Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Метаболический маркировки Недавно Transcribed РНК за большой размер профилирования экспрессии генов синтеза РНК, производство и разложение в культуре клеток

27K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50195

⸱

8 августа 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Max von Pettenkofer Institute, 2Department of Medicine, University of Cambridge, 3Institute for Informatics, Ludwig-Maximilians-University Munich

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Всего клеточной РНК обеспечивает плохое шаблон для изучения краткосрочных изменений в синтез РНК и распада, а также кинетики процессинга РНК. Здесь мы описываем метаболический маркировки вновь транскрипции РНК с 4-тиоуридина последующим тиол-специфический биотинилирования и очистки вновь транскрипции РНК позволяющих преодолеть эти недостатки.

Аннотация

Развитие целого транскриптома микрочипы и следующего поколения секвенирования революцию в нашем понимании сложности клеточной экспрессии гена. Наряду с лучшего понимания молекулярных механизмов, вовлеченных, точные измерения основных кинетики становятся все более важными. Здесь эти мощные методологии сталкиваются с серьезными ограничениями в силу внутренних свойств шаблона образцы, которые они изучают, т.е. общей клеточной РНК. Во многих случаях изменения общей клеточной РНК происходить либо слишком медленно или слишком быстро, чтобы представлять основные молекулярные события и их кинетики с достаточным разрешением. Кроме того, вклад в изменение синтеза РНК, обработки и распада не легко дифференцированы.

Мы недавно разработали высокого разрешения профилирования экспрессии генов для преодоления этих ограничений. Наш подход основан на метаболические маркировки вновь транскрипции РНК с 4-thiouriеды (так называемый также 4SU-тегов), а затем строгий очистки вновь транскрипции РНК с использованием тиол-специфический биотинилирования и покрытые стрептавидином магнитные гранулы. Он применим к широкому кругу организмов, включая позвоночных, дрозофилы и дрожжей. Мы успешно применяется 4SU-тегов для изучения реального времени кинетики активности транскрипционных факторов, обеспечивают точные измерения РНК период полураспада, и получить новые понимания кинетики процессинга РНК. Наконец, компьютерное моделирование может быть использовано для создания комплексного, всестороннего анализа основных молекулярных механизмов.

Введение

Профилирования экспрессии генов является ключевым инструментом, используемым для изучения клеточных процессов и связанных с ними сложная сеть взаимодействий. Исследования по мРНК изобилие как правило, были методом выбора для получения основной проницательности в основные молекулярные механизмы. Развитие целого транскриптома микрочипов 1 и, совсем недавно, следующего поколения секвенирования РНК (РНК-SEQ) 2-4 подпитывается этот подход. Однако эти технологии пока революцию в нашем понимании сложности клеточной экспрессии гена, они сталкиваются с серьезными ограничениями в силу внутренних свойств их шаблон образца, т.е. общей клеточной РНК. Во-первых, краткосрочные изменения общего уровня РНК не соответствуют изменениям в транскрипции ставки, но по своей природе в зависимости от РНК полураспада соответствующих транскриптов. В то время как пятикратный индукции недолгим стенограммы, например, кодирование для фактора транскрипции, будет легко обнаружить в общей РНКв течение часа, то же индукция долгоживущих стенограммы, например, кодирование для метаболических ферментов, останется практически невидимым. Кроме того, даже полное отключение (> 1000 раз понижающая регуляция) в транскрипции скорость средний ген РНК полураспада пяти часов будут просто принимать пять часов для общего уровня РНК уменьшить лишь два раза . Таким образом, анализ общей РНК способствует обнаружению повышающей регуляции недолго транскриптов, многие из которых кодируют факторы транскрипции и гены регулирующие функции 5. Кроме того, истинная кинетическая каскад регулирования затемняется и первичных сигнальных событий не может быть дифференцирована от вторичной. И, в свою очередь, может привести к существенной смещение в последующих анализов биоинформатики. Во-вторых, изменения в общих уровней РНК не могут быть отнесены к изменениям в синтез РНК или распада. Измерения последние требуют инвазивных подходов клетки, например, блокирование transcriptiпо использованию актиномицином D 6 и расширенный мониторинг текущих распада РНК с течением времени. При средней мРНК период полураспада в клетках млекопитающих, 5 - 10 ч 5,7, уровни мРНК большинство генов только уменьшились на менее чем в два раза после нескольких часов транскрипционный сердца. Эти довольно небольшие различия привести грубую и неточную мРНК измерений периода полураспада для большинства клеточных генов в связи с экспоненциальным характером основного математических уравнений. Наконец, в то время как РНК-сл полной клеточной РНК показал, что приблизительно половина наших генов могут быть альтернативные сплайсинга 8, лежащие в основе кинетики, так и динамических механизмов направляющий ткани и зависит от конкретных условий регулирования процессинга РНК еще мало изучены. Кроме того, вклад процессинг РНК к дифференциальной экспрессии генов, в частности для некодирующих РНК, еще предстоит определить. В целом, эти ограничения представляют собой серьезные препятствия длябиоинформационных кинетических моделей основных молекулярных механизмов.

