Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Внеклеточно выявления моторных нейронов для бассейна мышц Motor в

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50189

⸱

25 марта 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biology, Case Western Reserve University , 2Department of Neurosciences, Case Western Reserve University , 3Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

У животных с большими определены нейронов ( Например, Моллюски), анализ двигатель бассейнов осуществляется с помощью внутриклеточных методы 1,2,3,4. Недавно мы разработали методику, чтобы стимулировать внеклеточно и записывать отдельные нейроны в Aplysia саЩогтса 5. Опишем протокол для использования этого метода, чтобы однозначно определить и охарактеризовать моторных нейронов в бассейне двигателя.

Аннотация

У животных с большими идентифицированными нейронами (например, у моллюсков) анализ моторных пулов проводится с использованием внутриклеточных методов1,2,3,4. Недавно мы разработали технику внеклеточной стимуляции и записи отдельных нейронов у Aplysia californica5. Теперь мы опишем протокол использования этого метода для уникальной идентификации и характеристики моторных нейронов в моторном пуле.

Этот внеклеточный метод имеет преимущества. Во-первых, внеклеточные электроды могут стимулировать и регистрировать нейроны через оболочку5, поэтому ее не нужно удалять. Таким образом, нейроны будут более здоровыми во внеклеточных экспериментах, чем во внутриклеточных. Во-вторых, если ганглии вращаются путем соответствующего закрепления оболочки, внеклеточные электроды могут получить доступ к нейронам по обе стороны ганглия, что облегчает и делает более эффективной идентификацию нескольких нейронов в одном и том же препарате. В-третьих, внеклеточные электроды не нуждаются в проникновении в клетки, и поэтому могут легко перемещаться вперед и назад между нейронами, нанося им меньший ущерб. Это особенно полезно, когда кто-то пытается записать несколько нейронов во время повторяющихся двигательных паттернов, которые могут сохраняться только в течение нескольких минут. В-четвертых, внеклеточные электроды более гибкие, чем внутриклеточные, во время мышечных движений. Внутриклеточные электроды могут вытягивать и повреждать нейроны во время мышечных сокращений. Напротив, поскольку внеклеточные электроды мягко прижимаются к оболочке над нейронами, они обычно остаются над тем же нейроном во время мышечных сокращений и, таким образом, могут использоваться в более интактных препаратах.

Чтобы однозначно идентифицировать моторные нейроны для моторного пула (в частности, мышцу I1/I3 у Aplysia) с помощью внеклеточных электродов, можно использовать признаки, которые не требуют внутриклеточных измерений в качестве критериев: размер и расположение сомы, аксональная проекция и иннервация мышц4,6,7. Для конкретного моторного пула, используемого для иллюстрации техники, мы записали данные из буккальных нервов 2 и 3 для измерения аксональных проекций и измерили силы сокращения мышцы I1/I3, чтобы определить характер иннервации мышц для отдельных моторных нейронов.

Мы демонстрируем полный процесс сначала идентификации моторных нейронов с помощью мышечной иннервации, а затем характеризуем их время во время двигательных паттернов, создавая упрощенный метод диагностики для быстрой идентификации. Упрощенный и более быстрый метод диагностики является лучшим для более интактных препаратов, например, в препарате суспензии буккальной массы8 или in vivo9. Этот процесс также может быть применен в других автопарках10,11,12 в Aplysia или в других животных системах2,3,13,14.

