Мы представляем технику для маркировки отдельных нейронов в центральной нервной системе (ЦНС) Drosophila Эмбрионов, которая позволяет проводить анализ морфологии нейронов либо проходящем свете или конфокальной микроскопии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Маркировка отдельных клеток в центральной нервной системе
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этой статье мы расскажем, как индивидуально маркировать нейронов в ЦНС эмбриональные дрозофилы по juxtacellular введения липофильных флуоресцентных маркеров DiI мембраны. Этот метод позволяет визуализировать морфологию клеток нейронов в мельчайших подробностях. Можно пометить любую ячейку в ЦНС: клеточных тел нейронов-мишеней визуализируются при DIC оптики или выражение флуоресцентные генетических маркеров, таких как GFP. После маркировки, DiI может быть преобразована в постоянный коричневое пятно на фотопреобразования, чтобы позволить визуализации морфологии клеток в проходящем свете и DIC оптики. Кроме того, DiI-меченых клеток можно наблюдать непосредственно с конфокальной микроскопии, позволяющий генетически введен флуоресцентных белков репортер, чтобы быть colocalised. Этот метод может быть использован в любое животное, независимо от генотипа, что делает его возможным для анализа мутантных фенотипов на одной резолюции клетки.
Введение
Знание морфологии нейронов на уровне отдельных клеток является ключевым условием для понимания нейронных соединений и ЦНС функции. Таким образом, с первых дней неврологии, исследователи стремились развивать одну ячейку маркировка техники (см. 7 для исторических лечения этого вопроса). Классические методы, такие как окрашивание Гольджи обеспечивают превосходное разрешение морфологии нейронов, но не подходит, если один пытается маркировать определенный тип нейронов в направленном образом, как окрашивание происходит случайным образом. Разработка методов окрашивания отдельных клеток или внутриклеточных juxtacellular введения красителей из микроэлектродов обрат....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мы использовали два несколько разных вариантов одного метода маркировки нейронов в наших лабораториях. Различия касаются эмбрионов, dechorionisation, devitellinisation и шаги эмбриона филе. Рисунок 1 дает обзор общих и расходящиеся шагов из вариантов.
1. Подготовка микро-иглы для Dissection эмбрионов и микропипетки для краски инъекций
- Стекло иглы для эмбриона рассечения взяты из стеклянных капилляров (1 мм и 0,1 мм толщины стенки) с Sutter съемник (Science Instruments) или сопоставимые оборудования. Кроме того, электролитически заостренные 0,15 мм вольфрамовой проволоки устанавливается в держатель иглы использу....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 4 показаны типичные результаты технику, мы опишем здесь. Рисунке 4а приведен пример DiI заполнены одной интернейронов, который был чисто photoconverted. Это хорошо демонстрирует степень детализации этих препаратов предложение. При осмотре под DIC оптики пространственного контекста меченые клетки в немеченого окружающих тканей становится видимым, например, положение тела клетки в коре головного мозга и волоконно проекции в нейропиле.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Одно из главных преимуществ Drosophila в качестве модельной системы является то, что она позволяет анализ развития и функционирования на уровне отдельных клеток. Это особенно полезно в отношении нервной системы, где разнообразие типов клеток является исключительно высоким и функции и морфологии соседние клетки могут быть совершенно разные.
Метод, который мы представляем здесь, позволяет маркировки отдельных нейронов с красителем, который может быть преобразован в постоянный пятна ил.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантом DFG по Гринвичу
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название Реагенты / Материал | Компания | Номер по каталогу | Комментарии |
| РЕАГЕНТЫ | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 мг / мл в 100 мМ Трис-HCl, рН 7,4 |
| DiI | Invitrogen / Molecular Probes | D-282 | 1 мг / мл в этаноле |
| Формальдегид | Merck Millipore | 7,4% в PBS | |
| Глицерин | Рот | 3783 | 70% в PBS |
| Гептан Клей | Beiersdorf AG | Виолончель 31-39-30 * | разбавлять ок. 1 к 1 с н-гептан |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Рот | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| ОБОРУДОВАНИЕ | |||
| Конфокальный микроскоп | Leica | TCS SP2 | Для просмотра и документирования маркировок флуоресценции |
| DC -mplifier | Драган корпорации | Cornerstone ION-100 | Для выполнения маркировок |
| Покровные | Менцель | BB018018A1 | 18 х 18 мм |
| Покровные | Менцель | BB024060A1 | 24 х 60 мм |
| Препаровальная лупа | Leica | MZ8 | подготовить и disect эмбрионов |
| Плоский Капилляры | Хильгенберг | Наружный диаметр 1 мм, стеклянная толщина 0,1 мм | |
| Инъекции Капилляры | Наука продукты | GB 100 TF 8P | |
| Микроманипулятор R | Leica | Для выполнения маркировок | |
| Модель P-97 | Sutter Instruments | тянуть капилляров | |
| Объект Слайды | Marienfeld Улучшенный | 1000000 | |
| Научно микроскоп | Zeiss | Axioskop 2 мот | Для просмотра маркировок после фотопреобразования |
| Научно микроскоп | Олимп | BX50 | Для выполнения маркировок |
| Sony MC3255 видеокамеры | Sony / AVT Роге | Sony MC3255 | для записи маркировок после фотопреобразования |
Таблица 1.
Ссылки
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Broadie, K., Sink, H., Van Vactor, D., Fambrough, D., Whitington, P. M., Bate, M., Goodman, C. S. Fr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
