Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133

21K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50200

⸱

13 марта 2013 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Pathology, Laboratory of Molecular Tumor Pathology, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 2Institute for Chemistry and Biochemistry, Free University Berlin, 3Laboratory for Functional Genomics Charité (LFGC), Charité - Universitätsmedizin Berlin, 4Comprehensive Cancer Center Charité, Charité - Universitätsmedizin Berlin

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье описывается подготовка свежеполученных меланомы ткани в первичных культур клеток, и как удалять загрязнения эритроцитов и фибробластов из опухолевых клеток. Наконец, мы опишем, как CD133 + Предполагаемые стволовые клетки меланомы сортируются от CD133 - Массовые с использованием магнитных клеток, активированных Сортировка (MACS).

Аннотация

Несмотря на улучшение варианты лечения меланомы, доступных сегодня, пациентов с поздними стадиями меланомы все еще имеют плохой прогноз без прогрессирования и общей выживаемости. Таким образом, трансляционные исследования необходимо представить дополнительные доказательства молекулярного для улучшения таргетной терапии злокачественных меланом. В прошлом онкогенных механизмов, связанных с меланомой были широко изучены в установленном клеточных линий. На пути к более персонализированные схемы лечения с учетом индивидуальных генетических профилей, мы предлагаем использовать пациентом полученных клеточных линий, а общий клеточных линий. Наряду с высоким качеством клинических данных, особенно на пациента наблюдения, эти клетки будут играть важную роль, чтобы лучше понять молекулярные механизмы, лежащие в прогрессии меланомы.

Здесь мы сообщаем о создании первичных культур меланомы от расчлененного свежей ткани опухоли. Эта процедура включает в себя измельчение и диссоциации ткани на отдельные клетки, повторноСнятие загрязнений с эритроцитами и фибробластов, а также первичной культуре и надежной проверки происхождения меланомы клеток.

Последние отчеты показали, что меланома, как и большинство опухолей, гавани небольшой субпопуляции раковых стволовых клеток (ЦОК), который, кажется, исключительно топливо опухоли инициации и прогрессировании к метастатическим государства. Одним из ключевых маркеров для CSC идентификации и выделения в меланомы CD133. Для выделения CD133 + CSCs из первичных культур меланомы, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) процедуру Miltenyi в результате высокой чистотой сортировки и жизнеспособность CD133 + и CD133 CSCs - объем, который можно выращивать и функционально проанализированы после этого.

Введение

Кожные злокачественной меланомы является наименее распространенным, но самая опасная форма рака кожи. В связи с ростом заболеваемости, высокой степени злокачественности и быстрое распространение меланомы в настоящее время приходится 75% злокачественных опухолей кожи смертей, связанных с 1,2. Кроме хирургического иссечения первичной опухоли, химиотерапию, лучевую терапию, иммунотерапию и комбинированной химио-и иммунотерапия метастазы меланомы являются государством в самых современных стратегий для лечения меланомы 3,4. Тем не менее, злокачественная меланома характеризуется плохой ответ на химиотерапевтические средства (5-12%) 5,6, и только те 50-70% больных меланомой, несущий ген BRAF V600E мутации выгоду от новых перспективных целевой терапии, как лечение с 7 Для вемурафениб улучшение общей выживаемости, гораздо более глубокое понимание механизмов развития меланомы опухолей необходима.

Для изучения этих механизмов в прошлом, устоявшейся коммерческойбенно доступные клеточные линии были использованы. Более поздние подходы к изучению молекулярных событий начала и прогрессии рака использования первичных культур получены непосредственно из опухолевой ткани - стратегия преимущества подшипников многообразии: исследователь имеет полный контроль над пациентом и тканей выбор. Отобранные клетки получили из искусно выбранных опухолевой ткани, напоминающие опухоли со всеми ее неоднородность и последующие данные пациента и подробные патологии могут позволить характеристики культуры в сравнении с теми из первоначальной опухоли 8.