Протокол

1. Подготовка Запись Dish

  1. В ходе экспериментов датчик силы, щечной ганглиев, мозгового ганглия, и щечной массу помещают в круглом блюде Pyrex, который специализируется на силы исследованиях.
  2. Для стимулирования ingestive-подобных моделей в экспериментах, мы должны применить, не гидролизуемых холинергических карбахола агониста головного ганглия 15. Чтобы избежать прямого контакта с карбахола на щечной ганглиев и щечной массы, отдельные камеры необходимо, чтобы изолировать церебральный ганглий с щечной ганглиев и щечной массы (рис. 1).
  3. С щечной масса намного толще, чем ротовой ганглиев, они не будут размещены на том же уровне. Таким образом, это блюдо должно иметь резервную камеру для церебральный ганглий (область на рисунке 1), средней платформой для ротовой ганглиев (область C на рис 1), а гораздо глубже, передняя камера для ротовой массы (область D в рис. 1).
  4. Для создания этого блюда, начинается с круглым 100x15 Pyrex блюда (15 мм в высоту, 100 мм в диаметре). Строительство блюда потребуется несколько льется из Sylgard. Следуйте инструкциям, поставляемые вместе с продуктом Sylgard. Sylgard должно быть разрешено устанавливать между различными льет.
  5. Первый застывания является создание высокого уровня Sylgard в блюдо (область B на рисунке 1), которая является стеной между средней платформе и задняя камера.
  6. Используйте две подложки пластилина, чтобы изолировать область для Sylgard стены (область B на рисунке 1). Пальто пластилин подложки полиэтиленовой пленкой, где они будут обращаться в Sylgard для облегчения удаления. Убедитесь герметичности по краям, где пластилин свяжется с блюдом, чтобы свести к минимуму утечки.
  7. Залить Sylgard в часть между двумя подложками пластилин почти до верхней части блюда. Пусть Sylgard полностью установлена ​​на ночь. Ведение блюдо в теплом месте будет вызыватьбыстрой настройки. Снимите подложки пластилина и очистить любую глину остаток на Sylgard.
  8. Далее, задняя камера (область на рисунке 1) и средней платформе (область C на рисунке 1) следует вылить.
  9. Поместите поддержку пластилина около 5 мм от передней поверхности Sylgard для части среднего платформа (область C).
  10. Залить Sylgard в разделах для задней камеры (область) и средней платформе (область C) до высоты примерно 3-5 мм ниже верхнего уровня первого Sylgard стены (зона В). Sylgard поверхности задней камеры должна быть немного ниже, чем в среднем платформу, чтобы избежать утечки из задней камеры, содержащей карбахола к середине платформы. Опять же, пусть Sylgard полностью установлена ​​в течение ночи, а затем удалить поддержку пластилин.
  11. Последним шагом является сокращение выемку в середине Sylgard стены, чтобы обеспечить канал для церебрального-щечной связок (CBCS), чтобы перейтипутем между средним платформы и задней камерой. Ширина этой выемки должна быть примерно 3-4 мм, что является достаточно широкой для CBCS. В нижней части надреза не должна быть ниже, чем Sylgard поверхности середине платформы для предотвращения утечки. Скальпель может быть использован, чтобы сократить качеством.

2. Электрод подготовка

  1. Потяните внеклеточной стеклянные электроды из одноствольный капиллярной стекло с помощью Flaming-Brown микропипетки съемник как описано МакМанус и соавт. 8 в разделе 3.1. С FT345B нити в съемника, наших типичных настройках программы Тепло 480, тяги 50, скорость 13, а время 20, но отметим, что параметры будут различными для разных нитей. Эта программа создает электродов в односторонней с огня не полировки этапе. Размер конец электрода должен быть меньше, чем размер ячейки органов. Для моторных нейронов в диапазоне от 50 мкм до 400 мкм сома диаметр, внутренний diameteRS внеклеточных электродов стекло должно быть около 40 мкм, а их сопротивление должно быть около 0,1 Мом, когда они наполнены Aplysia физиологическим раствором.
  2. Вытяните всасывающий электроды из полиэтиленовых труб использованием газовой горелки. Вырежьте кусок полиэтиленовой трубки длиной около 10 см. Держа трубку на обоих концах и поместите его очень близко к пламени, производимое горелкой Бунзена при вращении трубки пока он не станет мягким от жары. Протяните трубу тщательно вдоль его длины при перемещении его от пламени. В средней части трубки будет удлиненные и узкие, как трубы тянут.
  3. Отрежьте трубку пополам, чтобы сформировать два электрода всасывания. Всасывание электроды, как правило, применяется к обрезанными концами нервов или мышц, хотя иногда они могут быть применены мимоходом.
  4. Создайте крючком электроды для нервов записи после протоколу, описанному МакМанус и др. 8 в разделах 3.2-3.13. Эти электроды especiсоюз полезно, когда нерв или мышцу не вырезано.

