Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Генерация стабильных клеточных линий человека с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) ShRNA или кДНК выражений

35K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50171

⸱

5 марта 2013 г.

 ,  , 
1UCL Cancer Institute, 2Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research

В этой статье

Краткое содержание

Быстрый и простой способ создания клеточных линий человека с индуцибельной и обратимым кДНК гиперэкспрессией или ShRNA-опосредованной нокдаун гена интереса. Этот метод позволяет исследователям надежно и высоко воспроизводимо управлять клеточными линиями, которые трудно изменить переходным методов трансфекции или обычные нокдаун / нокаут стратегии.

Аннотация

Основным подходом в области клеточной биологии млекопитающих является манипулирование экспрессией интересующих генов в выбранных клеточных линиях с целью выявления одной или нескольких функций генов с помощью транзиторной/стабильной сверхэкспрессии или нокдауна интересующего гена. К сожалению, для различных клеточных биологических исследований этот подход неподходит, когда манипуляции с экспрессией генов приводят к дефектам роста/пролиферации клеток или нежелательной дифференцировке клеток. Поэтому исследователи адаптировали белок-репрессор тетрациклина (TetR), взятый из оперона1 сопротивления тетрациклину E. coli, для создания очень эффективных и жестких регуляторных систем для экспрессии кДНК в клетках млекопитающих2,3. Короче говоря, TetR был модифицирован либо для (1) блокирования инициации транскрипции путем связывания с Tet-оператором (TO) в промоторной области при добавлении тетрациклина (так называемая система Tet-off), либо (2) связывания с TO в отсутствие тетрациклина (так называемая система Tet-on) (рис. 1). Учитывая неудобство, связанное с тем, что система Tet-off требует постоянного присутствия тетрациклина (период полураспада которого составляет около 24 часов в среде для культивирования тканевых клеток), система Tet-on была более широко оптимизирована, что привело к разработке очень тесных и эффективных векторных систем для экспрессии кДНК, как это используется в настоящем документе.

Вскоре после установления РНК-интерференции (РНК) для нокдауна гена в клетках млекопитающих4, были описаны векторы, экспрессирующие короткие шпильчатые РНК (шРНК), которые функционируют очень похоже на миРНК5-11. Тем не менее, эти подходы к нокдауну, опосредованные shRNA, имеют те же ограничения, что и обычные стратегии нокаута, поскольку стабильное истощение невозможно, когда гены-мишени важны для выживания клеток. Чтобы преодолеть это ограничение, van de Wetering et al. 12 модифицировали вектор экспрессии шРНК pSUPER5 путем вставки TO в промоторную область, что позволило им генерировать стабильные клеточные линии с индуцируемым тетрациклином истощением интересующих их генов-мишеней.

Здесь мы описываем метод эффективного создания стабильных линий клеток Tet-on человека, которые надежно управляют либо индуцируемой сверхэкспрессией, либо истощением интересующего гена. С помощью этого метода мы успешно сгенерировали клеточные линии Tet-on, которые значительно облегчили анализ каскада MST/hMOB/NDR в центросоме13,14 и передачи сигналов апоптоза15,16. В этом отчете мы описываем векторы нашего выбора, а также описываем два последовательных шага манипуляции, которые необходимы для эффективного создания человеческих клеточных линий Tet-on (рис. 2). Кроме того, помимо описания протокола создания человеческих клеточных линий Tet-on, мы обсудим критические аспекты, касающиеся технических процедур и характеристики клеток Tet-on.

Протокол

1. Клонирование pcDNA6_TetR_IRES_blast

  1. Как показано на рисунке 3, выполнить частичную дайджест pcDNA6/TR плазмиды (V1025-20, Invitrogen) рестриктазами Xba я и сержантского я, чтобы удалить ген TetR и промоутером сопротивление бластицидин (BlastR) гена. Изолировать 4,6 Кб фрагмент вектора.
  2. Чтобы удалить последовательность полиаденилирования от гена TetR, ввести с помощью ПЦР Xho я сайте сразу же после стоп-кодона из TetR кДНК при сохранении сайте Xba я на 5'-кДНК. Субклона полученный фрагмент в pMigR1 17 с использованием ферментов рестрикции Xba я и Xho I для создания pMigR1_TetR плазмиды.
  3. Дайджест pMigR1_TetR вектор с рестриктаз Xba я и сержантского я, чтобы освободить TetR_IRES фрагмент. Изолировать 1,25 кб вставки фрагмента.
  4. Лигируют 4,6 Кб pcDNA6/TR и 1,25 кб TetR_IRES фрагментов. Transform перевязки продуктов в компетентные E.coli и определить желаемую pcDNA6_TetR_IRES_blast конструкция с использованием стандартных методов молекулярной биологии.

