Методическая статья

В Vivo Двухфотонные изображений зависящие от опыта молекулярные изменения в корковых нейронов

DOI:

10.3791/50148

⸱

5 января 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Unit on Neural Circuits and Adaptive Behaviors, Genes Cognition and Psychosis Program, National Institute of Mental Health, 2Department of Neuroscience, Brown University - National Institutes of Health Graduate Partnership Program, 3Section on Synaptic Pharmacology, Laboratory for Integrative Neuroscience, National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, 4Champalimaud Neuroscience Programme, Champalimaud Center for the Unknown

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Опыт зависит от молекулярных изменений в нейронах имеют важное значение для способности мозга к адаптации в ответ на поведенческие проблемы. В естественных условиях Двухфотонного изображений метод описан здесь, что позволяет отслеживать такие молекулярные изменения в отдельные нейроны коры через генетически закодирована журналистам.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Способность мозга изменяться в ответ на опыт необходима для здорового функционирования мозга, и аномалии в этом процессе способствуют различным расстройствам мозга1,2. Чтобы лучше понять механизмы, с помощью которых мозговые цепи реагируют на опыт животного, требуется способность отслеживать зависящие от опыта молекулярные изменения в определенном наборе нейронов в течение длительного периода времени у живого животного. В то время как известно, что опыт и связанная с ним нейронная активность вызывают изменения экспрессии генов в нейронах1,2, большинство методов обнаружения таких изменений не позволяют повторять наблюдение за одними и теми же нейронами в течение нескольких дней или не имеют достаточного разрешения для наблюдения за отдельными нейронами3,4. В этой статье мы опишем метод, который сочетает в себе двухфотонную микроскопию in vivo с генетически закодированным флуоресцентным репортером для отслеживания изменений экспрессии генов в отдельных корковых нейронах в течение повседневного опыта.

Одним из хорошо известных генов, зависящих от опыта, является активно-регулируемый цитоскелетный ассоциированный белок (Arc)5,6. Транскрипция Arc быстро и в значительной степени индуцируется усиленной нейроннойактивностью3, а его белковый продукт регулирует эндоцитоз глутаматных рецепторов и долгосрочную синаптическуюпластичность7. Экспрессия Arc широко используется в качестве молекулярного маркера для картирования нейронных цепей, участвующих в определенномповедении. В большинстве этих исследований экспрессия Arc была обнаружена с помощью гибридизации in situ или иммуногистохимии в фиксированных срезах мозга. Хотя эти методы показали, что экспрессия Arc локализована в подмножестве возбуждающих нейронов после поведенческого опыта, то, как клеточные паттерны экспрессии Arc могут изменяться при множественных эпизодах повторяющихся или отличительных переживаний в течение нескольких дней, не исследовалось.

Двухфотонная микроскопия in vivo предлагает мощный способ изучения зависящих от опыта клеточных изменений в живом мозге8,9. Чтобы обеспечить возможность изучения экспрессии Arc в живых нейронах с помощью двухфотонной микроскопии, мы ранее создали мышиную линию, в которой репортер GFP помещен под контроль эндогенного промотора Arc10. Этот протокол описывает хирургическую подготовку и процедуры визуализации для отслеживания зависимых от опыта паттернов экспрессии Arc-GFP в нейронных ансамблях у живого животного. В этом методе хронические краниальные окна были впервые имплантированы мышам Arc-GFP над представляющими интерес областями коры головного мозга. Затем эти животные были повторно визуализированы с помощью двухфотонной микроскопии после желаемых поведенческих парадигм в течение нескольких дней. Этот метод может быть в целом применим к животным, несущим другие флуоресцентные репортеры о молекулярных изменениях, зависящих от опыта4.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экспериментальные процедуры, описанные ниже, были одобрены Национальным институтом психического здоровья животных и использованию комитета и были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Предоперационной подготовки

  1. Очистите все инструменты в стерилизатор горячий шарик до асептической хирургии, очистить хирургии сайте с 70% этанола, и положить чистую ткань капли. Носите стерильные перчатки. Анестезию животного с свежеприготовленный 1,2% Avertin решение, учитывая при 0,02 мл / г, intraperitonially. Кроме того, обезболить изофлураном газа через носовой конус, 5% для индукции, 1,5% на техническое обслуживание, с пассивной схемой поглотителя. Проверьте анестезии уровне, используя хвост или ноги щепотки для обеспечения полного успокоения.
  2. Крышка глаза животного стерильной глазной мазью, и придать свежеприготовленный дексаметазона (0,2 мг / кг) и карпрофена (5 мг / кг) subcutaneouslУ предотвратить отек мозга и воспалением 11. Бритье волос на череп между ушами, и стерилизуют кожу скраб бетадин и трех чередующихся мазков из 70% этанола.
  3. Установите животных в стереотаксической этапе операции с earbars, с отоплением циркуляции воды площадку ниже животного набора при температуре 37 ° C. Регулярно проверяйте анестезии животного уровня, а дополняют оригинальные дозу анестетика по мере необходимости.
  4. Inject 200 мкл 0,5% маркаина под кожу головы, чтобы обезболить область. Надрезать кожу и удалить кожный лоскут над черепом. Удалить надкостницы и высушить поверхность чистой ватные тампоны.