Недавно мы разработали подход, названный высоким разрешением профилирования экспрессии генов, чтобы преодолеть эти проблемы 5,7,9. Он основан на метаболические маркировки вновь транскрипции РНК с использованием 4-тиоуридина (4SU-тегов), встречающегося в природе уридином производной, и обеспечивает прямой доступ к новой транскрипции стенограммы с минимальным вмешательством в рост клеток и экспрессии генов (см. Рисунок 1) 5, 10-12. Воздействие эукариотической клетки 4SU приводит к ее быстрому поглощению, фосфорилирования 4SU-трифосфат, и включения в новый транскрипции РНК. После выделения общей клеточной РНК, 4SU-меченой РНК фракции тиол-конкретно биотинилированный генерации дисульфидную связь между биотин и вновь транскрипции РНК. "Общую клеточную РНК 'может быть количественно разделить на помечены (' вновь транскрипции ') и немеченого (' предварительно existinг ') РНК с высокой чистотой использованием покрытых стрептавидином магнитных шариков. Наконец, меченой РНК выделяют из шариков путем простого добавления восстанавливающего агента (например дитиотреитола) расщепление дисульфидных связей и выпуск новой транскрипции РНК из шариков.

Недавно транскрипции РНК изображает транскрипционной активности каждого гена в течение срока от 4SU экспозиции. 4SU-тегов в сроки минут таким образом, обеспечивает картинку эукариотической экспрессии генов и идеальный шаблон для вниз по течению биоинформатики анализов (например, промоутер анализ). В случаях, когда стационарных условиях можно предположить, отношения вновь транскрипции / общий, недавно транскрибируется / немеченными и немеченым / общей РНК обеспечивает неинвазивный доступ к точной РНК полураспада 7,13. Кроме того, важно отметить, что недавно транскрипции РНК очищенный после всего лишь 5 мин 4SU-тегов (5 мин 4SU-РНК) моложе 15 и 60 мин 4SU-РНК.При выполнении как ультра-короткие и прогрессивно больше 4SU-тегов в одну экспериментальную установку в сочетании с РНК-SEQ, кинетика процессинг РНК выявлены у нуклеотидных резолюции 9. Наконец, время курса анализы вновь Записал и общей РНК в сочетании с компьютерного моделирования позволяют интегративный анализ синтез РНК и распада 14.

В заключение, этот подход позволяет для прямого анализа динамики синтеза РНК, обработки и деградации в эукариотических клетках. Она применима во всех основных модельных организмов, включая млекопитающих, насекомых (Drosophila), земноводные (Xenopus) и дрожжи 5,15,16. Это непосредственно совместимы с анализ микрочипов 5,17 РНК-далее 9,13,14 и применимо в естественных условиях 12,15. Здесь мы подробно описываем методику на этикетке, изолировать и очистить вновь транскрипции РНК в культивируемых клетках млекопитающих. Кроме того, потенциометрдр. проблем и подводных камней, обсуждаются.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Метаболический маркировки с 4-тиоуридина

Сделать подробный план экспериментальной установки / по расписанию, например, когда, чтобы добавить 4SU в культуре клеток и, когда собрать образцы. План, по крайней мере 5 мин между каждым состоянии. Только лечить клетками одно условие за один раз. Ручка макс. 3 - 5 блюд в данный момент времени. Ручка клетки как можно быстрее, чтобы свести к минимуму изменения температуры и уровень СО2. Избегайте воздействия на клетки яркий свет после 4SU добавляется как это может привести к сшиванию 4SU-меченой РНК с клеточными белками.

