Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Измерение Тактильная аллодиния в мышиной модели бактериальный простатит

16.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50158

⸱

16 января 2013 г.

 ,  , 
1Department of Urology, Northwestern University Feinberg School of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

Инфицирование предстательной железы может быть фактором в посредничестве тазовой боли при хроническом простатите. Мы описываем порядок подготовки стандартизированных бактериальной посевной, инстилляции бактерий в мочеиспускательный канал самцов мышей и методологии для измерения тактильной аллодинии у мышей с течением времени.

Аннотация

Uropathogenic кишечной палочки (УПЭК) являются патогенные микроорганизмы, которые играют важную роль в инфекции мочевыводящих путей и бактериальный простатит 1. Недавно мы показали, что УПЭК играют важную роль в инициировании хронической тазовой боли 2, особенностью хронического простатита / синдрома хронической тазовой боли (CP / CPPS) 3,4. Инфекция простаты клинически значимых УПЭК могут инициировать и установить хронических болей с помощью механизмов, которые могут включать повреждения тканей и начала механизмы аутоиммунных 5.

Задача для понимания патогенеза УПЭК в предстательной железе является относительной недоступности предстательной железы манипуляции. Мы использовали ранее описанный метод внутримочеиспускательные инфекции от 6 до доставки клинического штамма УПЭК в самцах мышей таким образом устанавливая восходящей инфекции предстательной железы. Здесь мы описываем наши протоколы для стандартизации баcterial посевной 7, а также процедура катетеризации наркозом мышей-самцов для закапывания бактерий.

CP / CPPS в первую очередь характеризуется наличием тактильной аллодинии 4. Поведение тестирование на основе концепции кожной гипералгезии в результате упомянутых висцерального 8-10 боли. Раздражительным фокус в висцеральных тканях снижает болевой порог кожной позволяет преувеличенной реакции на нормально не болезненные раздражители (аллодиния). Применение нормальной силы на кожу приводит к ненормальной реакции, которые имеют тенденцию к увеличению с интенсивностью основного висцеральной боли. Мы описываем методологию в NOD / ShiLtJ мышей, которые используют Фрея волокон количественно тактильной аллодинии с течением времени в ответ на одну инфекцию УПЭК бактерий.

Протокол

1. Бактерии Подготовка к мышь Прививка

Следующее должно быть сделано в асептических условиях.

  1. Возьмите один 17 х 100 мм трубы из полипропилена с крышками и добавить 3 мл свежего бульона Лурия (LB) средства массовой информации. Использование автоклавного советы, принять некоторые замороженные глицерина бактериями запас штамма CP1 2 и передать небольшое количество культуры в пробирку, содержащую LB СМИ. Заменить трубы колпачок так, что кислород по-прежнему в состоянии войти в трубке - культура должна расти в аэробных условиях. Место трубы при 37 ° C в инкубатор на 220 оборотов в минуту в течение ночи.
  2. На следующий день, передают 5 мкл ночной культуры в новую пробирку с 3 мл среды LB и расти в статических условиях в инкубаторе в течение ночи при 37 ° C.
  3. На 3-й день передачи 40 мкл культуры в аа 50 мл пробирку, содержащую 40 мл LB среды каждого. Место в 37 ° C в течение ночи статического инкубатора.
  4. Включите и установите центрифуге до 4 ° C.После центрифуг достигло конечной температуры, передавать каждое 40 мл культуры в 40 мл центрифужные пробирки Nalgene.
  5. Масса трубы, чтобы сбалансировать центрифуги - регулировка громкости с LB средств массовой информации по мере необходимости. Спиновые труб при 6000 оборотах в минуту в течение 20 мин.
  6. Осторожно удалите супернатант и осторожно приостановить бактериальных гранул в 40 мл стерильной PBS.
  7. Повторите шаг 1,5 с PBS.
  8. Аспирируйте от супернатанта и приостановить бактерий в 500 мкл стерильной PBS. Перенесите раствор в 1,5 трубку микроцентрифуге мл. Возьмите 10 мкл суспензии и разбавить в 990 мкл ледяной PBS. Использование спектрофотометра читать OD 420 нм для определения объема необходимых для прививки. Чтобы определить необходимый объем ледяной PBS приостановить гранул в: Возьмите нм OD 420 номер (в мл), и вычесть оценкам, объем бактериальных гранул [напр. OD 420 нм = 0,545, пеллеты примерно 0,075 мл. 0,545 - 0,075 = 0,470].
  9. Удалить 10 мкл бактериальной суспензии и дилютней в 990 мкл ледяной PBS. Читать OD 420 нм. Целью является достижение OD 420 нм значение для разбавленной суспензии 1,000 ± 0,010. Если номер вашего разведения выше этой цели, добавить больше объема подвески и взять другой чтении. Если число находится ниже 0,990, то спин вниз подвески и повторите OD 420 нм чтении до получения желаемого чтении.

