$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Фиксация
Фиксаторы являются канцерогенными, перчатках и обращаться с фиксаторами в вытяжном шкафу. Если не указано иное, все сделано инкубации на льду и все решения должны быть отфильтрованы перед использованием. Использование электронной микроскопии класса реагентов.
День 1
- После экспериментальных условиях (например, вирусные инъекции, медикаментозное лечение), поместите мембрану с органотипических срезов гиппокампа в 60 х 15 мм полистирола чашке Петри содержащие ледяной 0,1 М фосфатный буфер (фосфатный буфер Соренсена), рН 7,3. Добавить 1 - 2 мл 0,1 М фосфатного буфера непосредственно на кусочки, чтобы держать их холодными.
Важным шагом: Всегда используйте свежеприготовленный буферов и фиксаторов. Убедитесь, что рН буфера находится в пределах желаемого диапазона. Невыполнение этого требования может привести к повреждению клеточных структур.
- Чтобы изолировать подполе CA1 среза, используйтеодноразовые скальпеля, чтобы аккуратно разрезать поперек кусочек рядом с DG, параллельно CA1 слой клеток (рис. 1). Затем вырежьте оставшийся кусочек вертикально, чтобы удалить CA3 подполе и подлежащая ткань. Отрежьте угол среза, чтобы помочь определить верхнюю поверхность ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае отсутствия вирусной поставки интересующего белка требуется, весь кусок ткани могут быть установлены после того, как средства массовой информации удаляется с нежной промыть ледяной буфера. Это то следует вырезать CA1.
Важным шагом: следите за верхней ткани для того, чтобы надлежащим секционирования сетей в дальнейшем.
- Осторожно выньте ткань из мембранных использованием обратной стороне скальпель. С помощью пипетки Пастера, чтобы мягко передать тканей на 12-луночный планшет, содержащий 0,1 М фосфатного буфера.
- Снимите буфер в колодец, из пластины и добавить 500 м иU, L - 1 мл ледяной фиксатором (рН 7,3) состоит из следующих: 0,1% пикриновой кислоты, 1% параформальдегида и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера. Выдержите в течение 2 часов при температуре 4 ° C.
ПРИМЕЧАНИЕ: пикриновой кислоты может быть взрывоопасной, когда сухо. Держите его смачивают водой в плотно закрытой таре. Хранить в сухом и хорошо проветриваемом месте.
- Снимите фиксатор из колодца и мыть образцы 3 раза (20 мин каждая) в 0,1 М фосфатного буфера.
- Инкубировать в течение 40 мин в 1% дубильной кислоты (вес / объем) в 0,1 М малеат буфера, рН 6,0.
- Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера.
- Инкубировать в течение 40 мин в 1% уранилацетата (вес / объем) в малеата буфера в темноте. Уранилацетата чувствителен к свету и является радиоактивным. Накройте стакан с Parafilm при растворении и хранить неиспользованную буфера в темноте при 4 ° C.
- Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера.
- Инкубировать в течение 20 мин в 0,5% платины хлораIDE (вес / объем) в малеата буфера.
- Промыть два раза (20 мин каждая) в малеата буфера. Храните образцы при 4 ° С, пока они не готовы для дальнейшей обработки.
2. Обезвоживание и внедрения
Окись пропилена является канцерогенным. Избегайте паров работать с ней в вытяжном шкафу. Используйте абсолютный, 100% чистого этанола, который содержит никаких следов воды. Разбавить это абсолютный этанол для производства различных концентрациях для обезвоживания.
День 2
- Выдержите в течение 5 мин в 50% этаноле, а затем в течение 5 мин в 70% этаноле.
- Инкубировать в течение 15 мин в свежеприготовленный 1% р-фенилендиамин (PPD) в 70% этаноле.
- Промойте три раза в 70% этаноле.
- Выдержите в течение 5 мин в 80% этанола, а затем в течение 5 мин в 95% этаноле.
- Инкубируйте в 100% этанола в два раза 5 мин.
- Подготовить стеклянные флаконы с винтовой крышкой и убедитесь, что они чистые и абсолютно сухими. Передача кусочки стеклянные флаконы имаркировать каждый флакон просто и ясно.
- Выдержите в течение 5 мин в смеси 1:1 этанол: оксид пропилена.
- Инкубируйте в 100% окиси пропилена в два раза 5 мин.
- Добавить смолы (Epon) для каждого флакона, чтобы сделать смесь 1:1 с окисью пропилена. Тщательно перемешать в течение 2 часов. Не трясите флаконах слишком строго, чтобы предотвратить пузыри, которые могут помешать вложения.
- Добавить смолой, чтобы сделать смеси 3:1 с окисью пропилена, и перемешивают в течение 2 часов.
