Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

РНК

12.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50165

⸱

12 апреля 2013 г.

1Department of Biological Sciences, Union College

В этой статье

Краткое содержание

Комбинируя методы РНК целом креплением На месте Гибридизации и гистологии, экспрессия генов могут быть связаны с клеточной судьбы решений в развивающемся эмбрионе. Эти методы были адаптированы для морских хрящевых рыб и облегчения использования этих животных в качестве модельных организмов для медико-биологических, токсикологических и сравнительных исследований.

Аннотация

Морские пластиножаберные являются ценными животными моделями для биомедицинских и геномных исследований, поскольку они являются самыми примитивными позвоночными, обладающими адаптивным иммунитетом и уникальными механизмами осморегуляции 1-3. Будучи наиболее примитивными из ныне живущих челюстно-челюстных позвоночных с парными придатками, пластиножаберные являются эволюционно важной моделью, особенно для исследований эволюции и развития. Морские пластиножаберные также использовались для изучения водной токсикологии и физиологии стресса в связи с изменением климата 4. Таким образом, необходима разработка и адаптация методологий, чтобы облегчить и расширить использование этих примитивных позвоночных в различных биологических дисциплинах. В этой статье я представляю успешную адаптацию целого массива РНК, гибридизацию in situ и гистологические методы для изучения экспрессии генов и гистологии клеток у пластиножаберных.

Мониторинг экспрессии генов является отличительным инструментом биологов развития и широко используется для исследования процессов развития 5. Гибридизация РНК in situ позволяет визуализировать и локализовать специфические транскрипты генов в тканях развивающегося эмбриона. Паттерн экспрессии сообщения гена может дать представление о том, какие процессы развития и решения о судьбе клеток могут контролироваться геном. Сравнивая паттерн экспрессии гена на разных стадиях развития, можно получить представление о том, как роль гена меняется во время развития.

В то время как whole mount in situ предоставляет средства для локализации экспрессии генов в ткани, гистологические методы позволяют идентифицировать дифференцированные типы клеток и тканей. Гистологические пятна выполняют различные функции. Для выделения морфологии клеток используются общие красители, например гематоксилин и эозин для общего окрашивания ядер и цитоплазмы соответственно. Другие пятна могут выделять определенные типы клеток. Например, окрашивание альцианским синим, о котором сообщается в этой статье, является широко используемым катионным окрашивателем для идентификации мукосахаридов. Окрашивание пищеварительного тракта альциевой лазурью позволяет выявить распределение бокаловидных клеток, вырабатывающих мукосахариды. Вариации компонентов слизистых сахаридов на коротких пептидах отличают бокаловидные клетки по функции в пищеварительном тракте 6. При одновременном использовании целого массива РНК in situ и гистохимических методов, решения о судьбе клеток могут быть связаны с экспрессией генов.

Хотя РНК in situ и гистохимия широко используются исследователями, их адаптация и использование у морских пластиножаберных имели ограниченный и разнообразный успех. Здесь я представляю протоколы, разработанные для пластиножаберных и регулярно используемые в моей лаборатории. Несмотря на то, что для адаптации к различным видам может потребоваться дальнейшая модификация метода гибридизации РНК in situ, описанные здесь протоколы являются хорошей отправной точкой для исследователей, желающих адаптировать использование морских пластиножаберных к своим научным исследованиям.