2. Животное инфекции

Мыши (5 до 7 недель, десять в каждой группе) были приобретены у Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

  1. Мышей анестезировали путем ингаляции 1-4% изофлурана в камере плексигласа и контролируется до лежачего.
  2. Одна мышь в то время, принимается для закапывания бактерий, катетеризация с полиэтиленовой (PE10) катетера прикреплен к модифицированному 30 G игла шприца Hamilton стекла (длиной 1,5-2,0 см). Катетер вводится в центр иглы. Мышь НОАКред на его спинной поверхности под наркозом поддерживается с помощью носового конуса.
  3. Пенис мыши выдавливается на мягкое давление и либеральной количества смазки на ватные тампоны используется для смазки вход в уретру полового члена.
  4. 10 мкл фосфатно-солевой буфер, содержащий 1 х 10 8 бактерий вводят в уретру наркозом мышей после катетеризации.
  5. Мышь поддерживается в состоянии наркоза в течение 15 мин в камере оргстекла после введения бактериальных, чтобы прикрепление бактерий и предотвращения непосредственной мочеиспускания.
  6. Мышей помещают обратно в их клетках и контролируется в течение следующих 24 часов.

3. Поведение Тестирование

Мыши были протестированы перед инфекцией (базовый уровень) и на 3, 7, 14, 21 и 28 после заражения. Приглашенный гипералгезии и тактильная аллодиния была проверена с помощью Фрея нитей применяется к животу 11,12 и подошвенной гEgion задней лапы 13. Тестирование исполнялись при фиксированном времени суток, стандартная методология и одного тестирования экспериментатор всех животных были заняты. Ослепленный тестирование групп была использована для борьбы с ограничениями поведения на основе тестирования боли в животных моделях. Пять отдельных Фрея нитей с силами 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 и 4,0 г (Stoelting, США) были применены к животу и частоту вывода ответов был рассчитан.

  1. После 30 мин период акклиматизации, мышей помещают в отдельные камеры оргстекла (6 х 10 х12 см) собственного производства из нержавеющей этаже проволочной сетки стали.
  2. Приглашенный гипералгезии и тактильной аллодинии были протестированы с использованием пяти Фрея нитей. Каждая нить была применена в течение 1-2 сек, между стимулом интервалом в 5 секунд в общей сложности 10 раз, а волосы были проверены в порядке возрастания силы.
  3. Каждая нить наносится на нижнюю область живота в общем близости от простаты ибыли приняты меры для стимулирования различных областей в пределах этой области, чтобы избежать десенсибилизации или "ветер" эффектов. Нити были применены в порядке возрастания силы в течение 1-2 секунд, по крайней мере, 5-секундными интервалами между раздражениями в общей сложности 10 раз.
  4. Три типа поведения считается положительным ответом на стимуляцию нити: 1) резкое втягивание живота; 2) немедленное лизать или царапин на площадь накаливания стимуляции; 3) прыжки.
  5. Частота срабатывания рассчитывается как процент положительных ответов (из 10, например, 5 ответов 10 = 50%) и данные были представлены как средний процент ответов частоты ± SE
  6. Животные с более чем 25 положительных ответов общего базового исключены из исследования.
  7. Тактильная аллодиния был протестирован на подошвенной области задней лапы использованием Фрея нитей с силами 0,04, 0,16, 0,4, 1,0 и 4,0 г. Среднее 50% выводе порога (5) оценивали с помощью вверх-внизМетод тестирования, где был начат с 0,04 г нити перпендикулярно к подошвенной поверхности задних лап, пока нить согнута немного. Нити были проверены в порядке возрастания до получения положительного ответа не наблюдалось. Положительный ответ на нити был определен как резкий вывод лапу или лизать теста лапу. Когда положительный ответ был записан следующий слабые нити была применена, и если отрицательный ответ наблюдалось, то в следующем сильнее нить была применена.
  8. Эксперименты и методологии, описанной были рассмотрены и одобрены ухода за животными Северо-Западного университета и использовать комитета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы рассмотрели NOD / ShiLtj и C57BL/6J самцов мышей на наличие хронической боли при бактериальной инфекции. Самцы мышей (5 до 7 недель) были заложены с физиологическим раствором или бактерий в мочеиспускательный канал (рис. 1). Механическое раздражение тазовой области с фон нитей Frey засоленных-привили мышей C57BL/6J и УПЭК-инфицированных мышей C57BL/6J в результате частотную, которая не изменяется в течение 28-дневного хода эксперимента (рис. 1). В отличие от УПЭК-инфицированных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Инфекция простаты мыши с УПЭК позволяет в естественных условиях моделирования событий, которые могут быть задействованы в патогенезе бактериального простатита, CP / CPPS или предрасполагающие события в хроническое воспаление. Методов, описанных для бактериального препарата и закапывания опираться на большое количество литературы по УПЭК моделей в женских инфекции мочевыводящих путей 7,14. Модель имеет широкое применение для изучения патогенеза, тестирование потенциальных кандидатов вакцины и механизм...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом 1K01DK079019A2 (PT) от NIH / NIDDK.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге
Культура труб BD Falcon 352059
LB бульоне Миллер EMD EM1.10285.0500
Трубы Nalgene центрифуги Thermo 3118-0050
Isoflurane Батлер Schein НДЦ 11695-6776-1
30G иглу катетера Гамильтон 91030
PE10 труб BD intramedic 427400
Von Frey Нити Stoelting 58025-31