3. Вложение Hook электродов

  1. Препарировать животное и удалить щечной массы после протоколу, описанному в МакМанус и др. 8. Раздел 4.
  2. Для записи и стимуляции, крючок электроды могут быть присоединены к ряду различных нервов.
  3. Для характеристики моделей как это было сделано в естественных условиях на Cullins и Chiel 9, записи должны быть получены из I2 нервов и мышц, что указывает на затягивание фазы кормления 16, радулы нерва (RN), что указывает на закрытие пищи хапуга 17, щечной нерва 2 (BN2) и щечной нерва 3 (BN3), которые указывают на втягивание фазе 17,18. Крепление крючка электроды следует процедуре, аналогичной описанной на МакМанус и др. 8, раздел 5.
  4. Расположение этих нервов относятся к схеме аппарата кормления Aplysia показано наРисунок 2 из МакМанус и др. 8. Обратите внимание, что BN2 trifurcates в филиалах A, B, и C, прежде чем под I1 мышцы на боковой паз. Филиал является первой ветви отделить от основного ствола, и примыкает к BN3.
  5. Номенклатура отраслей A, B, и C был использован Warman и Chiel 18. Филиалы A, B, и C соответствуют ветви 3, 2 и 1, соответственно, в номенклатуру используемых Nargeot и соавт. 19. Кроме того, RN, BN1, BN2, и BN3 соответствуют нервам 1, 6, 5 и 4, соответственно, в номенклатуру используемых Кандель 20 и Scott и др. 21.
  6. Для изучения иннервации мышц I1/I3 мышцы, все нервы, кроме щечные нервы 2 будет отделена от ротовой массы во время экспериментов. Таким образом, мы использовали крючок электродов для записи с BN2.
  7. Поскольку I2 нерва и RN не будет прикреплен к ротовой масса, и они очень трудно получить доступ с помощью крюка электроды, предпочтительнее применять всасывающие электроды для записи с их вместо этого. Мы опишем применения всасывающих электродов в разделе 7.
  8. Используйте либо электрод крючок или всасывающих электродов для записи с BN3, потому что это легко получить доступ с использованием либо вид электрода. Мы решили использовать крюк электродов для записи BN3 свести к минимуму количество манипуляторов для проведения всасывающих электродов, и, чтобы сэкономить место для других манипуляторов и оборудования.
  9. Прикрепите крючок электрода на ветку из BN2 (BN2-а) инициировать отказ подобные модели в процессе экспериментов. Это полезно приложить дополнительный электрод крюк в BN2-на другую сторону, потому что некоторые нейроны реагируют по-разному в ипсилатеральной по сравнению с контралатеральной BN2-стимуляцию.
  10. Чтобы помочь отличить нейронов с односторонним против двусторонних прогнозам, онаТакже полезно прикрепить крючок электродов BN2 и BN3 на другой стороне ротовой ганглиев.

