Протокол для хронических инфузии глюкозы и Intralipid у крыс описана. Эта модель может быть использована для изучения влияния на избыток питательных функции органов и физиологических параметров.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модели хронического Питательные инфузии у крыс
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Хроническое воздействие чрезмерного уровня питательных веществ постулировано, чтобы повлиять на функции нескольких органов и тканей и вносить свой вклад в развитие многих осложнений, связанных с ожирением и метаболическим синдромом, в том числе диабета типа 2. Для изучения механизмов, посредством которых чрезмерные уровни глюкозы и жирных кислот влияет на панкреатических бета-клеток и секрецию инсулина, мы создали модель хронического питательных инфузии у крыс. Процедура состоит из катетеризации правую яремную вену и левую сонную артерию под наркозом, позволяющий 7-дневный период восстановления; соединительный катетеров к насосам с использованием поворотной и противовеса система, которая позволяет животному свободно перемещаться в клетке, и инфузии глюкоза и / или Интралипид (соевое масло, которое генерирует смеси, содержащей приблизительно 80% unsaturated/20% насыщенных жирных кислот при инфузии с гепарином) в течение 72 часов. Эта модель предлагает несколько выгодноео.э.р., включая возможность тонко модулировать целевые уровни циркулирующего глюкозы и жирных кислот; возможность совместного влить фармакологических соединений, и относительно короткий промежуток времени, в отличие от диетического моделей. Он может быть использован для изучения механизмов питательных индуцированной дисфункции в различных органах и для проверки эффективности лекарственных средств в данном контексте.
Введение
Хронически повышенные уровни глюкозы и липидов в кровотоке было предложено внести свой вклад в патогенез сахарного диабета 2 типа путем изменения функции некоторых органов участвуют в поддержании гомеостаза глюкозы, включая, но не ограничиваясь этим, панкреатических бета-клеток (обзор в 1). Glucotoxicity гипотеза предполагает, что хроническая гипергликемия усугубляет бета-клеточный дефект, которые привели к гипергликемии, в первую очередь, создавая тем самым порочный круг и способствует ухудшению контроля уровня глюкозы крови в 2 типа больных сахарным диабетом. Кроме того, glucolipotoxicity гипотеза предполагает, что сопутствующее высотах глюкозы и липидов, как это часто наблюдается при диабете 2 типа, являются вредными для бета клетки.
Расшифровка клеточные и молекулярные механизмы вредного воздействия хронически повышенным питательных веществ на панкреатических бета-клеток является ключом к understandiнг патогенезе сахарного диабета 2 типа 1. В связи с этим, большое количество исследований рассмотрены механизмы хронической питательных избыток естественных бывший в изолированных островков Лангерганса или в пробирке в клональных, секретирующих инсулин клеточных линий. Тем не менее, перевод данные, полученные в этих модельных систем на весь организм является сложной, в частности, из-за концентрации жирных кислот, используемых в культивируемых клетках островков или редко соответствуют уровни циркулирующего в непосредственной близости от бета-клеток в естественных условиях 2. С другой стороны, механизмы бета-клеток отказ в ответ на питательный избыток были исследованы на моделях грызунов диабета, примером которых диабетическое жирных крыс Zucker 3,4, песчанки Psammomys оЬезиз 5 и высоким содержанием жиров, ФРС мыши 6. Эти модели, однако, характеризуются внутренней метаболических нарушений и не так легко поддаются манипуляции глюкозы в кровии / или уровней липидов в более контролируемых и менее хроническое обстановке. Для того, чтобы изменить циркулирующие уровни питательных веществ в сроки дней в противном случае нормальных животных, мы разработали модель хронического инфузии у нормальных крыс, что позволяет нам изучить влияние липидов и глюкозы, отдельно или в комбинации, на физиологические параметры и функции 7,8.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Обзор: Процедура состоит из катетеризации правую яремную вену и левую сонную артерию под наркозом, позволяющий 7-дневный период восстановления; соединительный катетеров к насосам с использованием поворотной и противовеса система, которая позволяет животному свободно перемещаться в клетке; и инфузии глюкозы и / или Интралипид (соевое масло, которое генерирует смеси, содержащей приблизительно 80% unsaturated/20% насыщенных жирных кислот при инфузии с гепарином 9) в течение 72 часов.