Начало маркировки

  1. Оттепели 4-тиоуридина (4SU) непосредственно перед использованием и пипеткой требуемое количество 4SU для каждого условия в стерильную пробирку Фалькон.
  2. Отобрать необходимое количество клеточной культуральной среде (5 мл на 10 см чашку) от тарелки и добавить к 4SU содержащие трубки сокола и тщательно перемешать. Снимите и выбросьте оставшийся среды из блюд.
  3. Применить 4SU среде, содержащей Вернуться к блюдам.

Конец маркировки

  1. Удалите среду культуры клеток из клеток. Добавить 5 мл Trizol К каждой пластине. Для сложных экспериментов в том числе различные моменты времени или условий, этот шаг лучше всего сделать два человека, один удаления среды, другой добавления Trizol и уборки лизата.
  2. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре в течение полного лизиса клеток.
  3. Используйте пипетки на 10 мл для промывки пластины тщательно с дополнительным Trizol. Это помогает полный лизис клеток и восстановления образца. Обращаться с осторожностью, поскольку Trizol крайне опасно при попадании на кожу или в глаза! Есть противоядие фенола ожогов под рукой (например, полиэтиленгликоль 300 или 400 в технический денатурат (70:30)). Передача образцов в полипропиленовые пробирки. Обратите внимание, что стандартные труб Сокол не противостоять этим силам высокие г). Образцы можно хранить при -20 ° С в течение по крайней мере одного месяца до полной РНК яс готовым.

2. Получение РНК с использованием модифицированного протокола Trizol

  1. Добавить 1 мл хлороформа (0,2 мл на мл Trizol) и энергично встряхивают в течение 15 сек. Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 - 3 мин.
  2. Центрифуга при 13000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
  3. Передача водный верхнюю фазу (содержащую РНК) в новую 15 мл полипропиленовую пробирку.
  4. Добавьте ½ реакционного объема и РНК осадки буфер и изопропанола (например, до 3 мл надосадочной жидкости добавляют 1,5 мл РНК осадки буфера и 1,5 мл изопропанола).
  5. Хорошо перемешать. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
  6. Центрифуга при 13000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант.
  7. Спином вниз кратко (5000 × г в течение 30 сек) и удаления остаточного изопропанола с 200 мкл пипетки.
  8. Добавить равный объем 75%-ного этанола и встряхнуть трубку, пока осадок отделяется. Избегайте разбив его на множество мелких частей, как это может сделать удаление остатковл этанола трудно.
  9. Центрифуга при 13000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Удалите супернатант.
  10. Спином вниз РНК коротко и удалить остатки этанола с 200 мкл пипетки. Повторите шаг и удалить остатки этанола с 20 мкл пипетки. После этих двух шагов, без дальнейшей сушки гранул должна быть выполнена.
  11. Добавить 100 мкл H 2 O на 100 мкг РНК ожидается выход и хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 - 6 раз, чтобы помочь в растворении РНК.
  12. Растворить и денатурации РНК при нагревании до 65 ° С в течение 10 мин (шейкер) и сразу же помещают на лед.
  13. Измерение концентрации РНК при 260 нм с использованием спектрофотометра NanoDrop, следуя инструкциям производителя. Эта РНК можно хранить при -80 ° С в течение по крайней мере одного месяца.

3. Тиол конкретных Биотинилирование Недавно Transcribed РНК

  1. Начнем с 60 - 80 мкг полной клеточной РНК.
  2. Составляют маркировки реакции. Пипетка в следующихпоручения (за мкг РНК):
    1. 1 мкл 10х буфера Биотинилирование
    2. 7 мкл РНК (содержащего 1 мкг РНК разводят в нуклеазы без H 2 O)
    3. 2 мкл биотин-HPDP (1 мг / мл ДМФА)

Всегда добавляйте биотин-HPDP последний немедленно и смешайте с помощью пипетки. В случае, биотин осадка, ДМФ содержание может быть увеличено до конечной концентрации 40%.