2. Генерация клеточных линий, стабильно экспрессирующих TetR

  1. На 1-й день, Seed 1x10 6 клеток на 10-сантиметровом культуре ткани пластины с помощью стандартной среде роста (например, DMEM с добавлением 10% FCS). Семенной двух пластин, одна для трансфекции pcDNA6_TetR_IRES_blast, а другой в качестве отрицательного контроля для отбора бластицидин. Убедитесь, использовать низкие проход возможен и рекомендуемый средний рост.
  2. На 2-й день трансфекции одна пластина с 2 мкг pcDNA6_TetR_IRES_blast использованием Fugene 6 (E2691, Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Не трансфекции второй пластины.
  3. На 3-й день, добавить стандартную питательную среду, содержащую 5 мкг / мл бластицидин для обеих пластин. Обратите внимание, что выбор оптимальной концентрации могут варьироваться для данной линии клеток и могущество пEED должны быть определены заранее.
  4. На 4-й день, разделили клетки на 1/5, 1/25, 1/50 и 1/100 с помощью 10-см пластины и стандартной питательной среде, содержащей 5 мг / мл бластицидин. Убедитесь в том, чтобы правильно маркировать пластин, содержащих нетрансфецированные или трансфекции клеток. Приготовьте две пластины на разведение шаг.
  5. Проверьте клетки ежедневно, гарантируя, что все клетки на нетрансфицированных пластин умерли в течение первой недели. Измените выделение средств массовой информации каждые 2-3 дня.
  6. Через 1-2 недели, бластицидин устойчивых колоний должны начать появляться. Выберите пластины, содержащие от 5 до 50 колоний для обеспечения одной колонии могут быть выбраны.
  7. Когда колонии достигли диаметром около 5 мм (или больше), выделить по крайней мере 12 независимых клонов использованием клонирования цилиндров, чтобы выбрать одну колонии. Передача каждого клона в отдельную лунку в 24-луночный планшет для культивирования тканей. Когда сливающиеся, разделить клетки из каждой лунки в одну лунку 6-луночный планшет для культивирования тканей.
  8. Продолжайте культуры CLте, в выборе средств массовой информации. Когда сливающиеся, разбиение ячеек из каждой лунки на две одиночных скважин из 6-луночный планшет для культивирования тканей.
  9. Для каждого клона должны быть протестированы, заморозить одну скважину вырожденных клеток и урожай клеток в другие хорошо для последующего тестирования с помощью иммуноблоттинга.
  10. Обнаружение TetR помощью Вестерн-блоттинга с помощью мыши моноклональные анти-TET02 антител (Mobitec GmbH). Не забудьте включить лизат родительской клеточной линии в качестве отрицательного контроля.
  11. Выберите 3-х клонов с высокой TetR выражения и расширения каждого клональный культуры. Замораживание акций каждой перспективных клонов как можно скорее. Наконец, изучение молекулярных и клеточных биологических параметров, представляющих интерес, сравнивая родительских линий клеток с TetR-экспрессирующих клонов. Выберите "лучший" клон с высокой TetR выражение, которое не выводит никаких изменений в молекулярной и клеточной биологических параметров, представляющих интерес.

3. Пилотное тестирование pTER и PT-Rex DEST30 векторы ЭкспрессING ShRNA или кДНК, Соответственно

  1. Создание pTER плазмиды со вставками ShRNA, как описано 12. Построить PT-Rex DEST30 вектор (12301-016, Invitrogen), содержащей кДНК интерес использовании шлюза технологий (Invitrogen). В случае кДНК выражения, добавление тегов к кДНК позже облегчения обнаружения экзогенно выразил белка.
  2. Временно трансфекции родительской линии клеток-мишеней с pTER или PT-Rex DEST30 плазмиды (выражение либо shRNAs или кДНК интерес) с помощью трансфекции реагента выбор. Для тестирования плазмид ShRNA выражения, обеспечить высокую эффективность трансфекции может быть достигнута.
  3. Урожай трансфицированных клеток и процесс иммуноблоттинга помощью соответствующих антител, ожидая обнаружить истощения или избыточная экспрессия гена ваших интересов.