Протокол

I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб

1. Фиксация эмбрионов и подготовка

  1. Skate эмбрионы могут быть организованы в соответствии с Ballard 7. Оптимальное этапы для выявления экспрессии генов в зависимости от ткани интерес. Для отслеживания экспрессии генов в пищеварительном тракте кататься на коньках, этапы 27-30 оптимальные 7.
  2. Проанализируйте эмбрионов в PBS, отделяя эмбрионы из желточного мешка.
  3. Исправить в 30 мл свежеприготовленного 4% параформальдегида (PFA) в 50 мл коническую трубку при 4 ° С с нежным качалки. Исправить в течение 24 часов.
  4. Промойте эмбрионы в PBT, дважды в течение 15 мин, вращающаяся при комнатной температуре. Все рецепты решения для РНК целом крепления на месте "с включены (табл. 1).
  5. Высушить эмбрионов промывкой в ​​метаноле серия 25%, 50% и 75% метанола: PBT качалке при комнатной температуре. Продолжительность промывки зависит от стадии эмбрионов. Для Pre-Neurulation поставил эмбрионов, 5 мин каждого мытья в метаноле серии является достаточным. Для эмбрионами старше этапе 30, моет может длиться до 30 минут. Чтобы определить, если эмбрионы достаточно проникла и приспособиться к каждой стирки, удерживая трубу в вертикальном положении в ваших руках. Если зародыши опускаются на дно пробирки, то вы готовы к следующей стирки. Если эмбрионы плавают в начало решения, изменить решение и повторяю, что особенно обезвоживание шаг.
  6. Мыть два раза в 100% метаноле в течение 10 минут нежно качалке.
  7. Как только обезвоженный до 100% метанола, эмбрионы должны храниться при температуре -20 ° C в течение не менее 24 часов, прежде чем приступить к протоколу. Эмбрионы были успешно хранят при температуре -20 ° C и используется для РНК весь транспорт на срок до 1 года.

2. Синтез РНК-зонда

  1. Создание линейного фрагмента гена, экспрессия которого вы хотите обнаружить. Это может быть сделано либо путем ПЦР-амплификации или линеаризации плазмиды с геноминтерес. Чтобы усилить с помощью ПЦР, выбрать праймеры которого сайтов связывания фланга ген вставить и сохранить РНК-полимеразы сайтов связывания в регионе усиливается. Для часто используемых плазмиды, такие как PBS или pGEM, M15 прямого и обратного праймеров являются идеальным выбором. Кроме того, линеаризации плазмиды путем расщепления 15 мкл ДНК QIAGEN Miniprep с ферментом, который расщепляет на 5 'конце гена. Гель извлечь и очистить помощью соответствующего комплекта QIAquick.
  2. Обратный транскрибировать РНК с использованием зонда 8 мкл линейные плазмиды или 100 нг ПЦР-продукт в качестве шаблона, используя соответствующие РНК-полимеразы (см. Таблицу 2 для транскрипции реакции).
  3. Инкубируйте реакции обратной транскрипции в течение 2 часов при температуре 37 ° C.
  4. Для подтверждения реакции, запустить 1 мкл транскрипции реакции на 1% агарозном / TAE геля. Выполнить геля при 100 mVolts, пока краситель просто запустить в гель. Один видный группа должна быть видна. Линейный фрагмент ДНК-матрицы может быть слабым видимым при более высокой молекулярнойLAR веса.
  5. Добавить 1 мкл РНКазы без ДНКазы реакции транскрипции и инкубировать при 37 ° С в течение 15 мин.
  6. Для осадок, добавляют 100 мкл TE рН 8, 10 мкл 4 М LiCl, 300 мкл 100% этанола и инкубировать при температуре -20 ° С в течение не менее 60 минут или на ночь.
  7. Спин в течение 10 мин в 4 ° C микроцентрифуге при 14000 оборотах в минуту.
  8. Вымойте гранул с 70% этанола и сухой воздух.
  9. Ресуспендируют РНК-зонд в 20 мкл дН 2 O. Добавить 80 мкл буфера гибридизации (гибридизации буфер должен быть предварительно нагревают до 70 ° C). Зонд может быть сохранен в 80% гибридизации буфер в течение нескольких месяцев при температуре -20 ° C или больше при температуре -80 ° C.

