха. Не нажимайте на верхнюю границу канала структуры как это может привести к micropads привязываться к покровного стекла, а также.
- Поместите новоиспеченных микрожидкостной установки на горячей плите при температуре 100 ° С в течение 60 мин. Испытание прочности сцепления между стеклом и PDMS чип, пытаясь поднять краев чип PDMS незначительно. Когда блок PDMS не может быть поднят с поверхности стекла, связующий успешна и чип готов к использованию.
3. Подготовка чип для сотовых загрузка
Отказ микрофлюидном устройство может потенциально привести к утечке среды в микроскопе. Чтобы избежать этого, это консультативный использовать держатель металла и / или уплотнение стороны чипа, где PDMS отвечает стекло с лаком для ногтей или эпоксидный клей. Это предотвращает утечку среды в случае чипа PDMS не связана достаточно хорошо, чтобы покровного стекла. Кроме того, трубкасоединения могут быть закреплены вокруг точки вставки таким же образом, чтобы избежать утечки среды. Самодельные воды датчик, который отключает шприцевой насос в случае утечки может быть использован в качестве дополнительной меры предосторожности безопасности. Чертежи металлический держатель специально разработан для микрофлюидного чипа можно получить у авторов.
- Поместите микрофлюидный чип в металлический держатель, с силиконовым гелем между стеклом микросхемы и металлические части корпусов, создавая водонепроницаемую печать. Винт орехи осторожно, чтобы не разбить стекло.
- Соединение тонких трубок (около 5-15 см в длину) с каналом стороне и выпускной канал микросхемы. Использование пинцета легче вставить трубки в перфорированных отверстий.
- Наполните 50 мл Luer-Lok шприц с культуральной средой, удалить воздух из шприца и подключить его последовательно шприцевой фильтр 20 калибра Luer заглушки, короткая толстая трубка (около 2 см) и тонкую трубку. Убедитесь в том, что тонкий ваннойе достаточно долго, чтобы охватить расстояние между насосом шприц и столик микроскопа.
- Поместите шприц в шприцевой насос, быстрая перемотка вперед насос, пока тонкая трубка полностью заполнен средой.
- Нажмите на тонкую трубку, соединенную со шприцем во впускной канал чип и пусть потока среды через чип при 10 мкл / мин (фиг. 2В). Сбор среды оставляя микросхемы (например, в чашке Петри). Средне будет работать через боковые канала из-за сопротивления разница между Tough-тегов сделал большой канал стороны и выпускных каналов.
- Поместите чип столик микроскопа и установить фокус микроскопа на площадках.
Использование целей иммерсионным предпочтительнее, чем, что цели погружения в воду, потому что нефть не будет высыхать за время-ходом эксперимента.
В зависимости от микроскопа возможны проблемы с сохранением Fсфокусироваться вначале в течение первых часов эксперимента. Поэтому целесообразно оставить чип для 1:59 часов в столике микроскопа, чтобы он мог успокоиться перед загрузкой клетки и началом эксперимента.
4. Загрузка дрожжевых клеток в микрофлюидный чип
- Подключите 5 мл Luer наконечник шприца 20 калибра Luer заглушки и толстая трубка (около 3 см).
- Возьмите образец культуры клеток должны быть загружены в чипе.
Предпочтительным клеток для погрузки составляет от 1-5 х 10 6 клеток на мл. Культуры с более высокими отсчетами клетки должны быть разбавлены перед загрузкой. При культивировании клеток на YPD, эффективность нагрузки сотовой ячейки могут быть улучшены во много раз, если клетки сначала промывали и ресуспендировали в минимальной среде, содержащей такой же процент глюкозы перед загрузкой. Во время работы чипа, YPD среде может снова быть безопасно использованы.
- Загрузка примерно 1 мл клеточной суспензии в йШприц е и удалить весь воздух из шприца.