4. Генерация стабильных клеточных линий с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) Выражение shRNAs или кДНК Использование pTER или PT-Rex DEST30 векторы

  1. На 1-й день, семена 1x10 6 клеток из «лучших» TetR-экспрессирующих клонов в 10-см пластины с помощью стандартной среде роста дополнить сертифицированных Тетрациклин без сыворотки (например FBS от Invitrogen; 16000-014). Семенной одна пластина для трансфекции pTER (или PT-Rex DEST30), и одну пластину в качестве отрицательного контроля за двухместный выбор. Убедитесь, что используется низкий проход возможен.
  2. На 2-й день трансфекции одна пластина с 2 мкг pTER (или PT-Rex DEST30) с помощью Fugene 6. Не трансфекции второй пластины.
  3. На 3-й день, добавить стандартную питательную среду, содержащую 5 мкг / мл бластицидин и 500 мкг / мл зеоцин (или 1 мг / мл G418).
  4. На 4-й день, разделили клетки на 1/5, 1/25, 1/50 и 1/100 с помощью 10-см пластины и стандартной питательной среде, содержащей 5 мкг / мл бластицидин и 500 мкг / мл зеоцин (или 1 мг / мл G418). Приготовьте две пластины на разведение шаг.
  5. Проверьте клетки ежедневно, убедившись, что в течение первой недели все клетки на нетрансфицированных пластин умерли.Изменение стандартной питательной среде содержащей бластицидин и зеоцин (или G418) каждые 3-4 дня.
  6. Через 2-3 недели, бластицидин / зеоцин (или blasticidin/G418) дважды устойчивых колоний должны начать появляться. Выберите пластины, содержащие от 5 до 50 колоний, чтобы выбрать одну колонии.
  7. Когда колонии достигли диаметром около 5 мм (или больше), используют клонирование цилиндров, чтобы выбрать одну колонии. Изолировать по меньшей мере 24 индивидуальных клонов. Передача каждого клона в отдельную лунку в 24-луночный планшет для культивирования тканей.
  8. Культура клонов в среде, содержащей обслуживания концентрации бластицидин (5 мкг / мл) и зеоцин (250 мкг / мл) [или G418 (0,5 мг / мл)]. Когда сливающиеся, разделить клетки из каждой лунки в одну лунку 6-луночный планшет для культивирования тканей.
  9. Для каждого клона должны быть протестированы, разделить один сливной колодец 6-луночный планшет на три одиночных скважин из 6-луночный планшет. Когда сливающиеся, замораживание клеток из одной скважины. Используйте оставшиеся две скважины для тестирования тетрациклиномE-индуцируемой экспрессии. Добавить тетрациклин в концентрации 1 мкг / мл в одной скважине, оставляя вторую и тетрациклин бесплатно.
  10. После 24 до 96 ч инкубации с тетрациклин, урожай клеток и процесс иммуноблоттинга с помощью соответствующих антител. Сокращение времени тетрациклин инкубации рекомендуется при скрининге для индукции кДНК выражении, в то время как больше тетрациклин лечение будет необходимо определить ShRNA-опосредованной истощения эндогенных белков.
  11. Выберите по крайней мере, двух клонов с нужными истощение / гиперэкспрессии и расширение каждой культуры. Замораживание акций каждой перспективных клонов как можно скорее. При выращивании на Тет-клонов для экспериментов всегда убедитесь, что используете среде с добавлением тетрациклина без сыворотки и соответствующих антибиотиков выбора на поддержание концентрации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Например для начальных характеристик ПЭС-1 клеточные линии, стабильно экспрессирующие TetR показано на рисунке 4. Отметим, что все НПП-1 клонов выражать различные уровни TetR (сравните дорожки 2 и 5), в то время как родительская клеточная линия (которая служит в качестве отрицательного контроля) не выражает экзогенных белков TetR (рис. 4, дорожка 1). Это изменение в выражении TetR среди ПЭС-1 Тет-на клеточных клонов, как ожидается, поскольку выражение TetR выражения плазмиды сильно зави...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы считаем, что Тет-систем значительно облегчить анализ функции генов, особенно в клеточных системах, которые трудно манипулировать и / или при манипуляции генов необходима для выживания клеток. Кроме того, способность контролировать экспрессию генов весьма специфический Тет-систем предоставляет возможность для изучения функций генов на разных этапах (например, во время клеточного цикла или четко определенные процессы дифференциации). Метод, представленный здесь, позволит исследователям для создания желаемого стабильног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Мы благодарим всех членов нашей лаборатории за полезные обсуждения. Мы благодарим Джоанна Lisztwan и Кристина Gewinner за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом BBSRC BB/I021248/1 и Wellcome Trust грант 090090/Z/09/ZAH является научным Wellcome Trust развития карьеры научный сотрудник Института Рака UCL.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Комментарии (по желанию)
Эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) Invitrogen 16000-044 Протестировано Тет-бесплатно
Бластицидин Invivogen Муравей-BL-1
Зеоцина Invivogen Муравей-Zn-5
G418 PAA лабораторий P31-011 100 мг / мл в СМИ
анти-TET02 Mobitec GmbH TET02 Используйте на 1/1000 до 1/2000 для WB
pcDNA6/TR Invitrogen V1025-20
PT-Rex DEST30 Invitrogen 12301-016
Тетрациклин Сигма 87128 2 мг / мл в этаноле
Доксициклин Сигма D9891 2 мг / мл в воде
Клонирование цилиндров Bellco стекла Инк 2090-00808 повторного использования