4. Ганглиев и мышечный препарат

  1. Щечной ганглиев, мозгового ганглия и щечной масса будет подготовлена ​​для экспериментов датчик силы, в которых церебральный ганглий прикреплен к щечной ганглиев через CBCS и щечной масса прикреплена к щечной ганглиев через BN2s только.
  2. После крепления крюка электродов, сократить щечные нервы 1 (BN1) и пищевода нерва (EN) в двустороннем, резка в точке крепления к щечной массы.
  3. Потяните церебральный ганглий вперед, чтобы переместить его из способов I2 мышцы. Сделайте надрез в I2 мышцы над радулы мешка, расширить разрез сбоку и спереди в обоих направлениях, и вытащить лоскут I2 мышцы вперед, чтобы разоблачить радулы нерва. Вырежьте два RN филиалов и убедитесь, что ветви достаточно долго для всасывания вложений электрода.
  4. Cоказанию в I2 сокращение широкий круг вокруг ротовой ганглиев, соблюдая осторожность, чтобы не порезать BN2s или BN3s, пока щечной ганглиев и пристроенной части I2 мышца может быть полностью отделена от ротовой массы. Вырезать двусторонних BN3s в точке крепления к щечной массы, за привязанность электрод крючком.
  5. Нанесите тонким слоем вакуумной смазки на выемку в записи блюдо описано выше, который соединяет заднюю камеру и среднего платформу, с помощью пипетки, чтобы поднять шарик вакуумной смазкой и распростерла его над качеством.
  6. Нанесите тонкий слой геля Быстрый супер клей для стекла нижней части передней камеры, где щечной массы будут размещены, только в передней части базы Sylgard средней платформе.
  7. Тщательно передачи головного ганглия, щечной ганглиев и щечной массы к записи блюдо (рис. 1), описанные в разделе 2, убедившись, что ни один из крюка электроды туго натянута, которые могут привести к повреждению нервов.
  8. Аккуратно положите щечной массы на клей в передней камере записи блюдо, чтобы его вентральной поверхности приклеивается к нижней части блюда. Будьте уверены, чтобы сохранить ганглиев и электроды от прикосновения к клею. Добавить Aplysia солевой 8 (460 мм NaCl, 10 мМ KCl, 22 мМ MgCl 2, 33 мМ MgSO 4, 10 мМ CaCl 2, 10 мМ глюкозы, 10 мМ MOPS, рН 7,4-7,5) к блюду, которое будет вызывать клей для установки.
  9. Если блюдо должно быть передано другому микроскоп для подготовки ротовой ганглиях внеклеточной записи сомы, быть очень осторожным с крюком электродов. Группа электродов на одной стороне ротовой массы вместе, а также группу электродов на другой стороне ротовой массы вместе. Осторожно держать электроды, держа в лаборатории ленту, которая охватывает разъема, снова убедившись, что ни один из электродов туго натянута.
  10. Когда блюдо расположена под микроскопом, электроды должны быть задрапированы мягко по сторонам блюдо и отдых на платформе рядом с блюдом.
  11. В перерывах между этапами эксперимента, аэрации раствора в ротовую камеры массового использования аквариума распылитель.
  12. Используйте пинцет, чтобы захватить оболочки головного ганглия и вытащить его в спину камеры, гарантируя, что CBCS запустить через вырез. Pin церебральный ганглий использованием нервов, кроме CBCS, чтобы избежать повреждения нетронутыми CBCS.
  13. Применить более вакуумной смазки на CBCS, а затем добавить еще Aplysia физиологическим раствором для обеих палатах блюдо, так что ганглиев они полностью погружены. Убедитесь, что в верхней части вакуумной смазки немного выше, чем Sylgard стене так, чтобы не происходило утечки будут происходить между камерами.
  14. Для стабилизации щечной ганглиев, первый контакт концов BN3s, то BN1s и ENs на Sylgard базе средней платформе (рис. 2). С BN3s будет записан при помощи крюка электродас, контакты должны быть помещены более дистально, чем точек крепления крюка электродов.
  15. Используйте два штифта, наклонилась на 90 градусов, как крюки, чтобы растянуть и закрепить CBCS, так что CBCS не будет повреждена (рис. 2).
  16. Придавить RN ветви между задней камеры и щечной ганглиев. Тогда I2 мышца будет на вершине RNs. Чтобы разоблачить I2 нерва, используйте щипцы, чтобы захватить I2 мышцы и потянуть его на щечной ганглиев. Pin двух углах I2 мышцы, чтобы избежать повреждения I2 нерва.
  17. Север I2 нерва дистальнее точки, в которой его две ветви сливаются в I2 мышцы. Убедитесь, что мышцы все еще ​​иннервируются быть сопоставимы с записями в естественных условиях. Срежьте остальные I2 мышц и перевернуть I2 нерва спину и придавить это между двумя ветвями RN (рис. 2, вставка).
  18. Отрегулируйте расположение контактов, чтобы растянуть и добавить напряженности, если нерв слишком свободно или снять напряжение, если нервове слишком туго. Для дальнейшей стабилизации щечной ганглиев, добавить больше контактов на оболочке между нервами.
  19. С щечной ганглии расположены хвостовые стороной вверх, поворот щечной ганглии, если нейроны интерес представляют на ростральной стороны. Чтобы повернуть одну из двух щечной ганглиев, использовать тонкий пинцет, чтобы захватить некоторый избыток оболочки CBC, где он находится рядом с щечной ганглиев и придавить это между BN2 и BN3. В некоторых ганглиях, он может быть более удобным придавить это между CBC и BN3.
  20. Добавить дополнительный вывод на оболочке ротовой ганглия на стороне ближе к передней камеры, чтобы минимизировать движение ротовой ганглия.
  21. Чтобы обрезать оболочкой, покрывающей щечной ганглиев, использовать тонкий пинцет, чтобы захватить оболочка на стороне ближе к задней камеры, а затем срезать избыток оболочку с мелкими ножницами, не подвергая клетку тела. Для того, чтобы свести к минимуму ущерб, только удалить минимальное количество оболочку необходимо видеть клеточных тел.
  22. После тОн оболочки ротовой ганглиев обрезается, потяните I2 нерва и RNs за ротовой ганглиев и прикрепить их вниз между щечной ганглиев и передняя камера для дальнейшего поворота щечной ганглиев. (См. Рисунок 2).
  23. Чтобы смыть оставшийся хлорид магния 8, который был использован для анестезии животных до рассечения, заменить солевые Aplysia в блюдо со свежим солевым Aplysia.