- Снижение скорости потока шприцевой насос до 0,5 мкл / мин. Низкий и непрерывный поток в жизнь шприцевой насос во время загрузки (на этапе 4.5) будет толкать непривязанными клетки через боковые канал (фиг.2С).
- Соединение шприц, содержащий суспензию клеток к трубке выпускного канала. Загрузите клетки нажатием на поршень шприца аккуратно. Соблюдайте клетки, входящие и урегулирования под micropads через глазные или через экран компьютера.
- Поддерживайте давление на поршень, пока клетки не достаточное поселиться под колодки. Оптимальная нагрузка составляет 1-3 клеток на площадку. Как решить клеток под колодки случайно, это довольно часто, что несколько колодки не содержат клетки и другие колодки полностью заполнены клетками.
- Отсоедините шприц, используемые для загрузки клеток и толстые трубки подключены к нему из тонких труб из выпускного канала, промойте стороне СНAnnel в течение нескольких минут при более высокие скорости потока (10 мкл / мин), чтобы удалить пузырьки воздуха и / или клеток, которые еще не выход чипа (фиг. 2В). Если клетки не удаляются из бокового канала, они могут начать расти в боковой канал и вмешиваться в эксперименте позже.
- Поместите потока шприцевой насос обратно до 0,5 мкл / мин и закрытия боковой канал с подключением к толстой трубки (около 5 см), содержащей катетер штекер на конце (фиг. 2D).
- Увеличение потока до конечной скорости потока 1-5 мкл / мин. Расход может изменяться в зависимости от среды и штамма дрожжей.
- Начало фильма с микроскопом и параметров камеры пригодны для целей эксперимента. Убедитесь, что скорость столик микроскопа установлен на такой низкой скоростью, что масло может следовать. Для определения репликативной продолжительности жизни, изображение клетки каждые 10 мин. Чтобы защитить клетки от незначительных количеств УФ-света, излучаемого галогеннойлампа, которая используется во время DIC приобретение, целесообразно поместить дополнительный ультрафиолетовый фильтр на пути прохождения света. Когда с помощью флуоресцентной микроскопии, предпочтительно, чтобы изображение клетки реже (например, каждые 20 минут), чтобы избежать фототоксические эффекты. Эксперимент заканчивается, когда все клетки, нагруженные в начале эксперимента мертвы, который при нормальных условиях занимает до 5 дней. Рекомендуется регулярно проверять фокусировку изображения во время эксперимента и при необходимости отрегулируйте его.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В этом протоколе, клетки загружаются в микрофлюидный чип непосредственно из середины экспоненциальной культуры. Чтобы выяснить, является ли возрастное распределение клеток в ловушке микрофлюидный чип похож на культуры перед погрузкой, клетки окрашивали пшеницу агглютинина конъюгированных с FITC (WGA-FITC) для визуализации бутон шрамы. Как можно видеть на фигуре 3, захват клеток при micropads из микрофлюидного чипа не смещен к клеткам определенного возраста.
...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Микрожидкостных метод, описанный здесь является важным инструментом романа в исследовании старения, поскольку позволяет простой и автоматизированной генерации дрожжей репликативное данные продолжительности жизни в сочетании с непрерывным высоким разрешением. Эти атрибуты являются значительные достижения на протяжении экспериментальные возможности классического метода вскрытия, но есть несколько ограничений метода, которые должны быть приняты во внимание.
