Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и записи Kv канала в мышиной предсердий и желудочков кардиомиоцитов

12.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50145

⸱

12 марта 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental and Clinical Research Center (ECRC), Charité Medical Faculty and Max-Delbrück Center for Molecular Medicine (MDC), 2Medical Department, Division of Cardiology, Campus Virchow-Klinikum, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Medical Department, Division of Cardiology and Angiology, Campus Mitte, Charité - Universitätsmedizin Berlin

В этой статье

Краткое содержание

Kv канала дисфункции связаны с нарушениями ритма сердца. С целью изучения молекулярных механизмов, которые приводят к таким аритмии мы используем систематическое протокол для изоляции предсердий и желудочков кардиомиоциты от Kv канала мышей вспомогательные подразделения нокаутом. Изолированные кардиомиоциты могут быть немедленно использованы для сотовых электрофизиологических исследований, биохимических или иммунофлюоресценции (ИФ) анализы.

Аннотация

KCNE гены кодируют для небольшой семьи из Kv канала вспомогательные подразделения, которые образуют комплексы с гетеромерных Kv канала альфа-субъединицы для изменения их функциональных свойств. Мутации в генах KCNE были обнаружены у пациентов с сердечной аритмии, такие как синдром удлиненного QT и / или фибрилляции предсердий. Тем не менее, точные молекулярные патофизиологии, что приводит к таким заболеваниям остается неуловимым. В предыдущих исследованиях электрофизиологических свойств болезнетворные мутации в этих генах в основном были изучены в гетерологичных системы экспрессии и мы не можем быть уверены, что если сообщила эффекты могут быть непосредственно переведены на родной кардиомиоцитов. В нашей лаборатории, мы используем другой подход. Мы непосредственно изучить влияние делеции гена KCNE в изолированных кардиомиоцитов из нокаутных мышей сотовой электрофизиологии - уникальный метод, который мы опишем в этом номере журнала Визуализированные эксперименты. Сердца от генетикаLLY инженерии мышей KCNE быстро вырезали и установлен на аппарате Лангендорфа путем катетеризации аорты. Бесплатные Ca 2 + в миокарде связана EGTA, и диссоциации кардиомиоцитов затем достигается ретроградной перфузии коронарных артерий со специализированным низким Ca 2 + буфер, содержащий коллагеназы. Atria, бесплатно стенки правого желудочка и левого желудочка могут быть отделены друг от микрохирургической техники. Кальций затем медленно добавляют обратно в изолированном кардиомиоцитов в нескольких шаг содержащие процедуры промывки. Предсердий и желудочков кардиомиоцитов здоровый вид, не спонтанное схватки сразу же подвергается анализу электрофизиологических патчем техника зажима или других биохимических анализов в течение первых 6 часов после изоляции.

Протокол

1. Анестезии животных и изъятия органов

  1. Анестезию мыши, внутрибрюшинно (IP) инъекции кетамина (200 мг / кг массы тела) и Ксилазин (20 мг / кг массы тела).
  2. Чтобы противодействовать свертыванию вводят 250 МЕ гепарина IP, чтобы избежать свертывания крови и образованию тромбов.
  3. Подождите, пока глубокий наркоз будет достигнуто, которая характеризуется арефлексия. Чтобы проверить, арефлексия, тест роговичного рефлекса, осторожно касаясь роговицы или рефлекс испытательный полет хвостом щипать.
  4. Передача мыши на операционный стол и зафиксируйте его в положении лежа на спине.
  5. Надрезать кожу и брюшной стенки ниже мечевидного и выполнять раскладушка торакотомии: Расширить разрез с обеих сторон вдоль реберной дуги, а затем разрезать ребра в средней подмышечной линии, отклоняются вверх грудную клетку.
  6. Откройте перикарда, найдите крупных сосудов. Мягко нажмите сердце хвостового для лучшего отображения аорты. Зажмите аорты с помощью пинцета.
  7. Поместите сердце в вогнутость паре с cissors и анализировать все сообщающиеся сосуды с одного разреза. Убедитесь в том, чтобы сохранить достаточно большой части восходящей аорты для катетеризации Лангендорфа.
  8. Передача вырезали сердце сразу в чашку Петри заполнены холодный лед и предварительное решение оксигенированного 1 (для решений, см. таблицу 1).