5. Электрического соединения Hook Электроды

  1. После ганглиев и мышцы готовы, обязательно передать блюдо к столу виброизоляции для экспериментов.
  2. Приложите все контакты электрода к их гнездам BNC кабелей, которые подключаются к усилителям (AM системы модели 1700 усилитель). Опять же, убедитесь, что электроды не туго натянута, делая это. Убедитесь, что электроды правильно, связанных с их соответствующими кабелями и что полярность правильная.

6. Настройка внеклеточной стеклянные электроды для записи Сома

  1. Заполнить электрод с Aplysia раствора, используя шприц прилагается к части полиэтиленовых труб составляет около 15-20 см. Прикрепите свободный конец полиэтиленовой трубки к концу стеклянного электрода. Отойдите назад на поршень шприца, чтобы заполнить электрод с Aplysia физиологическим раствором.
  2. Поместите заполненные внеклеточных электродов стекло в паз держателя на манипуляторе. Используйте манипулятор для размещения электрода в солевой Aplysia содержащие щечной ганглиев.
  3. Вставьте серебра / хлорида серебра провода припаять к мужской контактный разъем золота в электрод в качестве записи проволоки. Поместите другой серебра / хлорида серебра провода припаять к мужской контактный разъем золото непосредственно в солевой Aplysia в разделе Запись блюдо с щечной ганглиев в качестве опорного провода. Подключите оба йЗапись е и ссылки провода к BNC кабель, который подключается к усилителю.
  4. Если есть достаточно места для более манипуляторы, дополнительные внеклеточной стеклянные электроды могут быть добавлены к записи нескольких нейронов одновременно.