- Переход на 100% смолы и инкубировать O / N.
День 3
- Сэндвич образцов между полосами ACLAR пластика и лечение в течение 24 ч при температуре 60 ° C.
3. Секционирование и монтаж на сетях
День 4
- Вырезать полу-тонкие (0,5 мкм) разделов и пятно с 1% толуидиновым синим + 1% буры, чтобы определить правильную ориентацию образцов.
- Вырезать ультратонких срезов (60 нм) и установить на никелевой сетки, одна секция в сетку.
4. Иммуногистохимия
Все буферы и воду следует фильтровать перед использованием.
День 5
- Место падения (~ 50 мкл) 1% Tween-20/phosphate буфера (T / PB), рН 7,5, на кусок чистой Parafilm на плоской поверхности. Аккуратно поднимите сетку с чистой щипцы по краю и плавать его на буфер, в разделе вниз, и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Слейте лишнюю жидкость из сетки, создав раздел вверх на фильтровальную бумагу и затем плавают на 50 мМ глицина в T / PB в течение 15 мин при комнатной температуре.
Важный шаг: во избежание чрезмерного "перенос" решений от одного решения капли на следующий течение инкубации, слейте лишнюю жидкость, слегка касаясь края сетки на # 1 фильтровальную бумагу между решением изменений. Кроме того, удалите любое решение в ловушке между руками EM щипцы проведения сетку, аккуратно влагу с кусочек фильтровальной бумаги между руками щипцами в то время как ensuпозвонить в разделах не высыхают полностью.
- Высушите сетку с фильтровальной бумагой, а затем плавают на блокирующий раствор, содержащий 2,5% BSA и 2,5% сыворотки от животных вторичных антител в T / PB в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубируйте с первичными антителами (в т / PB) при комнатной температуре или O / N при 4 ° C. Оптимальное время и температуру инкубации, а также концентрации антител, должны быть определены экспериментально.
- Промойте сетку в три раза (2 мин каждая) с T / PB.
- Инкубируйте с вторичными антителами (1:20 анти-кролик или анти-мышь соединена с 10 нм золота) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Вымойте три раза (2 мин каждая) с T / PB.
- Postfix с 2% глутаральдегида в Т / PB в течение 5 мин.
- Вымойте три раза (2 мин каждая) с Т / PB, а затем три раза (2 мин каждая) с фильтрованной водой.
- Инкубируйте с 2% уранилацетата в воде в течение 10 мин.
В то время как сетка окрашивание, подготовить CO 2-бесплатные камеры placinга кусок Parafilm в центре стеклянное блюдо Петри. Затем поместите 4-6 гранулы NaOH в блюдо вокруг Parafilm поглощать CO 2 в воздухе. Держите верхний закрыта в течение нескольких минут. С помощью пипетки Пастера и быстро передавать небольшие объемы раствора цитрата свинца Рейнольдса в Parafilm в стеклянном блюде Петри. Откройте верхний достаточно вставить пипетки Пастера, чтобы свести к минимуму повторное введение CO 2 в камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы ведущий раствора цитрата Рейнольдса, кипятить 100 мл деионизированной воды в микроволновую печь и дайте остыть в герметичном контейнере. В 50 мл мерную колбу с пробкой, смесь 1,33 г нитрата свинца, 1,76 г цитрата натрия и 30 мл кипяченой воды путем встряхивания энергично в течение 1 мин. Затем встряхнуть с перерывами в течение 30 мин. Для этого мутный раствор, добавьте 8 мл 1 М раствором гидроксида натрия и медленно перевернуть колбу несколько раз. Решение станет ясно. Доведите раствор до 50 мл с вареной ватер. Хранить раствор плотно закрытыми. Если появляется осадок, выбросить и сделать новую.
- В трех небольших стаканах подготовить теплую, свежекипяченой деионизированной воды. Смыть уранилацетата путем погружения сетки в первый стакан и осторожно закружить вокруг в течение 30 сек. Повторите этот шаг, в других двух стаканах.
- Откройте крышку стеклянной посуде Петри достаточно, чтобы поместить сетку на каплю раствора цитрата свинца Рейнольдса. Если это возможно, носить маску, делая это, чтобы избежать вдыхания на цитратом свинца и для предотвращения образования осадка. Инкубировать в течение 10 мин.
- Откройте верхний достаточно, чтобы удалить сетку. Избегайте вдыхания на цитратом свинца. Промойте сетку в три раза путем погружения его последовательно в трех стаканах теплой, свежекипяченой дистиллированной воды. Пусть сетка сухая на кусок фильтровальной бумаги, раздел вверх. Образец готов к электронным микроскопом.