2. Подготовка перфузии сердца и Лангендорфа

  1. Иглу аорты с 1.8F канюли стали. Убедитесь в том, чтобы избежать воздушной эмболии.
  2. Зафиксируйте аорты на канюлю с помощью хирургического шовного и флеш коронарных артерий с 1 мл раствора 1.
  3. Подключите канюля с аппаратом Лангендорфа.
  4. Убедитесь, что время от торакотомии к катетеризации Лангендорфа не превышает 120 секунд, чтобы избежать расширенного ишемии / реперфузии в миокарде.
  5. Заливать сердца с 10 мл Ca 2 + бесплатное решение 2 (4 мл / мин).
  6. Заливать сердце с раствором коллагеназы 3 по 8 мин (4 мл / мин).
ле "> 3. микрохирургические Диссоциация камер сердца

  1. Передача сердце в предварительно нагретой 100-мм чашки Петри, содержащие низкие Ca 2 + Решение 4.
  2. Осторожно снимите аорты и других не-сердечной ткани с помощью ножниц и выбросьте его.
  3. Отдельные предсердий и желудочков и продолжить каждую камеру отдельно. Держите клетки погружены в раствор 4. Использование небольших объемах (менее 5 мл).

4. Далее Диссоциация кардиомиоцитов

  1. Мерцательная кардиомиоцитов:
    1. Чтобы индивидуализировать кардиомиоцитов предсердий передачи предсердия в отдельную подогретого 100-мм культуры блюдо и отделить ткани через осторожно потянув ее на части с тонким пинцетом. Убедитесь, почти полной диссоциации ткани.
    2. Используйте 1 мл пипетки с увеличенной огневой полировкой пластиковые пипетки приостановить клеток в 1 мл раствора 5 на 5 мин.
    3. Отделить клетки от космического мусора с помощью мобильного фильтр (200 мкм размер ячейки).
    4. Добавить 5 мл раствора 5 к клеточной суспензии и центрифуги в течение 2 мин на 16 мкг при комнатной температуре.
    5. Следующие шаги выполняются под капот культуре клеток. Удалите супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл раствора 6.
    6. После осаждения под действием силы тяжести в течение 10 мин в 15 мл трубки, центрифугируют в течение 1 мин на 16 мкг при комнатной температуре. Удалить супернатант. Повторное приостановить клеток в зависимости от их количества в 1-5 мл раствора 6.
  2. Желудочковая кардиомиоцитов:
    1. Проанализируйте левого желудочка области интереса с тонким пинцетом в 5 мл раствора 4.
    2. Приостановить клетки, осторожно пипеткой, пока большая часть клеток разделены. Передача ячейки раствор после фильтрации (200 мкм размер ячейки) в 50 мл трубки, добавить объемом 25 мл.
    3. Центрифуга в течение 2 мин на 16 мкг при комнатной температуре.
    4. Следующие шаги выполняются под капот культуре клеток. Удалить супернатант, вновь приостановить гранул в 25 млРешение 6 и позволяют осаждения клеток в течение 10 мин.
    5. Подсчет клеток и удалить супернатант, добавить 25 - 50 мл раствора 6 на клетки.

5. Подготовка кардиомиоцитов для сотовых электрофизиологии, биохимической или, если исследования

  1. Для исследования электрофизиологии, держать миоцитов в растворе 6 в 50 мл трубки и препятствует седиментации.
  2. Для биохимических исследований, например, изображений кальция, пластины миоцитов на ламинине покрытием блюдо клеточной культуры (конечная концентрация 20 мкг / мл ламинина в PBS).
  3. Для иммунофлуоресцентного окрашивания готовить блюдо клеточной культуре пластины с отворотами стеклянной крышкой и покрытые ламинином решение (конечная концентрация 50 мкг / мл ламинина в PBS).
    1. Удалите раствор перед покрытием миоцитов. Пластина клеток и контролировать плотность клеток с помощью микроскопа.
    2. Пусть миоцитов придерживаться, чтобы покрыть скольжение в течение 1 часа при 37 ° С в 2% CO 2, удаления раствораи начать сразу со стандартным протоколом процедуры окрашивания.
    3. Инкубируйте с фиксатором, например, 4% PFA в PBS (рН 7,5) в течение 10 мин при комнатной температуре и последующей три стадии промывки PBS в течение 5 минут каждый.
    4. Для permeabilize клеток и подавлять неспецифическое связывание антитела инкубировать миоцитов с 10% сыворотки, 0,3% Triton, 0,2% BSA в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре.
    5. Инкубируйте с первичными антителами в течение 1 часа при температуре 37 ° C и мыть, как описано выше.
    6. Инкубируйте с вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Для контрастирующая окраска ядер и α-актинина использования DAPI и флуорохромом сопряженных фаллоидином (Alexa Fluor 488, Invitrogen).
    7. После промывки, передает стеклянной крышкой скользит внимательно на силан лечение микроскоп слайды и вставлять флуоресценции клеток в монтажную среду.