Обратите внимание, что продолжительно...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить Лору Schippers для написания первой версии протокола нагрузки сотовой ячейки и Маркус де Goffau и Guille Zampar тестов митохондриальной морфологии.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| DC Sylgard 184 elastomer | Mavom bv | 1060040 | Эта упаковка содержит основу PDMS и отвердитель PDMS. |
| Стеклянные чашки Петри 120/20 мм | VWR International | 391-2850 | |
| Крышки стаканы 22x40 мм | CBN Labsuppliers BV | 190002240 | |
| Tough-Tags | Sigma-Aldrich | Z359106 | |
| Алюминиевая фольга | |||
| Пластиковый одноразовый стаканчик | |||
| Серологическая пипетка 5 мл | VWR International | 612-1245 | |
| Скотч | VWR International | 819-1460 | |
| Паста Байсилон (силиконы GE Bayer) | Sigma-Aldrich | 85403-1EA | |
| Трубка микроотверстия из ПТФЭ, 0,012"ID x 0,030"OD | Cole Parmer | EW-06417-11 | Упоминается как тонкая трубка |
| Tygon микротрубка, 0,030"ID x 0,090"OD | Cole Parmer | EW-06418-03 | Обозначается как толстая трубка |
| Скальпель | VWR International | 233-5334 | |
| 50 мл Люер-Лок шприцы | BD | 300137 | |
| 5 мл шприцы, наконечник Люэра | VWR International | 613-1599 | |
| Пинцет | VWR International | 232-2132 | |
| 20 калибр Луэр корешки | Instech Solomon | LS20 | |
| Шприцевые фильтры (размер пор 0,20 мкм; m) | Sigma-Aldrich | 16534K | |
| Заглушка для катетера из нержавеющей стали, 20 ga x12 мм | Instech Solomon | SP20/12 | |
| чашки Петри | VWR International | 391-0892 | |
| EQUIPMENTНастольный | |||
| УФ-озоновый очиститель | NOVA Scan | PSD-UVT | |
| Harvard Pump 11 Elite | Harvard Apparatus | 70-4505 | |
| Силиконовая мастер-форма (вафля) | Самодельная; Для получения подробной информации свяжитесь с автором-корреспондентом | ||
| Balance | Sartorius corporation | ED4202S | |
| Вакуумный насос | KNF Neuberger | N022 AN.18 | |
| Desiccator | VWR International | 467-2115 | |
| Нагревательная плита | VWR International | 460-3267 | |
| Опционально: Металлический держатель для защитного стекла (22x40 мм) | Самостоятельные; За подробностями обращайтесь к автору ( | ||
| флуоресцентный) микроскоп с 60-кратным объективом, автофокусом, возможностями покадровой съемки и, желательно, автоматизированным (моторизованным XY-управлением) столиком | Nikon | Eclipse Ti-E |
Ссылки
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
- Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. J. Vis. Exp. (28), e1209(2009).
- Lee, S. S., Avalos Vizcarra, I., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. , (2012).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
- Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
- Huang, Y., Agrawal, B., Clark, P. A., Williams, J. C., Kuo, J. S. Evaluation of cancer stem cell migration using compartmentalizing microfluidic devices and live cell imaging. J. Vis. Exp. (58), e3297(2011).
- Kaeberlein, M., Kirkland, K. T., Fields, S., Kennedy, B. K. Genes determining yeast replicative life span in a long-lived genetic background. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (4), 491-504 (2005).
- Scheckhuber, C. Q., et al. Reducing mitochondrial fission results in increased life span and fitness of two fungal ageing models. Nat. Cell Biol. 9 (1), 99-105 (2007).
- Defossez, P. A., et al. Elimination of replication block protein Fob1 extends the life span of yeast mother cells. Mol. Cell. 3 (4), 447-455 (1999).
- Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. The SIR2/3/4 complex and SIR2 alone promote longevity in Saccharomyces cerevisiae by two different mechanisms. Genes Dev. 13 (19), 2570-2580 (1999).
- Shcheprova, Z., Baldi, S., Frei, S. B., Gonnet, G., Barral, Y. A mechanism for asymmetric segregation of age during yeast budding. Nature. 454 (7205), 728-734 (2008).
- Vanoni, M., Vai, M., Popolo, L., Alberghina, L. Structural heterogeneity in populations of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 156 (3), 1282-1291 (1983).
- Huh, W. K., et al. Global analysis of protein localization in budding yeast. Nature. 425 (6959), 686-691 (2003).
- Zhang, Y., Luo, C., Zou, K., Xie, Z., Brandman, O., Ouyang, Q., Li, H. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