В противоположность этому, использование установленных клеточных линий в соответствующих модельных систем в исследовании рака обсуждаются спорно. Уже в 1987 году Осборн и коллеги описали значительные биологические различия между MCF-7 линий человека рак молочной железы клетки от различных лабораториях 9. Этот обширный геномной нестабильности и изменения в экспрессии РНК во время субкультуры был одним изnfirmed по Hiorns и соавт., и при условии, поддерживающих данные для доказательства того, что клеточные линии у развиваются в культуре, тем самым ослабив прямое отношение таких культур, как установлено модели человеческого рака 10.

Еще одним важным фактором, который в значительной степени игнорировались на протяжении многих лет, является риск загрязнения или чрезмерного роста культур с несвязанными «ложные» клеток, который был выдвинут более двадцати лет назад, демонстрируя, что большое число клеточных линий были заражены HeLa клетки 8,11. Неверное толкование данных из «ложные» клеточных линий в последнее время вышли на свет в литературе снова. Используя комбинацию ДНК и молекулярной цитогенетики, Маклеод и соавт. Показали, что из 252 новых опухолей полученных клеточных линий человека на хранение в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ), почти 18% были признаны внутривидовой или межвидовой крест -загрязнители 12,13.

Чтобы избежать этих проблем, а также использовать преимущества упоминалось выше, мы решили создать низкой прохождения линии клеток меланомы с метастазами только что вырезали.

Надежная клетка разделения и анализа технологии требуют одноклеточных препаратов, которые будут созданы в то время как одновременно ограничивая клеточной смерти и разрушения характерных поверхностных белков. Настольный инструмент для автоматизированного диссоциации тканей в одной клеточной суспензии является диссоциатор gentleMACS производства Miltenyi. При использовании в сочетании с gentleMACS C Трубы и оптимизированный диссоциации решений, эффективное и нежное диссоциации опухолевой ткани в замкнутой системе достигается при сохранении эпитопов антигена и снижения потери клеток. Прибор предлагает оптимизировать, предустановленных программ для различных конкретных приложений и стандартизированных гарантий подготовки одноклеточных суспензий от меланомы ткани 14.

<р = класса "jove_content"> Последние отчеты показали, что большинство опухолей питать небольшой субпопуляции так называемые раковые стволовые клетки (ЦОК), которые обладают исключительно опухоли инициирование и самообновлению мощности. Идентификация меланоцитов производству стволовых клеток в дерму кожи привело к гипотезе, что эти клетки могут быть происхождении раковых стволовых клеток (ЦОК) в меланомы, поскольку воздействие радиации UVA можете прокачать эти клетки для злокачественной трансформации 15. В результате таких генетических поражений было бы клеток, которые питают сочетание опухоли и характеристики стволовых клеток.

Одним из ключевых маркеров предложили представлять субпопуляции CSCs в меланомы CD133 16-20. CD133 (также известный как Prominin 1), членом pentaspan трансмембранного гликопротеина, выражается в гемопоэтических стволовых клетках, эндотелиальных клеток-предшественников, нейронов и глиальных клеток стволовые 21-23. Экспрессия CD133 коррелирует сасимметричное деление клетки 24, и гликозилированного эпитоп CD133 было показано, что подавляется на клеточную дифференцировку 25. Недавно CD133 + клеток меланомы было показано, что самообновлению и опухоль начала мощностью 19,20.

Для изучения функций CD133 + предполагаемый меланомы CSCs, мы изменили и оптимизировать магнитные клеток, активированных Сортировка (MACS) системы от Miltenyi Biotech для получения обогащенного и жизнеспособных популяций CD133 и CD133 + - клетки.