  1. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1,5 часов с вращением.
  2. Добавить равный объем хлороформа. Смешайте энергично. Выдержите в течение 2 - 3 минут, пока фаз не начинают отделяться и пузыри начинают исчезать.
  3. Центрифуга при 20000 х г в течение 5 мин при 4 ° С. Тщательно передачи верхней водной фазы в новую пробирку.
  4. Повторите шаги 3.4 и 3.5 раза. Вы можете выполнить этот шаг в 2 мл Phase Lock Гель толстостенных труб для уменьшения потери РНК.
  5. РНК осадков: добавить 1/10 объема 5 М NaCl и равного объемаизопропанола в водной фазе.
  6. Центрифуга при 20000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  7. Добавить равный объем 75%-ного этанола, центрифугируют при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С, отбросить супернатант.
  8. Спин коротко и удаления остаточного этанола с 200 мкл пипетки.
  9. Спин коротко и удаления остаточного этанола с 20 мкл пипетки.
  10. Не допускать РНК высохнуть. Повторное приостановить его в 50 - 100 мкл H 2 O (~ 1 мкл на 1 мкг входного РНК). Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 - 6 раз.
  11. Проверьте качество РНК электрофоретического анализа, чтобы исключить деградации РНК.

4. Дот-блот анализ 4SU-включения (необязательно)

4SU ​​регистрации может быть легко определено дот-блот-анализ биотинилированных РНК. Это необязательный шаг, который позволяет устранения неисправностей и оценки 4SU цены по отношению к включению контрольной ДНК биотинилированных олиго. Для этого анализа мы тecommend использованием йодацетильную-биотин вместо биотин-HPDP для биотинилирования 4SU-меченой РНК в пункте 3.2. Это приводит к необратимому биотинилирования 4SU-РНК. Таким образом, на основе столбцов методами (например RNeasy) может быть использован для восстановления значительно меньших количествах биотинилированного РНК (например, 5 мкг). В то время как РНК биотинилированный использованием биотин-HPDP также подходит для этого анализа, результирующий сигнал слабее и отношение сигнал-шум менее благоприятной (фиг. 3).

  1. Следуйте 4SU протокол для маркировки и выделения общей клеточной РНК, как описано в разделах 1 и 2.
  2. Biotinylate 4SU-меченой РНК, как описано в разделе 3 заменив биотин-HPDP с йодацетильную-биотин и выполняют две хлороформом, чтобы полностью удалить чрезмерное йодацетильную-биотин остатков.
  3. Восстановление биотинилированного РНК изопропанол / осаждение этанолом, как описано, или с использованием колонки подход (например RNeasy) в случае небольших количеств РНК (<10 мкг) Используются.
  4. Выдержите мембраны Zeta в нуклеазы без воды с качания в течение 10 мин.
  5. Возьмите мембрана из нуклеазы без воды и удаления избытка жидкости путем размещения мембраны в период между двумя чистыми полотенцами бумаги и сильно нажимая. Воздушной сушки мембраны в течение 5 мин приведет к более хорошей точки.
  6. Для каждого образца, готовят 20 мкл 200 нг / мкл РНК с использованием ледяной дот-блот-связывающем буфере (10 мМ NaOH, 1 мМ ЭДТА). Применение 5 мкл этого раствора (т.е. 1 мкг РНК), а также трех последующих 10-кратного разведения (например, 100, 10 и 1 нг РНК соответственно) на мембрану Zeta с помощью пипетки. Пипетирование через пустой стойке пипеток можно использовать для обеспечения равномерно распределен интервал. Кроме того, использование аппарата дот-блот в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Применение 5 мкл меченного биотином олигонуклеотидов ДНК в концентрациях от 20 нг / мкл до 20 пг / мкл (то есть от 100 до 0,1 нг олиго) в качестве положительного продолжениерол на мембрану с помощью пипетки. Используйте биотинилированными 4SU-наивные образца в качестве отрицательного контроля.
  8. Воздушной сухой мембраны в течение 5 мин.
  9. Инкубируйте мембраны в течение 30 мин в 40 мл блокирующего буфера с качалки.
  10. Инкубируйте мембраны с 10 мл 1:1000 стрептавидин-пероксидаза хрена в течение 15 мин (5 мл PBS + 5 мл 20% SDS + 10 мкл стрептавидин-пероксидаза хрена)
  11. Мытье мембраны дважды в 40 мл PBS + 10% SDS (20 мл PBS + 20 мл 20% SDS) в течение 5 мин.
  12. Мытье мембраны дважды в 40 мл PBS + 1% SDS (38 мл PBS + 2 мл 20% SDS) в течение 5 мин.
  13. Мытье мембраны дважды в 40 мл PBS + 0,1% SDS (40 мл PBS + 200 мкл 20% SDS) в течение 5 мин.
  14. Удалить излишки жидкости путем размещения мембраны в период между двумя чистыми бумажными полотенцами и нажав на них твердо.
  15. Визуализируйте мембраносвязанные HRP использованием ECL соответствии с инструкциями производителя.
  16. Поместите мембраны в пленку / мешок, удаления пузырьков воздуха и инкубировать в течение 2 мин в темноте.
  17. Expose мембраныфильм в течение 1 - 5 мин.