3. Эмбрион предварительной обработки и гибридизация

  1. Удалить эмбрионы хранятся в 100% метанола от -20 ° C. Для молодых эмбрионов переходите к шагу (3,2). Для дальнейшего поставил эмбрионов (этап 29/30 <) вы можете увидеть слой эпидермиса, который "поднял" от тела эмбриона. Под микроскопом, тщательно диссECT от эпидермального слоя, чтобы максимально проникающий зонд.
  2. Место эмбрионов в чистом флаконы сцинтилляционного стекла. Увлажняет эмбрионов в обратном серии метанола описано выше: (75%, 50%, 25% метанола: PBT) по покачиваясь каждое решение в течение 5-30 мин каждый при комнатной температуре. Полное регидратации с двумя промывками ПБТ в течение 10 минут каждый, мягко покачиваясь.
  3. Для удаления пигмента, отбеливание эмбрионов с 6% перекиси водорода в PBT в течение 1 часа при комнатной температуре, покачиваясь.
  4. Удалить перекиси водорода стиральная три раза в PBT, (покачивание при комнатной температуре 10 мин каждая).
  5. Лечить эмбрионов с протеиназы К, чтобы обеспечить проникновение зонда при гибридизации. Количество протеиназы К и продолжительность лечения зависит от ткани вы хотите проверить и возраст эмбриона. Более поверхностные ткани и младшего эмбрионы требуют более коротких и менее протеиназы К, в то время как более глубокие ткани и старше эмбрионы требуют более высокой концентрации и длительном лечении Тимомэлектронной полностью permeabilize эмбриона для зонда гибридизации. Например, для обнаружения Shh в кишечнике энтодермы стадии 29 эмбрионов кататься на коньках, 30 мкг / мл протеиназы К / PBT инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре.
  6. Быстро промыть эмбрионов в PBT, чтобы смыть протеиназы К.
  7. Чтобы отключить протеиназы К, Postfix эмбрионы с 4% PFA, 0,2% глутарового альдегида в PBT в течение 20 мин, мягко покачиваясь.
  8. Мыть два раза в течение 10 мин с PBT.
    1. Для предварительной гибридизации, добавить 2-3 мл подогретого гибридизации решение эмбрионов, достаточно, чтобы покрыть их. Рок мягко подогревом водяной бане при температуре 70 ° С в течение 1 часа.
    2. Чтобы подготовить раствор для гибридизации, разогрейте РНК-зонд до 70 ° С в течение 10 мин и прохладной на льду. Развести 15-20 мкл РНК-зонд до 2 мл свежей предварительно нагретый раствор гибридизации для получения конечной концентрации 0,5-1,0 мкг / мл. Удалите предварительно Hybe и добавить разбавленный зонд РНК эмбрионов. Эмбрионы должны быть просто покрыта раствором,дд более гибридизации решение, если это необходимо. Плотно закрыть крышкой сцинтилляционный флакон. Гибридизации по покачиваясь в отапливаемом водяной бане при температуре 70 ° С в течение ночи.

4. Сообщение Гибридизация автомойки и антител Гибридизация

  1. Удалите раствор для гибридизации с зондом из эмбрионов и место в свежей флаконе сцинтилляционный или Eppendorf трубки. Зонд можно хранить при температуре -20 ° C и повторно использовать в будущем. Для пост-гибридизации моет, место эмбрионов в Netwell сидит в 6-луночный планшет для культивирования тканей.
  2. Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 1, раскачиваясь при 70 ° C.
  3. Промыть 3 раза по 30 минут в каждом из подогретого Решение № 2, раскачиваясь при 70 ° C.
  4. Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре.
  5. Предварительно блок с 10% инактивированной сыворотки овец в TBST в течение 1 часа, покачиваясь при комнатной температуре.
  6. Трансфер эмбрионов из Netwell на свежий флакон сцинтилляционного стекла. Добавить анти-DIGFab фрагментов (1:5000) в 1% инактивированной сыворотки овец / TBST для эмбрионов. Рок течение ночи при 4 ° C.