Магнитный шарик на основе разделения клеток позволяет либо отрицательное выделение, как показано на Мэтью и др. 26. Или положительный выбор, как мы показываем здесь. Во время положительного отбора определенного типа клеток-мишеней, например, CD133 экспрессирующие клетки, магнитно меченных микросфер, 50-нм суперпарамагнитных частиц, которые сопряжены с весьма специфических антител противспецифический антиген клеточной поверхности. Во время разделения, магнитно-меченых клеток сохраняется в столбце в магнитном поле сепаратора, в то время как немеченого клетки течь через. После промывки, столбец удаляется от магнитного поля сепаратора, и клетки-мишени вымываются из колонки. LS или MS столбцы, используемые при положительном результате отбора в доли меченых и немеченых клеток с высокой степенью чистоты. С другой стороны, LD столбцы, используемые для негативного отбора, в результате несколько ниже, чистота меченые фракции. В связи с плотной упаковкой их матрицы скорость потока в этих колонках ниже, что приводит к высокому риску немеченого клетки в ловушке в столбце. LD столбцов поэтому его следует использовать только для строгих истощения нежелательных субпопуляции клеток. Положительный отбор может осуществляться прямые (антитела связаны с микрошарики) или косвенным магнитной маркировки (инкубация с микрошарики после incubatioп с первичными антителами). Конкретные микрошарики MACS доступны для позитивной селекции многочисленных типов клеток из первичной опухоли клетки простаты или, как меланома 27.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Общая схема эксперимента, включая подготовку первичной одной клетки от опухолевых тканей, характеристика первичных культур клеток, фибробластов истощения и магнитных сортировки клетки CD133 и CD133 + - клетки меланомы показано на рисунке 1.

1. Примеры приобретения

  1. Проверьте этические утверждения, прежде чем рассматривать следующие шаги.
  2. Подготовка 50 мл трубки с стерильной PBS с добавлением 1% пенициллина-стрептомицина конечной концентрации и передать операцию или команду.
  3. Организовать быстрый транспорт опухолевой ткани после операции на мобильный лаборатории культуры при 4 ° C.