5. Разделение мечеными и немечеными РНК с использованием Стрептавидин-магнитных шариков, покрытых

  1. Тепло промывочным буфером (3 мл на образец) до 65 ° С на водяной бане.
  2. Подготовьте свежий 100 мМ дитиотреитола (DTT) в нуклеазы без H 2 O. Сделайте так, отстаивают 15 - 30 мг DTT порошок в чистый 50 мл Сокол трубки размещены на ультра-тонкого масштаба. Взвесьте и добавьте необходимое количество нуклеазы без H 2 O.
  3. Тепло биотинилированный образцы РНК до 65 ° С в течение 10 минут для денатурации и сразу же помещают на лед.
  4. Место μMacs столбцов в магнитную подставку. Мы рекомендуем не обрабатывать более 12 образцов одновременно (6 - 8 проб оптимальны).
  5. Предварительно равновесие Miltenyi колонн с 1 мл комнатной температуры промывочного буфера. Это займет около 15 мин.
  6. Между тем, добавляют 100 мкл шариков стрептавидином до 50 - 100 мкл биотинилированного РНК. Инкубируют при комнатной температуре в течение 15 мин с вращением.
    7. < литий> Если любой из столбцов не инициировал слива уже это может способствовать легком нажатии на верхнюю часть колонны с палец в перчатке. Как только поток начал столбцов легко слить.
  7. Применить РНК / шарики к колоннам. Откажитесь от проточных если вы не хотите, чтобы восстановить немеченой фракций РНК (см. раздел 7).
  8. Вымойте три раза с 0,9 мл 65 ° C стиральными буфер (1 мл пипеток уменьшаться, когда пипетки буферов при 65 ° C).
  9. Мытье три раза с 0,9 мл комнатной температуры промывочного буфера.
  10. Внесите 700 мкл буфера RLT (RNeasy Kit Очистка MinElute, Qiagen) в новые 2 мл пробирок и поместите их под колоннами.
  11. Элюировать вновь транскрипции РНК в RLT буфер добавлением 100 мкл 100 мМ DTT в столбцах.
  12. Выполните второй элюирования раунд 3 минут позже в ту же трубу, добавив еще 100 мкл 100 мМ DTT.

6. Восстановление Недавно Transcribed РНК

ontent "> Продолжить RNeasy Очистка MinElute (Qiagen) протокол в соответствии с инструкциями производителя. Elute в 25 мкл нуклеазы без H 2 O. измерения концентрации РНК с использованием спектрофотометра Nanodrop. Чтобы избежать необходимости оттаивать и повторно заморозить РНК перед отправкой его высокой пропускной способности анализа, рекомендуется подготовке кДНК сразу же после недавно транскрипции РНК очищали. Использование 2,5 мкл вновь транскрипции РНК в 20 мкл кДНК, смесь синтез для синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. Выполнить QRT-PCR управления, используя один : 10 разведений кДНК смесь магазин РНК при -80 ° С..