5. Гибридизация Сообщение антител Моет

  1. Удалить антител и выбросить. Место эмбрионов обратно в Netwell для мытья.
  2. Промыть 3 раза по 5 мин в TBST, раскачиваясь при комнатной температуре
  3. Мыть не менее 6 раз в течение 1 часа каждый, раскачиваясь при комнатной температуре.
  4. Мыть на ночь в TBST, раскачиваясь при 4 ° C. Как моет сообщение антител помочь сократить на фоне окрашивание, максимальное количество и продолжительность мытья предпочтительнее. Эмбрионы регулярно мыть в TBST при 4 ° C, в минувшие выходные.

6. Обнаружение Probe

  1. Макияж свежий раствор NTMT и фильтрации стерилизации.
  2. Откажитесь TBST промывочного раствора и место эмбрионов в чистую пробирку сцинтилляционного стекла. Промойте эмбрионы 3 раза в свежем NTMT в течение 10 минут каждый при комнатной температуре, качалки.
  3. Удалить NTMT вымыть и добавить реакционной смеси1 х NBT / 1 х BCIP в NTMT. Поскольку эти реагенты являются светочувствительными, накрыть сцинтилляционных флаконов в фольгу и рок-при комнатной температуре.
  4. Монитор цветной реакции каждые 15 мин до желаемой экспрессии гена ясно видно. Сильные зондов может занять всего 10 минут, чтобы развиваться. Слабые зондов может занять 1-2 часа. Не позволяйте реакции идут слишком долго или фоновое окрашивание начнут появляться (весь эмбрион начинает превратить скучный фиолетовый или коричневый цвет).
  5. Промойте 2 раза по 10 минут в каждом из PBT при комнатной температуре, качалки.
  6. Postfix эмбрионов в 4% параформальдегид, 0,1% глутарового альдегида в течение 1 часа при комнатной температуре. Эмбрионы могут быть магазина на неопределенный срок в фиксаторе при 4 ° C.
  7. Визуализация эмбриона с рассекает стереомикроскопа. Для получения светло-голубой фон для фотографий, место эмбрионов в чашке с предварительно закаленной 1% агарозном / PBS.

7. Представитель Результаты I. РНК Всего горы в гибридизация в морских хрящевых рыб

РНК целые горы на месте "с изображающих выражение Еж Соник (Shh) и Hoxa13 в эмбрионах конька показано на рисунке 1. Экспрессия Shh у высших позвоночных находится в энтодерме хорда и кишечник, и это выражение шаблон сохраняется в конька (рис. 1а) 8,9. Морские хрящевых рыб имеют уникальный метод, который использует осморегуляции ректальные железы выделяют соли. Hoxa13 выражение высокой в развивающихся ректальные железы (рис. 1b) 10. Hoxa13 продукт гена роль в формировании паттерна ректальные железы остается неизвестной.

II. Парафин вложения и секционирования пластиножаберных тканей

1. Урожая и подготовка ткани

  1. Проанализируйте нужную ткань и закрепите в 10% формалине в течение 24-48 часов, раскачиваясь при комнатной температуре. 4% параформальдегида (PFA) также может быть использована в качестве закрепителя(См. Обсуждение).
  2. Промойте фиксатором промывкой в ​​PBS 3 раза в течение 30 минут каждый. В зависимости от размера ткани, стиральные раз может быть уменьшено до 10 мин или увеличить до 1 часа.
  3. Высушить эмбрионов промывкой в ​​этаноле серия 25%, 50% и 75% этанола: PBS качалке при комнатной температуре. Опять же, время для каждой стирки будет зависеть от размера ткани. Для 0,5 см 3 ткани, инкубировать каждого мытья в течение 15 мин. Увеличение времени для больших кусков. Если длительном хранении ткани желательно, мыть еще два раза с 75% этанола и хранят в -20 ° C на срок до одного года. В противном случае переходите к следующему шагу.
  4. Дальнейшая обезвоживанию промыванием 3 раза в 100% этаноле в течение 15 минут каждый, покачиваясь.