6. Сотовый электрофизиологии

  1. Выполните Цельноклеточная патч-зажим записи на частотеshly изолированных предсердий и желудочков кардиомиоцитов при комнатной температуре.
  2. Передача здорового появляться в кардиомиоциты перфузии камере, заполненной определенного объема внеклеточной решение ванну. 117 мм NaCl, 4 мМ KCl, 1 мМ KH 2 PO 4, 4 мМ NaHCO 3, 1,7 мМ MgCl 2, 3 мМ CoCl 2, 10 HEPES мм, 10 мм глюкозы и 0,02 мМ тетродотоксин (ТТХ), (рН 7,4) . Используйте NaOH для доведения рН значение.
  3. Используйте соответствующее оборудование зажим патч (т.е. IX71 инвертированный микроскоп, Multiclamp 700B Усилители, приобретение Digidata 1440A системы и ПК с программным обеспечением pClamp10.3 (Molecular Devices)).
  4. Используйте патч пипетки с сопротивлением 3-5 МОм при заполнении внутриклеточного раствора, содержащего 130 мМ KCl, 2 мМ MgCl 2, 11 мМ HEPES, 11 мм EGTA, 5 мМ Na 2 АТФ, 0,4 мМ Na 2 GTP, 5 мМ Na 2 CP и 4,9 мМ CaCl 2 (рН 7,2). Используйте KOH для регулирования рН значение.
  5. Вызывание наружу K + ток-дю-Кольцо 4,5-секунды шаги напряжения для проверки потенциалов между -60 и +50 мВ в 10-мв шагом от проведения потенциал -70 мВ после 20-мс предымпульса до -40 мВ.
  6. Убедитесь, что утечка тока всегда <100 мкА.
  7. Для вскрытия различных K + ток использовать специальные ингибиторы, такие как 4-аминопиридина (4-AP; ICN Biomedicals, Irvine, CA, USA), Heteropodatoxin 2 (HpTx2; Alomone) или тетраэтиламмония (TEA; Sigma). Исходные растворы должны быть подготовлены в внеклеточный раствор ванны, и применяются непосредственно к ближайшим и клетку через микронаконечником после "базового" записей. Уравновешивание должно быть разрешено в течение 2-3 мин до "наркотик" записей.
  8. Для анализа нормализации амплитуды тока в отдельных клетках, чтобы размер ячейки (все-клеточной мембраны емкость). Анализ данных в автономном режиме с помощью программного обеспечения pClamp10.3 (Molecular Devices) или сопоставимые программного обеспечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Выделение взрослых мышиных кардиомиоцитов из генетически модифицированных мышей для изучения функций генов конкретного интереса в пробирке стала мощным инструментом для дальнейшего понимания патофизиологии сердечной. Этот метод в настоящее время используется только небольшая, но растущее число основных научных лабораторий по всему миру. Тем не менее, изоляция взрослых кардиомиоцитов желудочков мышиной может быть сложно и должно быть сделано тщательно и многократно опытных руках. Рисунке 1 показ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

С ростом развития генно-инженерных мышей штаммов для изучения функции сердца и сердечной патологии, связанные с удалением гена есть также возрастающий интерес в специализированных методов для изучения последствий конкретных делеции гена в лабораторных условиях. В нашей лаборатории мы исследуем роль семьи Kv канала вспомогательные подразделения по сердечной реполяризации. KCNE гены составляют семьи из 5 генов (KCNE1-5), которые играют важную роль в человеческой желудочков и предсердий реполяриз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет грантов от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), Фриц Тиссен-и-Stiftung Charité / MDC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания
Тетродотоксин Alomone
4-аминопиридин ICN Biomedicals
Heteropodatoxin 2 Alomone
Тетраэтиламмония Sigma Chemicals
Коллагеназы типа 2 Worthington