7. Настройка всасывания Электроды для нервов Recordings

  1. Обрежьте узкий конец всасывающего электрода в соответствии с диаметром нерва. Внутренний диаметр электрода должна быть аналогичной или немного меньше, чем диаметр нерва обеспечить плотный всасывания.
  2. Поскольку I2 нерва и RN очень близко друг к другу, их электроды могут быть проведены одним и тем же манипулятором для экономии места. Поместите двумя электродами в две ступени одного и того же владельца. Поворот двумя электродами и убедиться, что их советы близки друг к другу. Выберите один из них для I2 нерва записи, другой для записи RN.
  3. Поместите кончик электрода в солевой Aplysia в Recordinг блюдо с щечной ганглиев. Прикрепите свободный конец полиэтиленовой трубки на шприц с всасывающим электродом. Используйте шприц, чтобы заполнить электрод с Aplysia физиологическим раствором. Перемещение электрода близко к концу целевой нерва, т.е. I2 нерв, и с помощью шприца сосать нерва в электроде. Длина нерв внутри электрода должна быть около 0,5-1,0 мм для обеспечения герметичности.
  4. Повторите всасывания электрод, который будет прикреплен к RN.
  5. Подключите электроды к соответствующим BNC кабелей, как описано в разделе 6.3.

8. Настройка датчик силы для измерения I1/I3 сокращения мышц

  1. Для подключения датчиков силы в мышцах, использовать шелковые нити. Согните изогнутой иглой каждого шва, и связать нить в силу преобразователя. Аккуратно возьмите и поднимите небольшое количество мышц пинцетом и, держа иглу в другой набор щипцов, вставьтеиглу в мышцу до изогнутой точку в иглу (рис. 1).
  2. Преобразователи могут быть прикреплены либо сверху или сбоку на I1/I3 мышцы. Спинной вложений позволяет измерять сокращений вызвана активацией левой или правой стороны мышц. Боковое крепление покажет сильные силы для большинства нейронов, но только позволит измерения сокращения на стороне к которой крепится датчик.
  3. Чтобы определить нейроны, которые могут активировать переднего, заднего или обоих регионах I1/I3, прикрепить датчик силы в задней части мышц, только впереди глотки ткани и приложите еще один датчик силы к передней части мышцы, на челюсти (рис. 1, к сведению крючков).
  4. Поднимите датчиков силы, пока швы натянуть, но не затягивать. Чтобы проверить это, просмотрите измерения с датчиком силы, когда шов имеет некоторую слабину ят, а затем поднимите преобразователь до измерения находится чуть выше этого базового уровня.