2. Парафин вложения и секционирования

  1. Уточнить ткани, стиральные 2 раза в ксилоле в течение 5 мин в стеклянные сцинтилляционные флаконы с крышками винтовой крышкой. Ксилол будет оказывать ткани хрупкими, поэтому не превышает в общей сложности 10 мин былоГЭС. Ткань должна выглядеть полупрозрачными, когда вы держите его к свету. Если ткань по-прежнему очень непрозрачная после двух стирок, делать дополнительные мыть в ксилоле в течение 5 мин, а затем приступить протокол. Только обрабатывать ксилол внутри вытяжного шкафа в перчатках.
  2. Удалить ксилол и заполнить сцинтилляционный флакон на 2/3 с расплавленным парафином. Инкубируйте в 60 ° C духовке в течение 30 мин. При установке парафин во флакон, вы заметите, парафин укрепить по бокам флакона. Поместить флакон в духовку и дайте парафин повторно растворяется в течение нескольких минут. Возьмите пузырек из духовки и дать решение быстрый водоворот, чтобы смешивать и заменить в духовке в течение оставшейся части инкубации.
  3. Повторите парафин инкубации еще два раза в течение 30 мин.
  4. Инкубируйте в парафин два раза в течение часа каждый. Изменение парафина в последний раз и инкубировать в течение ночи в 60 ° C духовке.
  5. На следующий день, поместить ткань в ванну с подогревом камеру парафин и место под вакуумом в течение 2-3 часов. Это будет способствовать проникновению парафина в ткани и удалить пузырьки воздуха. Для некоторых типов тонких тканей, вакуумные шаг может и не потребоваться, но это необходимо для целого эмбриона или желудочно-кишечного тракта и других органов просвета отсеков.
  6. После вакуумной способствовало проникновению ткани, места ткани в металлическую форму с расплавленным парафином, и прохладно на ледяной пластины. Оставить на льду или при температуре 4 ° С в течение ночи, прежде чем пытаться удалить ткань из формы. Парафиновые блоки ткани могут храниться неопределенно при 4 ° C.
  7. Место парафинового блока на микротома и сократить 8 мкм разделов. Разделы должны быть размещены на водяной бане нагревают до 48 ° С и установлены на стекло Superfrost * слайды Plus.
  8. Сухие горки на ночь в духовку на 37 ° C.
  9. Магазин разделов при 4 ° С до необходимости.

III. Alcian Blue / Ядерная Быстрый красное пятно из ткани пластиножаберных

1. Alcian синевы для Муциньш

  1. Место слайды с разделами вверх на слайде теплее. Растопить в течение 45 мин.
  2. Место скользит в держателе слайдов. Все последующие решения, содержащиеся в кадках внутри вытяжного шкафа. Слайды промывают путем перевода их из одной ванны с раствором в другой. Убедитесь в том, что решение уровня в ваннах охватывает слайдов; ткани на слайдах они полностью погружены. Растворите парафина стиральная слайды 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый.
  3. Вымойте слайды в два раза со 100%-ным этанолом в течение 1 мин каждая.
  4. Увлажняет слайды в серии этанола (75%, 50%, 25% этанола) мытье в каждом решении в течение 1 мин. Стирать в дН 2 O в течение 1 мин.
  5. Пятно в Alcian синий раствор, рН 2,5 в течение 15 мин.
  6. Разработка пятно промывкой в ​​проточной воде в течение 3 мин. Опустите один раз в дН 2 O.
  7. Контрастирующая в ядерной Fast Red решение контрастирующая в течение 10 мин.
  8. Промыть в проточной воде в течение 3 мин и окунуться в дН 2 O один раз.
  9. Дегидратацииdrate в серии этанола (25%, 50%, 75%, 100%, 100%) в течение 20 провалов каждый, или 1 мин каждая. Промойте 2 раза в ксилоле в течение 5 минут каждый. Установить с DPX монтажа средних и покровные. Разрешить монтажа средних сухой и затвердеть в течение 48 часов в вытяжном шкафу до манипулирования слайдов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Примеры альциановым синего окрашивания в различные регионы L. erinacea тракта пищеварительного показано на рисунке 2. Кислота муцина содержащие globlet клеток четко видны на альциановым синие пятна на всем протяжении пищеварительного тракта. Распределение кислоты муцин отличается в различных регионах желудочно-кишечного тракта, таким образом, отражает различия в функцию. Кислотные муцинов которые редко производятся в кишечнике спирали и клоаки, в то время как высокая концентрация кислоты муцин ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Протоколы представлены классические методы мониторинга экспрессии генов и определения дифференцированных типов клеток, и были адаптированы для использования в морских хрящевых рыб. Дальнейшие модификации этих протоколов могут быть необходимы для адаптации к различным видам пластиножаберных.