7. Восстановление без маркировки, несвязанный РНК (необязательно)

В случае несвязанного РНК должна быть восстановлена, собирать и комбинировать проточные (после добавления РНК-стрептавидин бисер решение столбцы) и первой стирки для последующего осаждения. Обычно достаточно, чтобы осадить только 50% от несвязанного РНК, как эту темусек будет содержать> 80% от исходного материала.

  1. Добавить равным объемом изопропанола (соль не должен быть добавлен в качестве промывочного буфера уже содержит 1 М NaCl).
  2. Центрифуга при 20000 х г в течение 20 мин при 4 ° C. Удалите супернатант.
  3. Добавить равный объем 75%-ного этанола, центрифугируют при 20000 х г в течение 10 мин при 4 ° С, отбросить супернатант.
  4. Спин коротко и удаления остаточного этанола с 200 мкл пипетки.
  5. Спин коротко и удаления остаточного этанола с 20 мкл пипетки.
  6. Не допускать РНК высохнуть. Ресуспендируйте это в 100 мкл H 2 O. Хорошо перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 5 - 6 раз. Инкубируют при 65 ° С в течение 10 мин при встряхивании и передавать непосредственно в лед.
  7. Проверьте качество РНК электрофоретического анализа, чтобы исключить деградации РНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

1. Исходного материала и ожидаемых выходов

После 1 часа (ч) 4SU экспозиции вновь транскрипции РНК составляет около 1 - 4% от общей клеточной РНК. Это будет ниже роста арестован клетки, поскольку они больше не синтезировать РНК на счет для роста клеток / репликации. Когда маркировка в течение 1 ч, рекомендуется началом анализа с 60 - 80 мкг общей РНК. Начиная с менее чем 30 мкг общей РНК результаты в небольших гранул РНК, которые трудно увидеть после биотинилированием шаг и, следовательно, может...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Метаболический маркировки вновь транскрипции РНК существенно повышает мощность высокопроизводительных технологий, как микрочипы и РНК-SEQ, предоставляя более подходящие шаблоны для решения биологических вопросов, представляющих интерес. Настоящий Протокол проводился капитальный оптимизации. Это позволяет> 1000-кратное обогащение вновь транскрипции РНК и обеспечивает высокую воспроизводимость результатов.

Экспериментальный дизайн 4SU-тегов эксперимент имеет решающее значение, как недавно т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Amie Риган за внимательное чтение рукописи. Эта работа была поддержана грантом NGFN Plus # 01GS0801, MRC G1002523 стипендии, гранты и NHSBT WP11-05 LD и гранта DFG FR2938/1-1 к CCF

