Живая съемка апоптоза клеток во время акции Drosophila Эмбриогенеза

Надлежащего устранения нежелательных или аберрантных клеток путем апоптоза и последующего фагоцитоза имеет решающее значение для эмбрионального развития, а также для тканевого гомеостаза у взрослых. Фагоцитоз апоптоза клеток или апоптоз оформления ячейки весьма динамичный процесс, который продолжается в четыре этапа: (1) набор фагоцитов апоптоза клетки ("находят меня '), (2) признания ячейки в качестве мишени для фагоцитоза ( 'есть-меня') и (3) охвате, а затем (4) фагосома созревания и деградации апоптоза частиц ^1-5. Есть два типа фагоцитов: «профессиональный» макрофагов и незрелых дендритных клеток, и "непрофессиональной" ткани-резидент соседних клеток, которые имеют решающее значение для оформления апоптоза клеток во время развития многоклеточных ^6,7.

В развитии дрозофилы, устранение лишних клеток путем апоптоза происходит в три мАйн этапа, первый в середине-конце эмбриона, а затем в середине куколки, а затем в начале взрослой. Во время эмбриогенеза апоптоз частицы удаляются "профессионального" фагоциты, макрофаги, а к "непрофессиональной" эктодермы и глии ^8,9.

В нашей предыдущей работе мы определили фагоцитарного рецептора, шести-микрон-под (SIMU), которая выражается исключительно в фагоцитирующих клеток во время эмбриогенеза. Использование промоутер сима мы получили специфический маркер фагоцитарной клеточных популяций (симу-cytGFP), который позволяет нам отслеживать макрофаги, эктодермы и глии одновременно в живом развивающемся эмбрионе ^8. Кроме того, с помощью специальных маркеров апоптоза клеток на разных стадиях апоптоза, мы можем проследить динамику апоптоза оформление клетки в живом организме.

Чтобы проследить динамику апоптоза оформление клетки в естественных условиях две популяции клеток должны быть помечены: фагоциты и апоптоза клеток.

Чтобы отметить фагоцитарной клеточных популяций мы используем линии Drosophila содержащие симу-cytGFP маркер, который называет исключительно фагоциты в зародыше: макрофаги, глии и эктодермы ^8. Можно использовать различные маркеры для фагоцитов, включая строки, содержащие форменные элементы крови конкретного Gal4 драйвера (CRQ-Gal4) или глии конкретных Gal4 драйвера (РЕПО-Gal4) и генетически закодированы под люминесцентные репортер управления БАС (UAS-GFP).

Для контроля апоптоза клеток в процессе апоптоза клетка оформления мы используем различные апоптоза / фагоцитоза маркеров. Аннексина V (Molecular Probes) служит в качестве раннего маркера апоптоза клеток ^10; Phiphilux (OncoImmunin) представляет собой флуорогенный каспазы-3 субстрате, который используется в качестве позже апоптозSIS маркером, и Lysotracker (молекулярные зонды) работает как фагосома маркер. Мы вводим эти реагенты помощью микроинъекции системы PicoPump PV 820.

1. Готовимся

1. Гептан клея:
   Разверните двухсторонней ленты и положить столько, сколько вы можете в сцинтилляционный флакон, залить гептан, запечатать флаконе парафильмом, и рок в течение 24 часов. Добавить гептана Если клей слишком густой.
2. Мы позволяем мух лежать на подогретого виноградного сока агара + дрожжи вставьте в течение 2 часов, а затем передачи пластины до 25 ° С в течение 10-12 ч (зависит от желаемой этап) до записи микроинъекции и промежуток времени введенных эмбрионов. Мы собираем эмбрионов из чашек с агаром выдерживают при 25 ° С, тем самым обеспечивая эмбрионов из стадии 15 или 16 развития.
3. Иглы подготовки:
   Для подготовки иглы для инъекций, иглы мы используем 'Саттер инструмент »съемник и тонкостенных стеклянных нитей (FHC капиллярной трубки). Кончик объединенных капилляр сломалн диаметром до 0,5-2 мкм.
4. Покровные с клеем:
   С помощью кончика пипетки дисперсные капли гептан клей на одной линии в середине покровное. Дайте ему высохнуть в течение нескольких секунд. Подготовьте несколько из этих покровные.