2. Хронический черепной хирургии Window

  1. Используйте высокоскоростные бормашины с 0,5 мм заусенцев осторожно наметить 3-5 мм в диаметре круг над мозгом области интереса. Периодически смачивать буровой стерильным 0,9% физиологического раствора и убрать костной ткани с чистой ватные тампоны. Если кость кровоточит, воспользуйтесь гelfoam замачивается стерильным физиологическим раствором, чтобы смыть кровотечение и ждать его остановить.
  2. Когда последний слой кости достигнуто, поднять и удалить кости остров с острым пинцетом. Dura приложениями к нижней полке кости могут возникнуть, если окно пересекает костного шва. Они должны быть аккуратно удалены костный лоскут поднимается.
  3. Рулон смоченной гель пена мягко по воздействию оболочки для очистки его поверхности и ждать любых дурального остановить кровотечение важный шаг. Не продолжать, пока все дурального кровотечение остановилось. Кровь, которая оказывается в ловушке внутри черепной окна обычно приводит к непрозрачные окна.
  4. Если интересующей области находится под местах, где твердой мозговой оболочки, особенно толстого, удаления твердой мозговой оболочки над ним может быть необходимым. Если это так, осторожно отделить твердую мозговую оболочку из мягкой ниже, с очень тонкой щипцы, делают небольшой разрез в поднятом оболочки с другой парой тонких щипцов, затем возьмитесь за кромки и аккуратноразделить оболочки. Длительность тонкий, но сильный, так что будьте осторожны, чтобы не порезать мозга с нетронутыми края оболочки.
  5. Промыть области стерильной ACSF или стерильным физиологическим раствором.
  6. Положите стерильной покровное стекло (3-5 мм) над твердой мозговой оболочкой или мягкой важный шаг. Если окружающие кривые черепа значительно, используйте Kwiksil 12 Клей для заполнения пространства, где твердой мозговой оболочки или мягкой не будет иметь тесный контакт с покровным в регионах , которые не будут образа.
  7. Используйте цианакрилатного гель для покрытия клея эластомера и края стекла покровное. Охватывать весь подвергаются череп с цианакрилатного гель или krazyglue и стоматологические цементные смеси важный шаг. Не допускайте цианакрилатного гель прикоснуться к поверхности мозга.
  8. Добавить на заказ металл голову фиксации бар на противоположной стороне черепа.
  9. Вернуть животное в теплую камеру восстановления, после внутрибрюшинное введение кетопрофена, 5 мг / кг, лГ боли. Продолжить обезболивающее еще два дня после операции.
  10. После двух недель послеоперационного восстановления, анестезию животного изофлураном (5% для индукции, 1,5% на обслуживании), смонтировать его в заказ столика микроскопа с головой фиксации кадра, и проверить черепно окно оптической прозрачности при освещении синим светом. Мозг поверхности кровеносных сосудов ясности весьма показателен черепно качества окна. Если края кровеносных сосудов резко определено, окна, вероятно, будет полезной. Две недели послеоперационного восстановления время рекомендуется обеспечить достаточное количество времени для животного, чтобы оправиться от операции. Черепно окна обычно очистить и улучшить за это время, и остается оптически прозрачным для дополнительных недель до нескольких месяцев до отрастания черепа или утолщение оболочки ухудшает качество окна.