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4-тиуридинкарбосинтT4509Приготовьте 50 мМ бульона в стерильном H2O, храните при -20 °°; C в аликвотах 50-500 μ l, выбросьте неиспользованный реагент, не замораживайте повторно.
ТризолИнвитроген15596026 (100 мл), 15596018 (200 мл)<сильно>ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - КОРРОЗИОННЫЙ И ВРЕДНЫЙ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ! Обеспечьте немедленный доступ к антидоту фенола (ПЭГ-метанол); Хранить при температуре 4 °C.
ХлороформSigma372978ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ - ОПАСНО ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ
Strong>ИзопропанолSigma650447Цитрат
натрия, не содержащий нуклеазSigmaC8532Приготовьте 1,6 М стоковый раствор, используя воду, не содержащую нуклеаз.
5M безнуклеазный NaClSigma71386Стоковый раствор
нуклеазный H2OSigmaW4502Сделайте 1 мл аликвот в безнуклеазных пробирках.
для осаждения РНК1,2 М NaCl, 0,8 М цитрат натрия в воде, свободной от нуклеазы. Подготовьте заранее в строго безнуклеазных условиях. Хранить при комнатной температуре в соколиных тубах объемом 50 мл.
ЭтанолСигма459844Использовать с водой без нуклеаз для приготовления 80% этанола, хранить при температуре -20 °C.
1 М безнуклеазный Трис Кл, рН 7,5Лонза51237Стоковый раствор
500 мМ нуклеазный безнуклеазный ЭДТА, рН 8,0Инвитроген15575-020Стоковый раствор
10х Биотинилирование Буфер (ВВ)100 мМ Трис рН 7,4, 10 мМ ЭДТА в безнуклеазной воде, сделать аликвоты по 1 мл.
Диметилформамид (ДМФ)SigmaD4551
EZ-Link биотин-HPDPPierce21341Приготовьте 1 мг/мл стокового раствора, растворив 50 мг биотина-HPDP в 50 мл ДМФА. Мягкое прогревание усиливает солюбилизацию. Хранить при 4 °deg; С в аликвотах по 1 мл.
Phase Lock Gel Heavy tubes 2,0 млEppendorf0032 005.152Опционально для этапа экстракции хлороформа.
Дзета-мембранаBIORAD162-0153
10x Dot blot связывающий буфер100 мМ NaOH, 10 мМ ЭДТА
Биотин-олиго5'-биотин, 25 нуклеотидов, любой последовательности
додецилсульфат натрияФишераBPE9738На 100 мл 20% стокового раствора добавьте 20 г SDS к 80 мл PBS pH 7-8 и отрегулируйте объем до 100 мл. Держите все высокопроцентные растворы SDS выше 20 °C. Тепло растворы немного должны выпасть в осадок.
EZ-Link Iodoacetyl-LC-BiotinPierce21333Приготовьте 1 мг/мл стокового раствора, растворив 50 мг йодоацетил-биотина в 50 мл ДМФА. Мягкое прогревание усиливает солюбилизацию. Хранить при 4 °deg; С в аликвотах по 1 мл. Генерирует необратимое, тиол-специфичное биотинилирование.
Фосфатный буфер физиологический растворGibco10010-015
Dot blot blocking bufferСмешайте 20 мл 20% SDS с 20 мл 1 x PBS pH 7-8 и добавьте ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ.
Стрептавидин-пероксидаза хрена Vector LaboratoriesSA5004Хранить при -20 °C. Смешайте 10 мл 20% SDS с 10 мл 1 x PBS. Прибавляем 20 и мкм; l Стрептавидин-HRP перед применением.
Реагент ECLGE HealthcareRNP2109Используйте в соответствии с инструкциями производителя.
Super RX, X-RA Пленка, 18x24 смFujifilm47410 19236
μ Macs Streptavidin KitMiltenyi130-074-101Храните бусины при 4°C.
Tween 20SigmaP1379
Промывочный буфер100 мМ Трис pH 7,4, 10 мМ ЭДТА, 1 М NaCl, 0,1% Твин 20 в безнуклеазном H<суб>2О.
Dithiothreitol (DTT)Sigma43817Приготовьте в виде 100 мМ DTT в безнуклеазном H2O, всегда готовьте свежим перед использованием.
RNeasy MinElute KitQiagen74204Хранить колонны при 4 градусах; С, остальные компоненты комплекта при комнатной температуре.
Полипропиленовые тубы 1,5 млSarstedt72.692.005Совместимы с диметилформамидом
2,0 мл Полипропиленовые тубыSarstedt72.694.005Совместимы с Диметилформамидом
15 млТубы BD Falcon352096Совместимы с Диметилформамидом
50 мл ТубыBD Falcon352070Совместимы с Диметилформамидом
Все растворы/реагенты следует хранить при комнатной температуре, если не указано иное.
Equipment
УФ/ВИД спектрофотометрThermo ScientificNanoDrop 1000или эквивалент. Используйте небольшой объем (1-2 и мкм; м) для измерения низких концентраций РНК во избежание чрезмерной потери пробы.
Полипропиленовые центрифуги 15 млVWR International525-0153В отличие от стандартных пробирок 15 мл, эти выдерживают до 15 000 × г
Высокоскоростная центрифугаBeckman CoulterAvanti J-25или аналогичное оборудование, способное достигать 13 000× g
Высокоскоростной роторBeckman CoulterJLA-16250или аналогичное оборудование, способное достигать 13 000× g
Адаптеры для туб 15 млLaborgerä te Beranek356964Или эквивалентное оборудование, способное достигать 13 000× g
Настольная центрифуга охлаждаемаяEppendorf5430 RИли аналогичная.
ТермомиксерEppendorfТермомиксер компактныйили аналог.
Магнитный стендMiltenyi Biotec130-042-109Один стенд вмещает 8 человек; Колонки Macs.
Водяная баняGrantSUB Aqua 5Или аналог.
Ультратонкие накипиA & DGR-202Или эквивалент.
E-Gel iBase PowerSystem InvitrogenG6400UKдля РНК-гелей; или эквивалент.
E-Gel EX 1% агарозные сборные гелиInvitrogenG4020-01Для РНК-гелей; или эквивалент.
Буфер