2. Подготовка эмбрионов

1. Сбор эмбрионов из агара и передавать их в ячейки фильтра (SPL Life Sciences) с помощью чистой кисти и водопровод. Фильтр, проходит за стакан для сбора сточных вод.
2. Мытье эмбрионов в клеточный фильтр с использованием воды, пока все дрожжи пасты не будет удален.
3. Сухие лишнюю воду, протирая пределами использованием фильтра Kimwipes.
4. Поместите клеточный фильтр в чистую чашку Петри и добавить достаточно 50% отбеливателя для покрытия эмбрионов в ячейки фильтра. Dechorionate эмбрионов в течение 2 мин от времени (2-3 раза), перемешивая их.
5. Промыть тщательно водой, пока свободные эмбрионы отбеливатель запах.
6. Поместите ячейку ситечко в чистуюЧашка Петри и охватывают эмбрионов с водой, чтобы предотвратить высыхание.
7. Перед началом настройки эмбрионов, загрузить 1 мкл нужного реагента в две иглы (иногда иглы может быть засорен). Она занимает около 5 мин для жидкости для достижения кончика иглы.
8. Отрежьте прямоугольный кусок виноградного сока агара и поместить его на предметное стекло микроскопа. Передача dechorionated эмбрионов из чашки Петри с агаром кусок с помощью чистой кисти.
9. Под флуоресцентным микроскопом рассечение выбора правильной постановке эмбрионов выражения GFP маркер использованием мокрого кисти и поместить каждого эмбриона близко к краю кусок агара в ряд один за другим (рис. 1А). Эмбрионы должны быть размещены с их брюшной стороне для работы с изображениями фагоцитоза глии в центральной нервной системе (ЦНС).
10. Установка около 10 эмбрионов в один ряд.
11. Закрепить эмбрионов покровное покрытие в середине с полосой гептан клеем (фиг.1В, C
12. Поместите покровное при дегидратации камеры в течение примерно 5 мин (это зависит от влажности помещения и количество для инъекций).
13. После высыхания покрытия эмбрионов с Галокарбоновое масло 700 (Sigma), чтобы избежать дальнейшего обезвоживания.
14. Поместите покровное на предметное стекло микроскопа с эмбрионами вверх. Вы можете поместить каплю воды на слайд, чтобы предотвратить перемещение покровное. Эмбрионы теперь готовы для инъекций. Место впрыска, как правило, на боковой стороне в середине зародыша.

3. Эмбрион инъекций

1. Прикрепить иглы микроманипулятор.
2. Чтобы сломать кончик иглы положил краю покровного стекла в поле зрения и отрегулируйте иглу с тем же фокальной плоскости. Очень осторожно двигаться покровное, пока не встретит на кончике иглы и разбивает его.
3. Ориентируясь на эмбрионах, поместите иглу в нефти и убедитесь, что вы получите каплю жидкости из иглы. Это означает, что кончик иглы былсломана хорошо.
4. Не касаясь иглодержателе перемещения эмбриона в иглу и впрыснуть каплю в эмбрион. Переместить эмбриона в сторону и перейти к следующему, пока все эмбрионы не вводили.

4. Изображениями

Мы изображения эмбрионов на перевернутом конфокальной микроскопии с 40X или 100X цели. Мы ищем красиво расположены эмбриона с ЦНС в середине, который показывает сильное выражение GFP и хороший маркировке апоптоза клеток после инъекции.

Для длительной записи живых эмбрионов мы обычно выбираем 5 или 6 конфокальной ломтиками (толщиной 2 мкм каждый). После этого, мы делаем проекцию 3 ломтика (6 мкм толщиной), чтобы наблюдать целые клетки.

Мы используем маркеров апоптоза клеток, которые являются стабильными и не отбеливать легко. Чтобы избежать GFP отбеливания мы делать записи с интервалом в 60 сек.

В некоторых случаях эмбрионы могут начнет растиво время записи видео. Таким образом, мы взглянем раз в то время на записи для того, чтобы остановиться и начать все сначала, если это необходимо.

Представитель кадров из видеозаписи, в ​​котором апоптотических клеток помечены аннексина V и глии, эктодермы и макрофагов помечены симу-cytGFP показаны на рисунке 2. Каждый кадр является проекцией 3 ломтика 2 мкм каждый.

Эмбриона 15 ступени правильно расположен показывающие эмбриональных ЦНС в середине с хорошо помечены глии (г). Макрофагов (м), которые являются в основном за пределами ЦНС, показать сильные цитоплазматической экспрессии GFP. Эктодермальная клетки также помечены с цитоплазматическими GFP (е). Многие аннексина V позитивные клетки видны внутри, так и вне центральной нервной системы. Чтобы следовать охвату событий не так просто. Мы подчеркивали одно событие с белым прямоугольником, где глиальные клетки захлестывает апоптоза частицы. Обратите внимание на поведение зондирования глиальные клетки: Прикосновение к апоптозу частицы несколько раз без охватили его, а затем в конечном итоге с поглощением из Аннексин V помечены апоптоза клетки (рис. 2

Дополнительные маркеры для различных стадий апоптоза могут быть использованы с той же процедуре.

Рисунок 1. Схематическое изображение эмбриона подготовки к микроинъекции. А. предметное стекло содержащие кусок агара, на которой эмбрионы переносятся после dechorionation. Примерно 20 эмбрионов находились на одной линии, близко к краю кусок агара, с их брюшной стороне, для работы с изображениями ЦНС. B. покровное содержащий полосу гептан клей в середине. С. покровное от B с эмбрионами прикреплены к гептан полосы клея.

Рисунок 2. Динамический анализ апоптоза оформление клетки. Записи со сжатием временис апоптотического оформление клетки в стадии эмбриона 15. Глии (G), макрофагов (M) и эктодермы (E) помечены симу-cytGFP (зеленый). Апоптотическая помеченных флуоресцентными Аннексин V (красный). А. Отдельные кадры из фильма представителя показаны. Глиальные клетки охватили апоптоза клетка изображается прямоугольником. B. Закройте вид на выделенный прямоугольник.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.