1. Canulation в правую яремную вену и левую сонную артерию
- Стерилизация хирургических инструментов. Canulation трубка должна быть холодной стерилизации с использованием жидкого стерилизующего вещества (2,6% глутарового альдегида) до процедуры. Погрузите трубку в автоклаве контейнер в течение 16-24 часов. Промыть и тщательно промыть стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить все следы глутаральдегиде перед использованием.
- Взвесьте крысы для расчетадозы препарата:
Carprofen 5 мг / кг: разбавление 1/10 = Масса тела (г) х 0,001 мл SC (анальгетик)
Glycopyrrolate 0,01 мг / кг: разбавление 1/10 = BW (г) x 0,0012 мл SC (антихолинергические) - Обезболить крысы использованием изофлуран и кислорода.
- Положите крысу на животе. Бритье области за ушами к основанию плеч. Положите крысу на спину. Бритье области под шею, чтобы передние лапы.
- Prep места хирургической операции хлоргексидин, спирт и йод. Администрирование наркотиков.
- Передача крысы операционного поля.
- С помощью асептической техники, canulate правую яремную вену и в левую сонную артерию с ПЭ-50 канюли прикреплен к 1 мл шприц с 5 U гепаринизированной солевой раствор. Промойте канюли с 50 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы избежать свертывания во время восстановительного периода. Используйте притупляются иглы 23G. Закройте все канюли 23G с PIN-кодом.
- После операции, обрезать примерно 2,5 мм отрезцы нижней и место крыса в инфузии куртку, чтобы предотвратить канюли от поедания.
- Подать кислород (1 л / мин в течение 10 мин), чтобы помочь эвакуировать изофлурана.
- Положите крысу в клетку с подогревом, пока она не полностью проснулся.
- Эксплуатация четырех крыс использовать один за инфузии условие (табл. 1).
2. Послеоперационный уход (пост-хирургического лечения и подключение катетеров)
- Взвесьте крысы в день 1 и 2-й день после операции.
- Администрирование гликопирролатом (BW (г) х 0,00048 мл) SC два раза в день 1 после операции и через на 2 день после операции.
- Дополнительных вспомогательных процедур можно вводить в случае необходимости: жидкости, грелки, влажные диеты, кислородная терапия, анальгетики, антихолинергические средства.
- На 7 день после операции крыс взвешивают для расчета расхода для инфузии.
- Подключите каждую крысу инфузионная система помощи троса и поворота установлен на верхней клетке гриль (рис. 1).
- Промойте канюли с 5 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы удалить сгустки. Промойте канюли еще раз с 50 U гепаринизированного физиологического раствора, чтобы предотвратить свертывание.
- Разрешить крыс привыкнуть к троса и поворотные течение по крайней мере 24 часов до начала инфузии.
3. Вливание
- Ничья 0,15 мл крови из сонной каждого гликемии крысы и меры. Промойте яремной канюли. Использование 50 ед гепаринизированной физиологического раствора, чтобы предотвратить свертывание в обоих канюли каждой крысы.
- Передача образца крови в 0,5 мл пробирку, содержащую 2% ЭДТА. Центрифуга при 10000 оборотов в минуту в течение 2 минут и заморозить плазмы при -20 ° C.
- Заполните две 60 мл шприцы для каждого из вливание перечисленных ниже условиях. Место Шприц 1 на переднем положении насоса и место Шприц 2 на заднем положении насоса.
- Регистрация каждой пары решений вместе с Y-разъемы и CO-EX T22 трубки, которые были стерилизованы. Поместите на шприцы Гарвардского 33сдвоенный насос шприца.
- Измените нижней клетке и удалить все продукты питания из верхнего гриля клетке.
- Взвесить 150 г стандартным кормом и места на верхнем гриле клетке.
- Подключите шприцы поворотный на клетке гриль. Промойте шприцы правильно удалить воздух из линий.
- Вычислить инфузии расхода использованием веса тела, которое было принято перед подключением крысы инфузионной системы. Ставки рассчитываются с файлами Microsoft Excel, которая преобразует скорость инфузии глюкозы (ВМР) в мл / час.
- Установите насос для управления расходом в течение 60 мл шприцев в соответствии с настройками производителя. Введите значение для Шприц 1 (спереди шприц) и тариф для Шприц 2 (обратно шприц).
- Запустите насос.
4. Мониторинг
- После запуска насоса, убедитесь, что нет утечки из поворотных или из канюли и что вливание трубка не перекручены. Также убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха втрубки.