Ссылки

  1. Yamamoto, S. Molecular epidemiology of uropathogenic Escherichia coli. Journal of infection and chemotherapy official journal of the Japan Society of Chemotherapy. 13, 68-73 (2007).
  2. Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. Infect. Immun. 79, 628-635 (2011).
  3. Pontari, M. A., Ruggieri, M. R. Mechanisms in prostatitis/chronic pelvic pain syndrome. The Journal of urology. 172, 839-845 (2004).
  4. Schaeffer, A. J. Clinical practice. Chronic prostatitis and the chronic pelvic pain syndrome. The New England journal of medicine. 355, 1690-1698 (2006).
  5. Rudick, C. N., Schaeffer, A. J., Thumbikat, P. Experimental autoimmune prostatitis induces chronic pelvic pain. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 294, R1268-R1275 (2008).
  6. Elkahwaji, J. E., Ott, C. J., Janda, L. M., Hopkins, W. J. Mouse model for acute bacterial prostatitis in genetically distinct inbred strains. Urology. 66, 883-887 (2005).
  7. Hultgren, S. J., Porter, T. N., Schaeffer, A. J., Duncan, J. L. Role of type 1 pili and effects of phase variation on lower urinary tract infections produced by Escherichia coli. Infect. Immun. 50, 370-377 (1985).
  8. Jarrell, J., Giamberardino, M. A., Robert, M., Nasr-Esfahani, M. Bedside testing for chronic pelvic pain: discriminating visceral from somatic pain. Pain research and treatment. 2011, 692102(2011).
  9. Jarrell, J. Demonstration of Cutaneous Allodynia in Association with Chronic Pelvic Pain. J. Vis. Exp. (28), e1232(2009).
  10. Giamberardino, M. A., et al. Viscero-visceral hyperalgesia: characterization in different clinical models. Pain. 151, 307-322 (2010).
  11. Laird, J. M., Martinez-Caro, L., Garcia-Nicas, E., Cervero, F. A new model of visceral pain and referred hyperalgesia in the mouse. Pain. 92, 335-342 (2001).
  12. Laird, J. M., Souslova, V., Wood, J. N., Cervero, F. Deficits in visceral pain and referred hyperalgesia in Nav1.8 (SNS/PN3)-null mice. J. Neurosci. 22, 8352-8356 (2002).
  13. Chaplan, S. R., Bach, F. W., Pogrel, J. W., Chung, J. M., Yaksh, T. L. Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw. Journal of neuroscience. 53, 55-63 (1994).
  14. Schaeffer, A. J., Schwan, W. R., Hultgren, S. J., Duncan, J. L. Relationship of type 1 pilus expression in Escherichia coli to ascending urinary tract infections in mice. Infect. Immun. 55, 373-380 (1987).
  15. Boehm, B. J., Colopy, S. A., Jerde, T. J., Loftus, C. J., Bushman, W. Acute bacterial inflammation of the mouse prostate. The Prostate. 72, 307-317 (2012).
  16. Rivero, V. E., Cailleau, C., Depiante-Depaoli, M., Riera, C. M., Carnaud, C. Non-obese diabetic (NOD) mice are genetically susceptible to experimental autoimmune prostatitis (EAP). Journal of autoimmunity. 11, 603-610 (1998).
  17. Pakarainen, T., Zhang, F. P., Makela, S., Poutanen, M., Huhtaniemi, I. Testosterone replacement therapy induces spermatogenesis and partially restores fertility in luteinizing hormone receptor knockout mice. Endocrinology. 146, 596-606 (2005).
  18. Taguchi, O., Kojima, A., Nishizuka, Y. Experimental autoimmune prostatitis after neonatal thymectomy in the mouse. Clinical and experimental immunology. 60, 123-129 (1985).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Уропатогенная Escherichia Coliнити фон Фреятазовая больотраженная гипералгезиявнутриуретральная инфекцияметод катетеризациитестирование болевого поведения
Измерение Тактильная аллодиния в мышиной модели бактериальный простатит
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.