2. Подготовка первичной меланомы одной клетки от опухолевой ткани

  1. Выполните все шаги в стерильных условиях.
  2. Перед резекции опухоли, необходимо подготовить смесь диссоциации. 10 мл диссоциации смеси на 2-4 г ткани не требуется. Смесь может быть использована Immediately или хранятся в 10 мл аликвоты при -20 ° C для дальнейшего использования.
    1. Готовят раствор, содержащий 150 мМ хлорида натрия. Смешать помощью вихря, пока раствор не станет прозрачным. Если необходимо стерильным фильтрата раствора хлорида натрия использовании 0,22 мкм.
    2. Взвесить ДНКазы I и приготовить раствор, содержащий 10 мг / мл ДНКазы I в 150 мМ хлорида натрия. Смешать путем обращения пока раствор не станет прозрачным.
    3. Подготовка раствора, содержащего 100 мг коллагеназы IV в PBS. Смешать путем обращения пока раствор не станет прозрачным. Аликвоты коллагеназы раствор можно хранить при температуре -20 ° С в течение нескольких месяцев.
    4. Подготовьте смесь диссоциации с конечной концентрации 1% пенициллина-стрептомицина, 1 мг / мл коллагеназы IV и 0,1 мг / мл ДНКазы I в среде Квантовая 263. Смешать помощью вихря. Дополнительно: при использовании меланомы ткани, полученные из кожи добавляют раствор амфотерицина в смесь диссоциации до конечной концентрации 1,5 мкг / мл амфотерицина B.
  3. Предварительно теплой REQuired количества диссоциации смеси, PBS и квантовых 263 средних и 37 ° C.
  4. Место опухолевой ткани на стерильные чашки Петри. Аспирируйте чрезмерное раствор из ткани и добавить 500 мкл смеси диссоциации. Фарш опухоли на мелкие кусочки размером 2-4 мм, приготовленные из свежих стерильных скальпелей.
  5. Передача 2-4 г измельченного опухолевой ткани в трубку gentleMACS C, содержащий 5 мл диссоциации смеси. Промойте чашки Петри с дополнительным 4,5 мл диссоциации перемешать и добавить оставшиеся фрагменты ткани к трубе gentleMACS C.
  6. Закрыть gentleMACS C трубы и прикрепить ее вниз головой на рукаве диссоциатор gentleMACS. Запустите программу gentleMACS "h_tumor_01".
  7. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора и инкубировать образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении помощью Rotator MACSmix трубы на самом высоком скорость бега (12 мин) или путем поворота трубы вручную каждые 5 мин до ресуспендируют поселился фрагментов ткани .
  8. Прикрепить gentleMACS C трубы вниз головой на рукаве тОн gentleMACS диссоциатор и запустить программу gentleMACS "h_tumor_02".
  9. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора и инкубировать образца в течение 30 мин при 37 ° С при непрерывном вращении помощью Rotator MACSmix трубы на самом высоком скорость бега (12 мин) или путем поворота трубы вручную каждые 5 мин до ресуспендируют поселился фрагментов ткани .
  10. Прикрепить gentleMACS C трубы вниз головой на рукаве диссоциатор gentleMACS и запустить программу gentleMACS "h_tumor_03".
  11. Снимите трубку gentleMACS C от диссоциатора, ресуспендируют образца и применять клеточной суспензии в 70 мкм ячейки фильтра размещены на 50 мл трубки. Если засорение фильтра происходит, перемешать клеточной суспензии с стерильный фильтр наконечника до полной подвеской пробежал.
  12. Промойте ячейки фильтра с 5 мл среды Квантовая 263.
  13. Дополнительно: если вы до сих пор фрагментов ткани остается в фильтре, ресуспендируют фрагментов в квантовых 263 средних и семя их в соответствующую ячейку культуры расчас Инкубируйте фрагментов при 37 ° C и 5% CO 2.
  14. Откажитесь ячейки фильтра и закрыть 50 мл трубки с перевариваются клеточной суспензии. Центрифуга клеточной суспензии в течение 5 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
  15. Дополнительно: если осадок клеток появляется красный цвет за счет большого количества эритроцитов подготовить 1x красных клеток крови Лизис решение путем разбавления 10x 1:10 решения в дважды дистиллированной воде, ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл PBS и добавьте 5 мл 1x Красная лизис клеток крови Решение. Vortex 5 сек и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Центрифуга в течение 5 мин при 300 мкг и отбросить супернатант.
  16. Ресуспендируют опухолевых клеток с квантовыми 263 и семян клеток в соответствующие колбы для культивирования клеток. Культуры опухолевых клеток при 37 ° C и 5% CO 2 и регулярно прохождения клетками, когда они достигают 80% слияния.

3. Характеристика первичной культуре клеток и фибробластов истощения

  1. Анализ первичной культуре клеток фенотипически использованием microscoфизическое воспитание
  2. Соберите небольшое количество (0,5 x 10 6 клеток) первичной культуре клеток и выполняют RT-PCR с праймерами для опухолевых-, меланомы, стволовых клеток и генов клетки стромы маркером. Наиболее важные гены для анализа являются CD90 (фибробластов маркер), TYR (меланомы / меланоцитов маркер), CD133 (рак стволовых клеток маркера), CD83 (маркер для зрелых дендритных клеток) и гена домашнего хозяйства (например, HPRT или GAPDH).
  3. Если микроскопический анализ и высокой экспрессией CD90 в течение RT-PCR показал высокое загрязнение первичной культуре фибробластов с меланомой, необходимо, чтобы исчерпать фибробластов помощью Anti-Фибробласты микрошариков и D Колонны из Miltenyi.