- Через 3 ч инфузии принимать образец крови для мониторинга гликемии. Повторить через 6, 24, 48 и 72 ч инфузии. В качестве меры предосторожности, гликемия также контролируется через 30, 34, 54 и 60 ч инфузии. Содержание глюкозы в крови можно измерить, используя одну каплю цельной крови с помощью портативного монитора глюкозы. Это ограничивает количество крови, взятой во время инфузии и, следовательно, позволяет избежать значительного изменения объема крови и / или гематокрита.
- Ставка по 1 шприц модифицируется на основании значений гликемии для поддержания глюкозы в крови 220-250 мг / дл. Ставка по 2 шприца не изменяется в течение 72 ч инфузии потому что свободные жирные кислоты поддерживают на 1 ммоль / л
- Инфузионные условия являются парными, так что объем полученных для контрольных животных эквивалентен объему полученных для подопытных животных (табл. 1).
- Через 24 часа после инфузии, изменить нижнюю клетку и взвесить еду оставшихся в клетке гриль. Вернуться несъеденную T частиØ клетку гриль. Повторяйте за 48 часа.
- Refill шприцы день по мере необходимости в течение 72 ч инфузии.
- Во время инфузии необходимо соблюдать крысы на наличие признаков воспаления или дискомфорта. Администрирование соответствующей помощи в случае необходимости.
5. После инфузии Эвтаназия
- Через 72 ч инфузии, крыс анестезировали внутривенно 0,5 мл кетамина / ксилазина коктейль (182 мг / кг кетамина и 11,6 мг / кг ксилазина разводили 1:02 в 0,9% NaCl).
- Ноги-пинч рефлекса используется для проверки уровня анестезии. Дополнительные анестетик вводят по мере необходимости.
- Когда крыса находится под наркозом, брюшную полость открывается с хирургическими ножницами. Крысу обескровлены, рисуя 10-15 мл крови в шприц из аорты или полую вену.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Из серии из 42 крыс, которым была сделана операция, 5 крыс были потеряны во время послеоперационного периода и 1 крыса была потеряна во время инфузии, представляющих общий уровень успеха 86%. Средний вес тела 37 крыс, которые в конечном счете инфузии была 608 ± 5 г до операции и 588 ± 6 г на начала инфузии (среднее ± SE; п = 37, p <0,0001 по парного критерия Стьюдента). Следующие результаты были получены представителем в 2 инфузии группы:. Saline (SAL) и глюкоза + Интралипид (GLU + IL) фиг.2А и
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Хотя в ряде предыдущих исследований использовали хронических вливания глюкозы (например, 10-15) или липиды (например, 16,17) у грызунов, по нашим данным комбинированной инфузии обоих видов топлива сообщалось только у мышей 18. Модели хронического инфузия, представленные здесь имеет ряд преимуществ для изучения влияния на питательных избыток на различные биологические функции у крыс. Во-первых, оно не связано с генетически ожирением грызунов, а с общим ожирением у людей ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Винсент Poitout является соучредителем и получила контрактов на проведение исследований от Bêtagenex Инк, контрактная исследовательская организация, которая предлагает вливания модель, представленная в этой статье как коммерческая услуга.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке Национального института здоровья (R01DK58096 Винсенту Poitout). Винсент Poitout заведует кафедрой исследований в Канаде Диабет и панкреатических бета-клеток. Бадер Zarrouki получил пост-докторские стипендии от Merck и Eli Lilly. Ghislaine FONTES была поддержана пост-докторские стипендии от Канадской Ассоциации Диабета.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Физиологический раствор 0,9% | BD | JB1324 | |
| Декстроза 70% | Интралипид McKesson | ||
| 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Метрикид (глутаральдегид 2,6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Гепарин натрия 10,000 USP u/ml PPC | |||
| Карпрофен | метакам | ||
| Гликопирролат | Сандоз | ||
| изофлуран | Abbott | ||
| Хлогексидин 2% | |||
| Спирт 70% | |||
| Йод | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Соединитель 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Вертлюжок 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-образный разъем 22G | Instech Solomon | ||
| Противовес и рычаг | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G тупые иглы | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G канюляционные штифты | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Шнуры (12 дюймов) | Lomir | RT12D | |
| Инфузионные куртки | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Тросовая насадка | Lomir | RS T1 | |
| 60 мл шприц | BD | 309653 | |
| шприц 1 мл | BD | 309602 |
Ссылки
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al. Glucolipotoxicity of the pancreatic beta cell. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 289-298 (2010).
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P. The genetics of human obesity. Nature Reviews. Genetics. 6, 221-234 (2005).
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