Наиболее распространенными озабоченность по поводу РНК целом крепления на месте "с собой риск загрязнения РНКазы и тем самым деградацию зонда РНК и эндогенных сообщений. Два аспекта необходи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Мне нечего раскрывать.

Благодарности

Я хотел бы поблагодарить многих студентов, которые работали в моей лаборатории и внесли свой вклад в эволюцию этих протоколов. NAT получил поддержку от Skidmore-Союз сети, проект создан с ADVANCE NSF ПЛАТНЫЕ гранта.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10 x транскрипционный буферRoche11-465-384-001
DIG-RNA меченый миксRoche11-277-073-910
Ингибитор РНКазыRoche03-335-399-001
РНК-полимераза - SP6Roche10-810-274-001
ДНКаза, РНКаза без РНК Roche10-776-785-001
Дрожжевая РНКInvitrogen15401-029
CHAPSEMD-Millipore220201
гепариномSigma-AldrichH4784
DEPC (диэтилпирокарбонат)Research Organics2106D
Moria Перфорированная ложкаFine Science Tools10370-17
Вкладыши Netwell Электроннаямикроскопия Науки64713-00Нетвеллы для использования в 6-луночных чашках для культуры
тканей 6-луночный планшет для культурытканей Corning3516
Стеклянные сцинтилляционные флаконы с завинчивающимися крышками WeatonScience Products986540
формамидFisherBP227500
Proteinase KInvitrogen59895 (AM2542)
NBT11585029001
BCIPRoche11585002001
Перекись водорода, 30%EMDHX0635-1
Сыворотка для овецVWR101301-478
глутаральдегидSigma-AldrichG5882
тРНКRoche10-109-541-001
Anti-DIG Fab FragmentsRoche 1137-6623
Таблица 3. Реагенты и оборудование для РНК whole mount in situ's.
1% Alcian Blue 8GS, pH 2,5Электронная микроскопияНауки 26323-01
Ядерная быстрая краснаяэлектронная микроскопия Науки26078-05
DPX Монтантнаяэлектронная микроскопияНауки 13510
Парафин (Paraplast X-tra)McCormick Scientific39503002
10% формалин, NBFVWR95042-908
Стеклянные сцинтилляционные флаконы с завинчивающимися крышкамиWeaton Science Products986540
Формы для стальной основы из нержавеющей сталиTissue-Tek4161-4165Доступны несколько размеров.
Кассеты Tissue-Tek4170
Подогреватель слайдовFisher-Scientific12-594Q
Встраиватель тканейLeica MicrosystemsEG1160
Микротом, ротационныйLeica MicrosystemsRM2235
Набор для окрашивания слайдов Tissue-TekЭлектронная микроскопия Sciences62540-01
Tissue-Tek 24-слайд ДержательЭлектронная микроскопия Науки62543-06
Superfrost*Плюс слайдыFisherbrand12-550-17
Table 4. Реагенты и оборудование для окрашивания Alcian Blue.