4. Магнитные сортировки клеток CD133 + и CD133 - клетки меланомы Использование LS Столбцы

  1. Подготовка MACS буфера, содержащего 2 мМ ЭДТА и 5% FCS в PBS. Mix путем обращения и стерильный фильтрат-буфера, используя 0,22 мкм Steritop-GP фильтра. Холод буфере до 4-8 ° Cи дегазации перед использованием.
  2. Предварительно теплой Accutase, PBS и квантовых 263 средних и 37 ° C.
  3. Вымойте 80% вырожденная клетки с PBS. Добавить соответствующее количество Accutase и инкубировать до клетки отделяются от поверхности культуры. Сбор клеток в 50 мл трубки с помощью квантово 263 среды.
  4. Определить номер ячейки и центрифугируют необходимое количество клеток (в соответствии с протоколом Miltenyi на максимальное количество 2x 10 9 клеток может быть загружен в LS колонки. Клеточной линии конкретного оптимального числа должны быть определены и могут быть значительно ниже.) В течение 5 мин при 300 мкг и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  5. Ресуспендируют максимум 1x 10 8 клеток с 350 мкл буфера для MACS (для большего числа ячейки масштабы всех следующих буфера MACS, FcR Блокировка реагентов, CD133/1-Biotin и анти-биотин микрошарики объемах соответственно).
  6. Добавить 100 мкл FcR Блокировка реагентов.
  7. Добавить 50 мкл CD133/1-Biotin. Хорошо перемешайте помощью вихря и инкубировать при температуре 4-8 ° C Fили 10 мин.
  8. Вымойте клеток путем добавления 10 мл MACS буфера и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  9. Повторите стадии промывки (4,8)
  10. Ресуспендируют осадок клеток в 400 мкл буфера для MACS.
  11. Добавить 100 мкл анти-биотин микрошарики. Хорошо перемешайте помощью вихря и инкубировать при температуре 4-8 ° С в течение 15 мин.
  12. Между тем, подготовка MACS сепаратор для магнитной сепарации. Прикрепить QuadroMACS к MACS Separator нескольких Stand. Вставьте необходимое количество LS колонны с колонной крылья на фронт в магнитном поле QuadroMACS. Поместите предварительного разделения фильтра (с 30 нейлоновая сетка мкм) в каждой колонке LS и соответствующие трубки коллекция (15 мл или 50 мл) в каждом столбце. Подготовка фильтра и столбцов путем промывки с 3 мл буфера MACS. Откажитесь проточные.
  13. Вымойте клеток путем добавления 10 мл MACS буфера и центрифуги в течение 5 мин при 300 х г и 4-8 ° C. Супернатант полностью.
  14. Ресуспендируют клеток с 500 мклMACS буфер и применять клеточную суспензию на LS столбец с предварительного разделения фильтра.
  15. Вымойте три раза с 3 мл MACS буфера на колонке. Только добавить новый буфер, когда колонна резервуар пуст.
  16. Собранные общего стоков содержит непомеченных CD133 - клеточной фракции.
  17. Откажитесь от предварительного разделения фильтра, удалить столбец из сепаратора и разместить его на подходящую трубку коллекции.
  18. Нанесите 5 мл MACS буфера. Немедленно промыть меченых CD133 + клеток, крепко нажимая на поршень в колонну.
  19. Для повышения чистоты отрицательные фракции, применять клеточную суспензию на новую уравновешенную колонку LS вставляется в QuadroMACS. Стоков содержит CD133 - фракции.
  20. Удалите столбцы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Подготовка одной клетки от опухолевых тканей

Рисунок 2 иллюстрирует узла удаленной метастазов в лимфатических поздней стадии меланомы пациента до (А) и после (б) механическая диссоциация на 2-4 штуки мм. После ферментативного распада тканей и фильтрацией через 70 нейлоновая сетка мкм, клетки осаждали и супернатант отбрасывали. На данном этапе мы наблюдали сильное загрязнение с эритроцитами как указано в красноватый цвет осадок клеток на рисунке 2C. Впоследствии...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для того, чтобы удалить загрязнения из эритроцитов опухолевых клеток гранулы мы настоятельно рекомендуем использовать красные клетки крови лизисом решение от Miltenyi. Преимущества лизиса эритроцитов по сравнению с традиционными центрифугирования в градиенте плотности Ficoll в том, что это быстрее и проще. Кроме того, загрязнений с Ficoll или красных клеток крови и потеря опухолевых клеток избежать. Когда вы наблюдаете рост фибробластов в первичной культуре клеток они должны быть немедленно удалены, так как они обычно з...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят профессора М. Dietel и Дирк Шумахер за поддержку этой работы и критически чтении рукописи.