Ссылки

  1. Postle, K., Nguyen, T. T., Bertrand, K. P. Nucleotide sequence of the repressor gene of the TN10 tetracycline resistance determinant. Nucleic Acids Res. 12, 4849-4863 (1984).
  2. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5547-5551 (1992).
  3. Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268, 1766-1769 (1995).
  4. Elbashir, S. M., et al. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 411, 494-498 (2001).
  5. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296, 550-553 (2002).
  6. McManus, M. T., Petersen, C. P., Haines, B. B., Chen, J., Sharp, P. A. Gene silencing using micro-RNA designed hairpins. RNA. 8, 842-850 (2002).
  7. Miyagishi, M., Taira, K. U6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3' overhangs efficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells. Nat. Biotechnol. 20, 497-500 (2002).
  8. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes Dev. 16, 948-958 (2002).
  9. Paul, C. P., Good, P. D., Winer, I., Engelke, D. R. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat. Biotechnol. 20, 505-508 (2002).
  10. Sui, G., et al. A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).
  11. Yu, J. Y., DeRuiter, S. L., Turner, D. L. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 6047-6052 (2002).
  12. van de Wetering, M., et al. Specific inhibition of gene expression using a stably integrated, inducible small-interfering-RNA vector. EMBO Rep. 4, 609-615 (2003).
  13. Hergovich, A., et al. The MST1 and hMOB1 tumor suppressors control human centrosome duplication by regulating NDR kinase phosphorylation. Curr. Biol. 19, 1692-1702 (2009).
  14. Hergovich, A., Lamla, S., Nigg, E. A., Hemmings, B. A. Centrosome-associated NDR kinase regulates centrosome duplication. Mol. Cell. 25, 625-634 (2007).
  15. Kohler, R. S., Schmitz, D., Cornils, H., Hemmings, B. A., Hergovich, A. Differential NDR/LATS interactions with the human MOB family reveal a negative role for human MOB2 in the regulation of human NDR kinases. Mol. Cell Biol. 30, 4507-4520 (2010).
  16. Vichalkovski, A., et al. NDR kinase is activated by RASSF1A/MST1 in response to Fas receptor stimulation and promotes apoptosis. Curr. Biol. 18, 1889-1895 (2008).
  17. Pear, W. S., et al. Efficient and rapid induction of a chronic myelogenous leukemia-like myeloproliferative disease in mice receiving P210 bcr/abl-transduced bone marrow. Blood. 92, 3780-3792 (1998).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Система Tet-onстабильные клеточные линииэкспрессия shРНКTet-репрессорвестерн-блоттингклонирующие цилиндрыдвойная селекциянокдаун гена
Генерация стабильных клеточных линий человека с Тетрациклин-индуцируемых (Тет-на) ShRNA или кДНК выражений
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.