9. Определение моторных нейронов в пределах бассейна Motor

  1. Этот протокол описывает процесс внеклеточно выявления моторных нейронов в бассейне двигателя. Мы использовали AxoGraph программное обеспечение для мониторинга активности отдельных нейронов, несколько нервов и мышц (ЭМГ сигнала или сокращения сил). В этом протоколе, мы использовали сокращение силы мышц в качестве иллюстрации к процессу выявления моторных нейронов, в других экспериментах мы использовали EMG, а также и настройки для таких экспериментов очень похожи (см. Обсуждение).
  2. Чтобы найти кандидата нейрона, использовать манипулятор аккуратно нажмите кончиком внеклеточной стеклянный электрод вниз на оболочку над центром нейрона Сома 5 (рис. 3), который является лучшим местом для стимуляции и записи селективности 5. Так как пороговый ток Fили активации нейронов увеличивается линейно с электродом к сому расстояние 5, стимулирование селективности станет еще хуже, когда электрод отошел от центра мишени нейрона к соседнему нейрону.
  3. Чтобы определить двигательный нейрон, сначала непосредственно стимулирует нейрон помощью внеклеточных электродов стекла, чтобы гарантировать, что только этот нейрон стреляет, и рассмотреть ли он иннервирует мышцы. Тогда, внеклеточно запись из этого нейрона создать один-к-одному между внеклеточной записи сомы и нервов записей, которые также важны для идентификации нейронов.
  4. Так как большинство внеклеточной усилителей не позволяет одновременную стимуляцию и запись в канал, установить канал используется для стимуляции и записи сомы (сомы канал) на стимуляцию режима и применять краткую анодного тока (например, 6 мс для нейронов Aplysia 5) к сомы (рис. 4А, 5А; записке стрелки 1 яп обе цифры), начиная с малых токов (например, 200 мкА), и постепенно увеличивая ток до нейрона очередями.
  5. После активации нейрона к разрыву, следует немедленно выключить сома канала от стимуляции режима в режим записи (рис. 4А, 5А; записке стрелки 2 на обоих рисунках). Тем не менее, все еще будет задержка между стимуляцией сомы и записи из-за человеческой задержки ответа.
  6. Если нейрон пожаров в течение разумного периода времени, она должна быть возможность наблюдать один-к-одному соответствующие потенциалы действия от сомы записи и на нерв (ы), через которые нейрон проектов (рис. 4б, 5б, к сведению пунктирной линией ), а также сил, возникающих при нейрона (рис. 4А, 5А; записке синие). Если нейрон прекращает стрельбу перед записью сома начинается, увеличения текущей чтобы активировать его в течение длительного времени.
  7. Отношение сигнал-шум внеклеточногозаписи зависит от расположения электродов и сомы размером. Внеклеточной записи будет становиться все больше, как увеличение размеров сома и электрода к сому расстояние уменьшается. Так как только шум колеблется в узком диапазоне, сигнал-шум будет также увеличиваться по мере увеличения размеров сома и электрода к сому расстояние уменьшается. Наиболее распространенный диапазон сигнал-шум составляет от 4:1 до 8:1.
  8. Моторные нейроны могут быть определены на основе их характеристик, таких как сомы месте, нервов и мышц проекции иннервации 4,6,7. Поскольку только два BN2s крепятся к щечной массы, путем мониторинга деятельности на BN2s, можно убедиться, что силы сокращения мышц вызывает лишь нейрон активируется внеклеточной стимуляции.
  9. Например, B3 представляет собой большой двигательный нейрон для I1/I3 мышц (300-400 мкм в диаметре сома на животных весом от 200 до 350 граммов), расположенный на ростральной части щечной ганглии (рис. 3 ). Это только проекты через ипсилатерального BN2, и иннервирует как в передней и задней частях I1/I3 мышцы. Большую часть времени, активация он генерирует большую, чем передние задние силу (8 из 9 опытов).
  10. После нейрона определяется, ее деятельность может быть записана в различных кормления типа поведения с помощью внеклеточных стеклянный электрод (рис. 4 и 5), которая может быть вызвана как описано ниже. Внеклеточной записи на сома будет гораздо более конкретными, чем нерв записей, которые включают в себя деятельность различных нейронов.
  11. Для стимулирования egestive подобных программ двигателя, стимулируют BN2-с 1-2 мин импульсов 19 (2 Гц, каждого импульса составляет 1 мс). Эта стимуляция надежно генерирует egestive моделей в этой обстановке. При наличии достаточного тока (например, 300 мкА), модели могут сохраняться в течение всего срока стимуляции. Иногда там будет еще одна модель, которая происходит вскоре послестимуляция заканчивается.
  12. Для стимулирования ingestive подобных программ двигателя, поместите несколько кристаллов твердых карбахола непосредственно на оболочку головного ганглия 15. Если кто-то хочет, чтобы контролировать уровень воздействия карбахола, используют решения от 1 до 10 мМ карбахола в Aplysia физиологическим раствором. Более высокие концентрации, более вероятно, чтобы вызвать ответ. Повторяющиеся модели обычно начинаются в течение пяти минут, и может длиться в течение примерно десяти до пятнадцати минут до начала стекать.
  13. После вымывания карбахола несколько раз и ждут, по крайней мере 30 минут, последующее применение карбахола могут быть добавлены к коре головного ганглия, чтобы вызвать более ingestive-подобных моделей двигателя.
  14. После нескольких моторных нейронов для конкретного бассейна двигателя были идентифицированы и охарактеризованы в двигатель программы, можно развить значительно упрощает диагностический метод, который требует минимальной информацией для быстрого выявления этих нейронов в будущей работе (рис. 6 </ STRONG>), например, в подвешенном щечной подготовки массы или в естественных условиях. Эти критерии могут включать размер и расположение сомы, нервные проекции, размер блока на нервы, и время активности во время двигатель модели.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунках 4 и 5 показаны типичные результаты используются для определения двух I1/I3 моторных нейронов. Рисунок 4 показывает сома записи больших моторных нейронов, B3, во время egestive-как и ingestive-подобных моделей (рис. 4C, 4D). Один к одному соответствующие шипы на канале сомы и ипсилатерального канала BN2 (рис. 4E) показывают, что специфика записи B3 сома сохранялось в течение моделей. B3 пожары в середине-конце отвода фазы мод...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