Научных исследований, ведущих к этим результатам, получила поддержку со стороны Инновационные инициативы лекарственных средств совместного проекта по гранту соглашения N ° 115234, ресурсы, которые состоят из финансового вклада Седьмой рамочной Европейского Союза, Программы (FP7/2007-2013) и EFPIA компаний в вид вклада. Эта работа также была поддержана Berliner Krebsgesellschaft (BKG).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагент
Accutase PAA Лаборатории GmbH L11-007
Амфотерицин решение 250 мкг / мл деионизированной воды Sigma-Aldrich, Inc A2942-50мл
анти-фибробласты микрошарики Miltenyi Biotec GmbH 130-050-601
CD133 / 1 (W6B3C1) Miltenyi Biotec GmbH 130-092-395
Коллагеназы IV Sigma-Aldrich, Inc C5138
ДНКазы I AppliChem GmbH A3778.0050
D-PBS без Ca, Mg PAA Лаборатории GmbH H15-002
Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (EDTA) Sigma-Aldrich, Inc E-7889
FBS Улучшенный Biochrom S0615
Косвенные CD133 Micro-Bead Kit человека Miltenyi Biotec GmbH 130-091-895 Включает в себя: CD133 / 1 (AC133)-биотин, анти-биотин микрошариков и FcR Блокировка реагентов
Пенициллина-стрептомицина, жидкий (100x) Invitrogen GmbH 15140-122
Квантовая 263 PAA Лаборатории GmbH U15-815
Красных клеток крови Лизис решение (10x) Miltenyi Biotec GmbH 130-094-183
Оборудование
Сотовый фильтр (70 мкм) BD Biosciences 352350
gentleMACS C трубы Miltenyi Biotec GmbH 130-093-237
gentleMACS диссоциатора Miltenyi Biotec GmbH 130-093-235
MACS Separator нескольких Стенд Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS Разделение столбцов 25 столбцов LS Miltenyi Biotec GmbH 130-042-401
MACSmix труб Rotator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-753
Natriumchloride Merck KGaA 567440-1кг
Предварительное разделение фильтры Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-090-976
Rotilabo шприц-фильтр (0,22 мкм, PES) Carl Roth GmbH & Ко КГ P668.1
Steritop-GP фильтром 500 мл Miltenyi Biotec GmbH SCGPS05RE

