Графен Покрытия для биомедицинских имплантатов

Краткое содержание

Графен предлагает потенциал в качестве материала покрытия для биомедицинских имплантатов. В этом исследовании мы демонстрируем метод для покрытия сплавов нитинола с нанометровой толщины слоев графена и определить, как графен может повлиять на имплантат ответ.

Аннотация

Атомно-гладкой графена в качестве покрытия поверхности имеет потенциал для улучшения свойств имплантатов. Это свидетельствует о методе для покрытия сплавов нитинола с нанометровой толщины слоев графена для применения в качестве материала стента. Графен был выращен на медной подложке с помощью химического осаждения из паров, а затем переносится на нитинола субстратов. Для того, чтобы понять, как графен покрытие может изменить биологическую реакцию, жизнеспособность клеток из аорты крыс клетки эндотелия аорты крыс и клетки гладкой мускулатуры исследована. Кроме того, влияние графена покрытий на клеточной адгезии и морфология была рассмотрена флуоресцентной конфокальной микроскопии. Клетки были окрашены для актина и ядер, и там были заметны различия между нетронутые образцы нитинола по сравнению с графен покрытых образцов. Всего выражение актина из аорты крыс клетки гладкой мускулатуры была найдена с помощью вестерн-блот. Адсорбции белка характеристики, показатель для потенциальных тромбогенности, шпрежде чем определяться для сывороточного альбумина и фибриногена с гель-электрофореза. Кроме того, перенос заряда из фибриногена на подложку была выведена использованием спектроскопии комбинационного рассеяния. Было установлено, что графен покрытия на подложках нитинола встретился функциональные требования к стент материала и улучшить биологическую реакцию по сравнению с непокрытыми нитинола. Таким образом, графен покрытием нитинола является реальным кандидатом на стент материала.

Введение

За последние три десятилетия стали свидетелями открытия новых материалов на основе методов лечения и устройств для болезни лечения и диагностики. Новые материалы, такие как сплав нитинола (НИТИ) и нержавеющая сталь часто используется в биомедицинских имплантатов производства в связи с их превосходными механическими свойствами. ^1-3 Однако многочисленные проблемы остаются в связи с экзогенными цитотоксичности материалов, био-и гемо-совместимость. Металлический характер этих сплавах приводит к плохому био-и гемосовместимость из-за выщелачивания металлов, отсутствие клеточной адгезии, пролиферации и тромбоз, когда он вступает в контакт с протекающей крови (например, катетеры, трансплантатов кровеносных сосудов, сосудистые стенты, искусственные клапаны сердца и т.д.). ^{1., 4, 5} взаимодействия белков или живые клетки с поверхности имплантата может привести к сильным иммунологического ответа и последующий каскад биохимических реакций, могут негативно повлиять на функциональность устройства. Таким образом, он Пертинных для достижения контроля над взаимодействием между биомедицинских имплантатов и окружающих его биологической среде. Модификация поверхности часто используется, чтобы уменьшить или предотвратить неблагоприятные физиологические реакции, происходящих из имплантата материала. Идеальное покрытие поверхности, как ожидается, имеют высокую прочность сцепления, химической инертностью, высокой гладкостью, и хороший гемо-и биосовместимости. Ранее многочисленные материалы, в том числе алмазоподобного углерода (DLC), SiC, TiN, TiO ₂ и многих полимерных материалов были протестированы как био-совместимого покрытия поверхности имплантата. ^{1, 6-23} Тем не менее, эти материалы до сих пор не в состоянии удовлетворить все функциональным критериям подходящее покрытие поверхности имплантата.

Открытие атома толстым слоем SP ² углерода, известный как графен, открыла двери для разработки новых многофункциональных материалов. Графен как ожидается, будет идеальным кандидатом на покрытие поверхности имплантата, поскольку онаявляется химически инертным, атомно-гладкой и очень долговечный. В этом письме мы исследуем жизнеспособность графена в качестве поверхностного покрытия для биомедицинских имплантатов. Наши исследования показали, что графен покрытием нитинола (Gr-NiTi) отвечает всем функциональным критериям, и дополнительно поддерживает отличную гладкую мускулатуру и рост эндотелиальных клеток, ведущих к лучшему клеточной пролиферации. Мы также обнаружили, что сывороточный альбумин адсорбции на Gr-NiTi выше, чем фибриногена. Важно отметить, что (I) наши детальные спектроскопические измерения подтвердили отсутствие переноса заряда между графена и фибриногена предполагая, что графен покрытие подавляет активацию тромбоцитов с помощью имплантатов, (II) графена покрытия не проявляют каких-либо значительных в пробирке токсичности для клеток эндотелия и гладкой мускулатуры клеточных линий, подтверждающих их биосовместимости, и (III) графена покрытия химически инертны, прочная и непроницаемая в потоке крови среды. Эти гемо-и биосовместимые свойства, наряду с высокими йrength, химическая инертность и долговечность, делают графен покрытий в качестве идеального покрытия.