У животных с большими определены нейронов, таких как моллюски (например, Lymnaea, Helix, и Aplysia), анализ двигатель бассейны, как правило, осуществляется с помощью внутриклеточной регистрации 1,2,3,4. В этом протоколе, мы опишем процесс для уникальной идентификации моторных нейронов для двигателя бассейна с помощью внеклеточных техники. Мы использовали силу измерений В качестве иллюстрации этого процесса. Можно также использовать для измерения ЭМГ мышц иннервации. Короче говоря, сделать та...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом NS047073 NIH и NSF гранта DMS1010434.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Имя Компания Номер в каталоге Комментарии
Хлористый натрий Fisher Scientific S671 Биологическая, сертифицированный
Хлористый калий Fisher Scientific P217 Сертифицированный ACS
Гексагидрат Хлорид магния Acros Organics 19753 99%
Гептагидрата Магния сульфат Fisher Scientific M63 Сертифицированный ACS
Дигидрата хлорида кальция Фишер Scientifc C79 Сертифицированный ACS
Глюкоза (декстроза) Sigma-Aldrich G7528 BioXtra
MOPS Buffeг Acros Organics 17263 99%
Карбахола Acros Organics 10824 99%
Едкий натр Fisher Scientific SS255 Сертифицированный
Соляная кислота Fisher Scientific SA49 Сертифицированный
Одноствольный капиллярные стеклянные AM системы 6150
Flaming-Brown микропипетки съемник модели P-80/PC Sutter Instruments Накаливания используется: FT345B
Эмаль покрытием проволоки из нержавеющей стали Калифорния тонкой проволоки 0.001D, покрытие ч
Бытовая II силиконовый клей GE
Duro быстрого гель суперклея Henkel Corp.
AM системы модели 1700 усилителю AM системы Настройки фильтра: 10-500 Гц для I2 нерв / мышцу; 300-500 Гц для всех других нервов
Pulsemaster Multi-Channel стимулятор Инструменты Всемирной Precision A300
Стимул изолятор Инструменты Всемирной Precision A360
AxoGraph X AxoGraph Научные Программное обеспечение для записи
Золото контактный разъем Bulgin SA3148 / 1
Золотой разъем Sockets Bulgin SA3149 / 1
Sylgard 184 Силиконовый эластомер Dow Corning
100 х 15 мм Crystalizing Dish Пирекс
Высокая смазка вакуумная Dow Corning
Внесите Советы Fisher Scientific 21-375Д
Minutien Pins Средства изобразительных наук 26002-10
Пластилин Сарджент искусства 22-4400
Шепот Воздушный насос Tetra 77849
Аквариум трубы Eheim 7783 12/16 мм
Elite Распылитель Hagen A962
Vannas Весна Ножницы Средства изобразительных наук 15000-08
Дюмон # 5 Fine щипцы Изобразительное Sciencе Инструменты 11254-20
Kimwipes Kimberly-Clark 34155

Ссылки

  1. McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
  2. Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
  3. Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
  4. Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
  5. Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
  6. Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
  7. Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
  8. McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320(2012).
  9. Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791(2010).
  10. Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
  11. Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
  12. Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
  13. Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
  14. Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
  15. Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
  16. Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
  17. Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
  18. Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
  19. Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
  20. Kandel, E. R. Behavioral biology of Aplysia. , Freeman. San Francisco. (1979).
  21. Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
  22. Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
  23. Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
  24. Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
  25. Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
  26. Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
  27. Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
  28. Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
  29. Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
  30. Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -H., Möller, A. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. Baudry, M., Taketani, M. , Springer Press. New York. 24-37 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Внеклеточно выявления моторных нейронов для бассейна мышц Motor в
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.