Ссылки

  1. Garibyan, L., Fisher, D. E. How sunlight causes melanoma. Curr. Oncol. Rep. 12, 319-326 (2010).
  2. Radovic-Kovacevic, V., et al. Survival analysis in patients with cutaneous malignant melanoma. Srp. Arh. Celok. Lek. 125, 132-137 (1997).
  3. Lens, M. B., Eisen, T. G. Systemic chemotherapy in the treatment of malignant melanoma. Expert Opin. Pharmacother. 4, 2205-2211 (2003).
  4. Nashan, D., Muller, M. L., Grabbe, S., Wustlich, S., Enk, A. Systemic therapy of disseminated malignant melanoma: an evidence-based overview of the state-of-the-art in daily routine. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 21, 1305-1318 (2007).
  5. Eigentler, T. K., Meier, F., Keilholz, U., Hauschild, A., Garbe, C. Der Onkologe. 16, Springer-Verlag. 1160-1166 (2010).
  6. Keilholz, U., Tilgen, W., Hohenberger, W. Systemische Therapie des metastasierten Melanoms: Ergebnisse randomisierter Studien der letzten zehn Jahre. Deutsches Ärzteblatt. 100, (2003).
  7. Chapman, P. B., et al. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. N. Engl. J. Med. 364, 2507-2516 (2011).
  8. Burdall, S. E., Hanby, A. M., Lansdown, M. R., Speirs, V. Breast cancer cell lines: friend or foe. Breast Cancer Research : BCR. 5, 89-95 (2003).
  9. Osborne, C. K., Hobbs, K., Trent, J. M. Biological differences among MCF-7 human breast cancer cell lines from different laboratories. Breast Cancer Research and Treatment. 9, 111-121 (1987).
  10. Hiorns, L. R., et al. Variation in RNA expression and genomic DNA content acquired during cell culture. Br. J. Cancer. 90, 476-482 (2004).
  11. Nelson-Rees, W. A., Daniels, D. W., Flandermeyer, R. R. Cross-contamination of cells in culture. Science. 212, 446-452 (1981).
  12. MacLeod, R. A., et al. Widespread intraspecies cross-contamination of human tumor cell lines arising at source. Int. J. Cancer. 83, 555-563 (1999).
  13. Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 1, 233-236 (2000).
  14. Pennartz, S., Reiss, S., Biloune, R., Hasselmann, D., Bosio, A. Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue. J. Vis. Exp. (29), e1267(2009).
  15. Zabierowski, S. E., Fukunaga-Kalabis, M., Li, L., Herlyn, M. Dermis-derived stem cells: a source of epidermal melanocytes and melanoma. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 422-429 (2011).
  16. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
  17. Ieta, K., et al. Biological and genetic characteristics of tumor-initiating cells in colon cancer. Ann. Surg. Oncol. 15, 638-648 (2008).
  18. Bertolini, G., et al. Highly tumorigenic lung cancer CD133+ cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16281-16286 (2009).
  19. Monzani, E., et al. Melanoma contains CD133 and ABCG2 positive cells with enhanced tumourigenic potential. Eur. J. Cancer. 43, 935-946 (2007).
  20. Gedye, C., et al. Cancer/testis antigens can be immunological targets in clonogenic CD133+ melanoma cells. Cancer Immunology, Immunotherapy : CII. 58, 1635-1646 (2009).
  21. Kobari, L., et al. CD133+ cell selection is an alternative to CD34+ cell selection for ex vivo expansion of hematopoietic stem cells. J. Hematother. Stem Cell Res. 10, 273-281 (2001).
  22. Quirici, N., et al. Differentiation and expansion of endothelial cells from human bone marrow CD133(+) cells. Br. J. Haematol. 115, 186-194 (2001).
  23. Pfenninger, C. V., et al. CD133 is not present on neurogenic astrocytes in the adult subventricular zone, but on embryonic neural stem cells, ependymal cells, and glioblastoma cells. Cancer Res. 67, 5727-5736 (2007).
  24. Dubreuil, V., Marzesco, A. M., Corbeil, D., Huttner, W. B., Wilsch-Brauninger, M. Midbody and primary cilium of neural progenitors release extracellular membrane particles enriched in the stem cell marker prominin-1. J. Cell Biol. 176, 483-495 (2007).
  25. Florek, M., et al. a neural and hematopoietic stem cell marker, is expressed in adult human differentiated cells and certain types of kidney cancer. Cell Tissue Res. 319, 15-26 (2005).
  26. Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from Mouse Lymph Nodes Using Miltenyi MACS Purification. J. Vis. Exp. (9), e409(2007).
  27. Watkins, S. K., Zhu, Z., Watkins, K. E., Hurwitz, A. A. Isolation of Immune Cells from Primary Tumors. J. Vis. Exp. (64), e3952(2012).
  28. Mollamohammadi, S., et al. A simple and efficient cryopreservation method for feeder-free dissociated human induced pluripotent stem cells and human embryonic stem cells. Hum. Reprod. 24, 2468-2476 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Стволовые клетки рака меланомыCD133-положительные клеткимагнитная активированная сортировка клетокпервичная культура меланомыистощение фибробластовудаление эритроцитовдиссоциация опухолевой тканичистота сортировки клетокподход персонализированной медицины
Пациент Производные культуре клеток и выделение CD133
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.