Method Article

Непрерывная высокого разрешения Микроскопическое исследование репликативного старения у почкующихся дрожжей

DOI:

10.3791/50143

⸱

August 20th, 2013

 ,  ,  ,  , 
1Molecular Systems Biology, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, University of Groningen, 2Department for the Biology of Ageing, European Research Institute for the Biology of Ageing, University Medical Centre Groningen, University of Groningen, 3Institute of Biochemistry, ETH Zurich, 4Department of Health Sciences and Technology, ETH Zurich, 5Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы опишем работу микрофлюидном устройство, которое позволяет непрерывно и с высоким разрешением микроскопическое изображение одного перспективных дрожжевых клеток во время их полного репликативной и / или хронологической продолжительности жизни.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируют использование простого Микрожидкостных установки, в которых один перспективных дрожжевых клеток можно проследить на протяжении всей своей жизни. Микрофлюидный чип использует размер разницы между матерью и дочерью клетки с использованием массива micropads. После загрузки, клетки в ловушке под этими micropads, поскольку расстояние между MicroPad и покровным стеклом похожа на диаметр дрожжевой клетки (3-4 мкм). После процедуры загрузки, культуры среда непрерывно пропускают через чип, который не только создает постоянный и определенной среде на протяжении всего эксперимента, но и вымывает новые дочерние клетки, которые не сохраняются под колодки из-за их меньшего размера. Установка сохраняет материнских клеток настолько эффективно, что в одном эксперименте до 50 отдельных клеток можно контролировать в полностью автоматическом режиме в течение 5 дней или, если необходимо, дольше. Кроме того, отличные оптические свойства микросхемы обеспечивают высокуюРазрешающая способность клеток в течение всего процесса старения.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почкующихся дрожжей является важной моделью для организма старение исследования 1. До недавнего времени изучение репликативного старения в клетках дрожжей не было трудоемкий процесс, требующий вскрытия методом, в котором каждая почка не удалены вручную из материнской клетки 2,3. Чтобы решить эту проблему, мы недавно представили новую установку микрожидкостной возможность отслеживать отдельные клетки матери на протяжении всей своей жизни 4.

В нашем микрофлюидный чип, дрожжевые клетки оказались в ловушке под мягкие на основе эластомеров micropads (см. Рисунок 1). Непрерывный поток среднего с....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Производства и изготовления пресс-формы кремниевых пластин

Микрофлюидных чипы создаются из формы кремниевой пластины производства мягкой литографии. Эти пластины могут быть использованы многократно производить микрожидкостных чипов. Желательно, чтобы производство соответствующих пластин осуществляется группа, специализирующаяся на микрофлюидики 6.

Пластина выполнена в двухступенчатом процессе фотолитографии с использованием двух различных слоев негативного фоторезиста SU-8 7. Нижний слой используется для генерации области ячейки захвата (SU-8 2002; высота 3-4 мкм), тогда как каналы выпол....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе, клетки загружаются в микрофлюидный чип непосредственно из середины экспоненциальной культуры. Чтобы выяснить, является ли возрастное распределение клеток в ловушке микрофлюидный чип похож на культуры перед погрузкой, клетки окрашивали пшеницу агглютинина конъюгированных с FITC (WGA-FITC) для визуализации бутон шрамы. Как можно видеть на фигуре 3, захват клеток при micropads из микрофлюидного чипа не смещен к клеткам определенного возраста.

.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микрожидкостных метод, описанный здесь является важным инструментом романа в исследовании старения, поскольку позволяет простой и автоматизированной генерации дрожжей репликативное данные продолжительности жизни в сочетании с непрерывным высоким разрешением. Эти атрибуты являются значительные достижения на протяжении экспериментальные возможности классического метода вскрытия, но есть несколько ограничений метода, которые должны быть приняты во внимание.

Обратите внимание, что продолжительно.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Лору Schippers для написания первой версии протокола нагрузки сотовой ячейки и Маркус де Goffau и Guille Zampar тестов митохондриальной морфологии.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
DC Sylgard 184 elastomer Mavom bv1060040Эта упаковка содержит основу PDMS и отвердитель PDMS.
Стеклянные чашки Петри 120/20 мм VWR International391-2850
Крышки стаканы 22x40 мм CBN Labsuppliers BV190002240
Tough-Tags Sigma-AldrichZ359106
Алюминиевая фольга
Пластиковый одноразовый стаканчик
Серологическая пипетка 5 мл VWR International612-1245
Скотч VWR International819-1460
Паста Байсилон (силиконы GE Bayer) Sigma-Aldrich85403-1EA
Трубка микроотверстия из ПТФЭ, 0,012"ID x 0,030"OD Cole ParmerEW-06417-11Упоминается как тонкая трубка
Tygon микротрубка, 0,030"ID x 0,090"OD Cole ParmerEW-06418-03Обозначается как толстая трубка
Скальпель VWR International233-5334
50 мл Люер-Лок шприцы BD300137
5 мл шприцы, наконечник Люэра VWR International613-1599
Пинцет VWR International232-2132
20 калибр Луэр корешки Instech SolomonLS20
Шприцевые фильтры (размер пор 0,20 мкм; m) Sigma-Aldrich16534K
Заглушка для катетера из нержавеющей стали, 20 ga x12 мм Instech SolomonSP20/12
чашки Петри VWR International391-0892
EQUIPMENTНастольный
УФ-озоновый очиститель NOVA ScanPSD-UVT
Harvard Pump 11 Elite Harvard Apparatus70-4505
Силиконовая мастер-форма (вафля) Самодельная; Для получения подробной информации свяжитесь с автором-корреспондентом
Balance Sartorius corporationED4202S
Вакуумный насос KNF NeubergerN022 AN.18
Desiccator VWR International467-2115
Нагревательная плита VWR International460-3267
Опционально: Металлический держатель для защитного стекла (22x40 мм) Самостоятельные; За подробностями обращайтесь к автору (
флуоресцентный) микроскоп с 60-кратным объективом, автофокусом, возможностями покадровой съемки и, желательно, автоматизированным (моторизованным XY-управлением) столиком NikonEclipse Ti-E
SU-8

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaeberlein, M., McVey, M., Guarente, L. Using yeast to discover the fountain of youth. Sci. Aging Knowledge Environ. 2001 (1), pe1(2001).
  2. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  3. Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Budding Yeast AgingMicrofluidic ChipYeast Cell TrackingReplicative LifespanContinuous MicroscopyMother Daughter SeparationPDMS Chip FabricationFluorescence MicroscopyMitochondrial MorphologyLifespan Curve Analysis

Related Articles