3. Поведенческие протокола и лазерное сканирование Двухфотонные микроскопии

  1. Животные с четкими сranial окна будут подвергаться воздействию экологических стимулов или подвергнуты поведенческой тренировки, а затем после отображаемого во время максимальной Arc-GFP выражение. Перед началом поведенческий протокол, животное должно быть последовательным окружающей среды клетке дома, чтобы минимизировать изо дня в день изменения в исходных Arc-GFP уровни экспрессии.
  2. Начало обучения или поведенческой парадигмы экологического стимулирования, в зависимости от области мозга интерес. Например, животные могут подвергаться воздействию различных визуальных сред более дней подряд, и отображаемого каждый день после визуальной стимуляции, чтобы определить стимулы конкретных ответов в зрительной коре 10.
  3. Arc-флуоресцентного микроскопа в нейроны обычно достигает своего пикового уровня через два часа после стимуляции. Экспериментальные срок может быть оптимизирована для облегчения обнаружения Arc-GFP выражение в нейронах на пике своего уровнях флуоресценции.
  4. После поведенческой тренировки или environmentaл стимуляции завершена, анестезию животного изофлураном (5% для индукции, 1,5% для технического обслуживания) и установить животных в заказ столика микроскопа с головой фиксации кадра на основании двух-фотонного микроскопа.
  5. Положение головы животного крепится к голове фиксации кадра, который подключается непосредственно к сцене, с помощью имплантированных металлическим прутом по голове. Isoflurane и кислород непрерывно подается на мышь через носовой конус. Температура тела поддерживается с помощью грелки.
  6. Убедитесь, что микроскоп Детекторы защищены от окружающего света, проведя два фотона лазерного сканирования в темной комнате. Используйте 20x или 25x (1,05 числовая апертура) объектива погружения в воду для работы с изображениями. Во-первых, под эпи-флуоресценции освещения, получить изображение поверхности кровеносных сосудов моделей на области мозга, интересные с ПЗС-камерой для будущего выравнивания изображения.
  7. Начало двухфотонного лазерного сканирования на приобретение 3-D изображение стека. Olympus FV1000MPE многофотонной микроскоп используется в нашей установке. Возбуждении длиной волны двухфотонной лазер установлен на уровне 920 нм и мощность лазера испускаются из объективных установлена ​​на уровне 50 мВт. Излучение флуоресценции одновременно обнаружены в зеленый и красный каналы (зеркальные при 570 нм, барьерный фильтр на 495-540 нм и 570-625 нм), используя внешний двухканальный photomutiplier системы обнаружения, расположенные рядом с образцом. Arc-флуоресцентного микроскопа появляется только в зеленом канале, в то время как ткани авто-флуоресценции появляется в обоих каналах 13, 14.
  8. Типичные стеки изображений имеют размеры около 320x320x100 мкм (ширина х длина х глубина), горизонтальным разрешением 0,5 мкм / пиксель, и вертикальное разрешение 3 мкм / пиксель.
  9. После получения изображений стека, вернуть животное к его дому клетке. Не беспокоить животное до следующего поведенческого и визуализации сессии. Повторите поведения и образа в принципе через дней желательностииздание Используйте ранее приобретенных поверхности мозга кровеносных сосудов изображение ориентироваться обратно в том же месте изображения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает метод для отслеживания зависящие от опыта молекулярные изменения в отдельных корковых нейронов в живых животных. Хронические черепно окно создается впервые за кортикальной области интереса в проведении мышью флуоресцентные корреспондент экспрессии генов. Двухфотонной микроскопии может быть связан с различными поведенческими парадигмами соблюдать поведенческие индуцированных молекулярных изменений в отдельные нейроны и отслеживать такие изменения в одинаковые наборы нейронов в течение нескольких д...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В методе естественных изображений описанный здесь позволяет повторную экспертизу д'Арк изменения экспрессии генов в той же набор нейронов в течение нескольких дней в живых животных. Это эффективный и универсальный метод получения информации о нейронной пластичности связанных молекулярной динамики в отдельных нейронов в ответ на различные поведенческие опытом. Стандартный гистохимические методы, такие как в гибридизация и иммуноокрашивания может достичь одноклеточных резолюцию 3,...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить Л. Belluscio для хирургии съемках оборудования, Д. Квон для съемок помощи, K. Liu для редактирования видео помощь, и К. Маклеод для всех фоновой музыки. KW признает щедрой поддержке Отдела NIMH очной исследовательских программ и гены, познание и психоз программы. Эта работа была поддержана NIMH Внутренние программы исследований (VC, YY, SMKW) и Отдела NIAAA очной клинической и биологической исследовательской программы (VC, RMC, DML).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Наименование оборудования Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
FV1000 многофотонного лазерного сканирующего микроскопа Олимп FV1000MPE Изображениями
Препарирование микроскопом Omano 555V107 Хирургия
Стереотаксис этапе операции для мышей Harvard Apparatus 726335 Хирургия
20X или 25X цель погружением в воду Олимп XLPL25XWMP Изображениями
Микроскоп сцене с головой фиксации кадра На заказ N / A Изображениями
Изобразительное щипцы Средства изобразительных наук 11251-20 Хирургия
Бормашины заусенцев Средства изобразительных наук 19007-05 Хирургия
ПЗС-камеры QImaging QICAM 12-разрядных Изображениями

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
  2. Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
  3. Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
  4. Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
  5. Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
  6. Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
  7. Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
  8. Fu, M., Zuo, Y. Experience-dependent structural plasticity in the cortex. Trends in Neurosciences. 34 (4), 177-187 (2011).
  9. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  10. Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
  11. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680(2008).
  12. Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  13. Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
  14. Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
  15. Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
  16. Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
  17. Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  18. Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
  19. Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  20. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ArcGFP

Похожие статьи