Ссылки

  1. Abbott, G. W., Goldstein, S. A., Sesti, F. Do all voltage-gated potassium channels use MiRPs? Circ. Res. 88, 981-983 (2001).
  2. Abbott, G. W., Sesti, F., Splawski, I., Buck, M. E., Lehmann, M. H., Timothy, K. W., Keating, M. T., Goldstein, S. A. MiRP1 forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell. 97, 175-187 (1999).
  3. Barry, D. M., Trimmer, J. S., Merlie, J. P., Nerbonne, J. M. Differential expression of voltage-gated K+ channel subunits in adult rat heart. Relation to functional K+ channels? Circ. Res. 77, 361-369 (1995).
  4. Benjamin, E. J., Wolf, P. A., D'Agostino, R. B., Silbershatz, H., Kannel, W. B., Levy, D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation. 98, 946-952 (1998).
  5. Bou-Abboud, E., Nerbonne, J. M. Molecular correlates of the calcium-independent, depolarization-activated K+ currents in rat atrial myocytes. J. Physiol. 517 (Pt 2), 407-420 (1999).
  6. Gaborit, N., Steenman, M., Lamirault, G., Le, M. N., Le, B. S., Lande, G., Leger, J., Charpentier, F., Christ, T., Dobrev, D., Escande, D., Nattel, S., Demolombe, S. Human atrial ion channel and transporter subunit gene-expression remodeling associated with valvular heart disease and atrial fibrillation. Circulation. 112, 471-481 (2005).
  7. Guo, W., Xu, H., London, B., Nerbonne, J. M. Molecular basis of transient outward K+ current diversity in mouse ventricular myocytes. J. Physiol. 521 (Pt 3), 587-599 (1999).
  8. Lundby, A., Ravn, L. S., Svendsen, J. H., Hauns, S., Olesen, S. P., Schmitt, N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol. Biochem. 21, 47-54 (2008).
  9. Ma, K. J., Li, N., Teng, S. Y., Zhang, Y. H., Sun, Q., Gu, D. F., Pu, J. L. Modulation of KCNQ1 current by atrial fibrillation-associated KCNE4 (145E/D) gene polymorphism. Chin Med. J. (Engl.). 120, 150-154 (2007).
  10. McCrossan, Z. A., Abbott, G. W. The MinK-related peptides. Neuropharmacology. 47, 787-821 (2004).
  11. Pongs, O., Schwarz, J. R. Ancillary subunits associated with voltage-dependent K+ channels. Physiol. Rev. 90, 755-796 (2010).
  12. Ravn, L. S., Aizawa, Y., Pollevick, G. D., Hofman-Bang, J., Cordeiro, J. M., Dixen, U., Jensen, G., Wu, Y., Burashnikov, E., Haunso, S., Guerchicoff, A., Hu, D., Svendsen, J. H., Christiansen, M., Antzelevitch, C. Gain of function in IKs secondary to a mutation in KCNE5 associated with atrial fibrillation. Heart Rhythm. 5, 427-435 (2008).
  13. Ravn, L. S., Hofman-Bang, J., Dixen, U., Larsen, S. O., Jensen, G., Haunso, S., Svendsen, J. H., Christiansen, M. Relation of 97T polymorphism in KCNE5 to risk of atrial fibrillation. Am. J. Cardiol. 96, 405-407 (2005).
  14. Roepke, T. K., Abbott, G. W. Pharmacogenetics and cardiac ion channels. Vascul. Pharmacol. 44, 90-106 (2006).
  15. Roepke, T. K., Kontogeorgis, A., Ovanez, C., Xu, X., Young, J. B., Purtell, K., Goldstein, P. A., Christini, D. J., Peters, N. S., Akar, F. G., Gutstein, D. E., Lerner, D. J., Abbott, G. W. Targeted deletion of kcne2 impairs ventricular repolarization via disruption of I(K,slow1) and I(to,f). FASEB J. 22, 3648-3660 (2008).
  16. Sesti, F., Abbott, G. W., Wei, J., Murray, K. T., Saksena, S., Schwartz, P. J., Priori, S. G., Roden, D. M., George, A. L., Goldstein, S. A. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10613-10618 (2000).
  17. Temple, J., Frias, P., Rottman, J., Yang, T., Wu, Y., Verheijck, E. E., Zhang, W., Siprachanh, C., Kanki, H., Atkinson, J. B., King, P., Anderson, M. E., Kupershmidt, S., Roden, D. M. Atrial fibrillation in KCNE1-null mice. Circ. Res. 97, 62-69 (2005).
  18. Yang, Y., Xia, M., Jin, Q., Bendahhou, S., Shi, J., Chen, Y., Liang, B., Lin, J., Liu, Y., Liu, B., et al. Identification of a KCNE2 gain-of-function mutation in patients with familial atrial fibrillation. Am. J. Hum. Genet. 75, 899-905 (2004).
  19. Zeng, Z. Y., Pu, J. L., Tan, C., Teng, S. Y., Chen, J. H., Su, S. Y., Zhou, X. Y., Zhang, S., Li, Y. S., Wang, F. Z., et al. [The association of single nucleotide polymorphism of slow delayed rectifier K+ channel genes with atrial fibrillation in Han nationality Chinese]. Zhonghua Xin. Xue. Guan. Bing. Za Zhi. 33, 987-991 (2005).
  20. Zhang, M., Jiang, M., Tseng, G. N. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ. Circ. Res. 88, 1012-1019 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

whole cell patch clampKCNEpClamp
Выделение и записи Kv канала в мышиной предсердий и желудочков кардиомиоцитов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.