Ссылки

  1. Forester, R., Goldstein, L. Intracellular osmoregulatory role of amino acids and urea in marine elasmobranchs. Am. J. Physiol. 230, 925-931 (1976).
  2. Shuttleworth, T. Physiology of elasmobranch fishes. Shuttleworth, R. , Springer-Verlag. 171-194 (1988).
  3. Yancey, P. H., Clark, M. E., Hand, S. C., Bowlus, R. D., Somero, G. N. Living with water stress: evolution of osmolyte systems. Science. 217, 1214-1222 (1982).
  4. Ballatori, N., Villalobos, A. Defining the molecular and cellular basis of toxicity using comparative models. Toxicl. Appl. Pharmacol. 183, 207-220 (2002).
  5. Nieto, M. A., Patel, K., Wilkinson, D. G. In situ hybridization analysis of chick embryos in whole mount and tissue sections. Methods Cell Biol. 51, 219-235 (1996).
  6. Jass, J. R., Walsh, M. D. Altered mucin expression in the gastrointestinal tract: a review. J Cell Mol Med. 5, 327-351 (2001).
  7. Ballard, W. W., Mellinger, J., Lechenault, H. A series of normal stages for development of Scyliorhinus canicula, the lesser spotted dogfish (Chondrichthyes; Scyliorhinidae). J. Exp. Zool. 267, 318-336 (1993).
  8. Echelard, Y., et al. Sonic hedgehog, a member of a family of putative signaling molecules, is implicated in the regulation of CNS polarity. Cell. 75, 1417-1430 (1993).
  9. Riddle, R. D., Johnson, R. L., Laufer, E., Tabin, C. Sonic hedgehog mediates the polarizing activity of the ZPA. Cell. 75, 1401-1416 (1993).
  10. Theodosiou, N. A., Hall, D. A., Jowdry, A. L. Comparison of acid mucin goblet cell distribution and Hox13 expression patterns in the developing vertebrate digestive tract. J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 308, 442-453 (2007).
  11. Sambrook, J., Russell, D. W. Ch. 7. Molecular Cloning; A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 7.82(2001).
  12. Zhang, G., Miyamoto, M. M., Cohn, M. J. Lamprey type II collagen and Sox9 reveal an ancient origin of the vertebrate collagenous skeleton. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 3180-3185 (2006).
  13. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2, Battelle Press. (1980).
  14. Theodosiou, N. A., Simeone, A. Evidence of a rudimentary colon in the elasmobranch, Leucoraja erinacea. Dev. Genes Evol. 222, 237-243 (2012).
  15. Filipe, M. I. Mucins in the human gastrointestinal epithelium: a review. Invest. Cell Pathol. 2, 195-216 (1979).
  16. Corfield, A. P., Wagner, S. A., Clamp, J. R., Kriaris, M. S., Hoskins, L. C. Mucin degradation in the human colon: production of sialidase, sialate O-acetylesterase, N-acetylneuraminate lyase, arylesterase, and glycosulfatase activities by strains of fecal bacteria. Infect. Immun. 60, 3971-3978 (1992).
  17. Reid, B. J., et al. Flow-cytometric and histological progression to malignancy in Barrett's esophagus: prospective endoscopic surveillance of a cohort. Gastroenterology. 102, 1212-1219 (1992).
  18. Mowry, R. Selective staining of pancreatic beta-cell granules. Evolution and present status. Arch. Pathol. Lab Med. 107, 464-468 (1983).
  19. Roberts, D. J., Smith, D. M., Goff, D. J., Tabin, C. J. Epithelial-mesenchymal signaling during the regionalization of the chick gut. Development. 125, 2791-2801 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Гистологические методыанализ экспрессии геновокрашивание альциановым синимNuclear Fast Redобработка протеиназой Kгибридизационный растворпромывка антителами
РНК
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.