Точные, короткие, сложные и дешевый способ описан, который оценивает длину теломер во многих тканях и видам использования Qrt-PCR. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Длиной теломер и теломеразы, Инь и Ян клеточного старения
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Теломеры повторяющихся последовательностей ДНК на конце концов хромосом, которые разнообразны по длине и в организме человека может достигать в длину 15 000 пар оснований. Теломер служит биозащитные механизм хромосомы истощение в каждом делении клетки. В определенной длины, теломеры становятся слишком короткими, чтобы репликация, процесс, который может привести к хромосомной нестабильности или гибель клеток. Длина теломер регулируется двумя противоположными механизмами: истощение и удлинения. Истощение происходит в каждом делении клетки. В противоположность этому, удлинение частично модулированный с помощью фермента теломеразы, который добавляет повторяющихся последовательностей на концах хромосом. Таким образом, теломераза, возможно обратное механизма старения и омолаживает жизнеспособности клеток. Они играют ключевую роль в поддержании жизни клетки и используются для оценки клеточного старения. В этой рукописи мы опишем точные, короткие, сложные и дешевый метод оценки длины теломеров в различных тканяхс и видов. Этот метод использует два основных элемента, тандемных повторов теломер последовательности и чувствительность QRT-PCR для обнаружения дифференциального числа копий испытуемых образцов. Кроме того, мы опишем простой анализ для оценки активности теломеразы в качестве дополнительного теста для основы длину теломер.
Введение
Теломеры повторяющиеся ДНК гексамер (TTAGGG) последовательности, найденные на концах хромосом. В каждой клетке репликации, эти концы хромосом укорачиваются. Если они становятся слишком короткими, хромосомы могут подвергаться теломер слияний конца, аберрантными рекомбинации и деградации. Таким образом достаточную длину теломер обслуживания играет важную роль в обеспечении стабильности хромосом и клеточной защиты 38. Длина теломер также имеет решающее значение для генов, найденных вблизи концов хромосом, так как репликация ДНК не может продолжаться до самого конца хромосом 1-2. Следовательно, предотвращение укорочения теломер клетка может улучшить....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Протокол теломер Длина 19
- Выделение ДНК
Большинство методов выделения ДНК может быть использован. Наша лаборатория предпочитает Qiagen DNeasy Kit (# 69506) для крови источников. В зависимости от источника ДНК, например, буккального или других источников, другой способ изоляции может быть использован.
- Грунтовка:
Все праймеры разбавляли до исходной концентрации 100pmoles/μl в ПЦР класса воде и хранили при -20 ° С до использования. Рабочие запасы праймеры приготовлены и хранят при 20 ° C в течение короткого периода времени (несколько месяцев). Стандартны....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Пример длину теломер QRT-PCR анализа показан на рисунке 1. В левой верхней части панели, образцы помечены красным и зеленым представлять расположение предметов протестированы на 96-луночный планшет. В правом верхнем углу панели, кривой усиления демонстрируется. Каждый предмет проходят проверку двух анализов (теломер и единой копии гена), которая делается в трех экземплярах. Из-за различных ДНК числа копий производится в двух анализах выбранных лиц, число циклов до цветения обнаружения достигает экспонен.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Длина теломер предоставляет уникальный клеточный маркер для изучения напряженно и старения клеток и предлагает взглянуть на механизмы старения. Так как его роль в старении впервые было предложено, множество исследований было сделано, касающиеся длины теломеров с возрастом, долголетия, возрастных заболеваний, рака, и стресс. На протяжении десятилетий, золотой стандарт измерения теломер была длиной терминала анализа фрагментов ограничение использования Саузерн-гибридизации. Однако в последнее время доступным, быстрым и ле.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Количественное обнаружение теломеразы | Allied Biotech | MT3012 | |
| Qiagen DNeasy Kit | Qiagen | 69506 | |
| LightCycler 480 SYBR Green I Master, готовая к использованию реакционная смесь горячего старта для ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green I с использованием инструмента LightCycler 480 | Roche Diagnostics | 4707516 |
Ссылки
- Blackburn, E. H. Structure and Function of Telomeres. Nature. 350 (6319), 569-573 (1991).
- Gilson, E., Ségal-Bendirdjian, E. The Telomere Story or the Triumph of an Open-Minded. Research. Biochimie. 92 (4), 321-326 (2010).
- Wu, X., Amos, C. I., Zhu, Y., Zhao, H., Grossman, B. H., Shay, J. W.,....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