Ссылки

  1. Brown, P. O., Botstein, D. Exploring the new world of the genome with DNA microarrays. Nature Genetics. 21, 33-37 (1999).
  2. Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  3. Nagalakshmi, U., Wang, Z., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320, 1344-1349 (2008).
  4. Wilhelm, B. T., Marguerat, S., et al. Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature. 453, 1239-U1239 (2008).
  5. Dölken, L., Ruzsics, Z., et al. High-resolution gene expression profiling for simultaneous kinetic parameter analysis of RNA synthesis and decay. RNA. 14, 1959-1972 (2008).
  6. Yang, E., van Nimwegen, E., et al. Decay rates of human mRNAs: correlation with functional characteristics and sequence attributes. Genome Res. 13, 1863-1872 (2003).
  7. Friedel, C. C., Dölken, L., Ruzsics, Z., Koszinowski, U. H., Zimmer, R. Conserved principles of mammalian transcriptional regulation revealed by RNA half-life. Nucleic Acids Res. 37, e115(2009).
  8. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing. Nature. 463, 457-463 (2010).
  9. Windhager, L., Bonfert, T., et al. Ultra short and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Res. , (2012).
  10. Melvin, W. T., Milne, H. B., Slater, A. A., Allen, H. J., Keir, H. M. Incorporation of 6-thioguanosine and 4-thiouridine into RNA. Application to isolation of newly synthesised RNA by affinity chromatography. Eur. J Biochem. 92, 373-379 (1978).
  11. Cleary, M. D., Meiering, C. D., Jan, E., Guymon, R., Boothroyd, J. C. Biosynthetic labeling of RNA with uracil phosphoribosyltransferase allows cell-specific microarray analysis of mRNA synthesis and decay. Nature Biotechnology. 23, 232-237 (2005).
  12. Kenzelmann, M., Maertens, S., et al. Microarray analysis of newly synthesized RNA in cells and animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 6164-6169 (2007).
  13. Schwanhäusser, B., Busse, D., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473, 337-342 (2011).
  14. Rabani, M., Levin, J. Z., et al. Metabolic labeling of RNA uncovers principles of RNA production and degradation dynamics in mammalian cells. Nat. Biotechnol. , (2011).
  15. Miller, M. R., Robinson, K. J., Cleary, M. D., Doe, C. Q. TU-tagging: cell type-specific RNA isolation from intact complex tissues. Nat. Methods. 6, 439-441 (2009).
  16. Miller, C., Schwalb, B., et al. Dynamic transcriptome analysis measures rates of mRNA synthesis and decay in yeast. Mol. Syst. Biol. 7, 458(2011).
  17. Weintz, G., Olsen, J. V., et al. The phosphoproteome of toll-like receptor-activated macrophages. Mol. Syst. Biol. 6, 371(2010).
  18. Lipsett, M. N. The isolation of 4-thiouridylic acid from the soluble ribonucleic acid of Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 240, 3975-3978 (1965).
  19. Marcinowski, L., Liedschreiber, M., et al. Real-time Transcriptional Profiling of Cellular and Viral Gene Expression during Lytic Cytomegalovirus Infection. PLoS Pathog. 8, e1002908(2012).
  20. Chomczynski, P., Mackey, K. Short technical reports. Modification of the TRI reagent procedure for isolation of RNA from polysaccharide- and proteoglycan-rich sources. Biotechniques. 19, 942-945 (1995).
  21. Friedel, C. C., Dölken, L. Metabolic tagging and purification of nascent RNA: implications for transcriptomics. Mol. Biosyst. 5, 1271-1278 (2009).
  22. Friedel, C. C., Kaufmann, S., Dölken, L., Zimmer, R. HALO - A Java framework for precise transcript half-life determination. Bioinformatics. , (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

4
Метаболический маркировки Недавно Transcribed РНК за большой размер профилирования экспрессии генов синтеза РНК, производство и разложение в культуре клеток
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.