Протокол

1. Графен-покрытия NiTi

1. Графеновых образцов, используемых в данном исследовании, были выращены на медь (Cu) подложках с использованием химического осаждения из паровой техники, а впоследствии переданы до 4,5 мм ² NiTi субстратов.
2. Cu фольга (1 см х 1 см) помещали в 1 дюйм кварцевой трубчатой ​​печи и нагревают до 1000 ° С в присутствии 50 SCCM Н ₂ и 450 SCCM Аг.
3. Далее, метан (1 и 4 SCCM) был введен в печи при различных скоростях потока в течение 20-30 мин. Образцы были, наконец, охлаждают до комнатной температуры в токе H _2, Ar и CH _4.
4. Далее, Cu пленки были спин-покрытием ПММА (разбавляют 4% анизола) при 4000 оборотов в минуту последующей термической обработки в течение 5 мин при температуре 150 ° C. Графен прикреплены к PMMA слой был получен путем травления меди фольги использованием Transene Inc, CE-100 травителя, и последующим полосканием в 10% HCl и де-ионизированной воды в течение 10 мин.
5. СПримерами были переданы в NiTi субстратов (4,5 мм ²⁾ и отожженного при 450 ° С в Ar (300 SCCM) и H ₂ (700 SCCM) в течение 2 часов, чтобы удалить ПММА. Наконец, подложки промывают ацетоном, чтобы растворить остаточной PMMA, чтобы получить Gr-NiTi образца. Dilor XY тройного монохроматора решетка была использована для микро-КР характеристик (с помощью 100X цель) все Gr-NiTisamples с 514,5 нм возбуждения от лазерного Ar ⁺ ионов.

2. In Vitro токсичности Gr-NiTi

Аорты крыс эндотелиальных клеток (Cell приложения Inc,) культивировали на желатин покрытием 8 Слайд камер. Для проверки клеточного роста, чистым и Gr-NiTisubstrates были помещены в скважинах без желатина покрытия. Сканирующей электронной микроскопии изображения были получены с использованием Hitachi S-4800 SEM. Кроме того, крысы гладкомышечных клетках аорты были также выращивается в CellBind 96-луночные планшеты в качестве контрольной группы (Corning) в Dulbecco, модифицированная Eagle Medium (ATCC).

1. Для проверки жизнеспособности клеток, клеток (как эндотелиальных и гладкомышечных клеток) высевали на 10 ⁵ клеток / лунку в лунках, содержащих нетронутой NiTi, 1 SCCM или 4 SCCM Gr-NiTi субстратах, где заявил, SCCM соответствует потока метана, используемые в CVD роста графена. Клетки выращивались на нужный период времени в инкубаторе при температуре 37 ° C и 5% CO _2, обмен СМИ каждый день.
2. В момент времени конца, средств массовой информации была удалена и свежей среде, содержащей 0,5 мг / мл тиазолил тетразолия бромид (или МТТ получил от Sigma) добавляют в каждую лунку. Затем клетки инкубировали еще в течение 3 часов. Для анализа МТС, средств массовой информации была удалена в конечной точке времени и заменены 120 мкл рабочего раствора МТС (сотовый уровня 96 водных, Promega) и выдерживают в течение 3 часов.
3. Далее, средства массовой информации были аккуратно удалены и 100 мл диметилсульфоксида (Sigma) добавляли к каждой лунке. После аллоКрыло 10 минут для МТТ кристаллы растворяются, раствор переносили в другую и пластины. Для анализа МТС, не диметилсульфоксида добавляли в лунки. Ну содержания были перемещены в новую пластинку.
4. Поглощение было читать при 490 нм и процента жизнеспособности определяется путем нормализации поглощения в средней оптической плотности образца NiTi нетронутой. По меньшей мере пять повторов было сделано для каждого типа образца.

3. Конфокальной микроскопии исследования морфологии клеток

1. Для конфокальной микроскопии крысы гладкомышечных клетках аорты, субстраты были размещены в 8-камера слайд (Thermo Scientific). Клетки высевали на 25000 клеток / камеру и выдерживают в течение 3 дней при 37 ° C и 5% CO _2.
2. Клетки фиксировали на подложке с 4% формальдегида в фосфатном буферном растворе в течение 20 мин.
3. Пермеабилизированных с 0,1% Triton-X течение 1 мин.
4. Актина окрашивали Alexa Fluor 488 фаллоидином (Lifэлектронной технологии). 100 мкл alexafluor 488 фаллоидином на 200 ЕД / мл в метаноле добавляли к 1,9 мл фосфатного буферного раствора. Клетки окрашивали 250 мкл alexafluor 488 фаллоидином в течение 45 мин, а затем дважды промывают фосфатным буферным раствором.
5. Ядра были установлены с VectaShield флуоресцентные монтаж среде, содержащей DAPI (Vector Laboratories). Конфокальной изображения были собраны с помощью конфокальной Nikon TI. Камера высевают с клетками без подложки был использован в качестве контроля.

4. Адсорбции белка исследований

1. Субстрат размеры были измерены с суппортами перед началом адсорбции белка экспериментов. Три измерения проводились для каждой стороны примерно квадратных образцов и в среднем, чтобы получить длину и ширину.
2. Каждый образец, нетронутые NiTi, 1sccm и 4sccm Gr-NiTiwere инкубировали с 1 мг / мл альбумина в фосфатным буферным раствором (PBS) или 1 мг / мл фибриногена в PBS при комнатной тemperature в течение 3 часов.
3. Alike образцы были объединены в микроцентрифуге трубки с 200 мкл буфера для образца сокращения и кипятят в течение 5 мин.
4. Образцы затем разбавляют в Tris / глицин / SDS буфера (Bio-Rad) и запустить через 4-15% трис электрофореза в полиакриламидном геле (Bio-Rad) при 90 V на 100 мин.
5. Гели затем окрашивали SYPRO Red. Развести SYPRO Red (Life Technologies) раствор в 1:5,000 в 7,5 V / V% уксусной кислоты. Пятно гель в течение 60 мин.
6. Изображение гели использованием Flourchem SP (Alpha Innotech). Флуоресцентная интенсивность количественно, используя ImageJ программного обеспечения. Интенсивности флуоресценции от каждого образца была нормирована общей площади подложки и адсорбции фибриногена был по сравнению с альбумином адсорбции.

5. Вестерн-блоттинга для экспрессии белка

1. Вестерн-блоттинга было проведено с целью анализа общего актина в аорты крыс клетки гладких мышц. Клетки высевали на 10000 клеток / субстрата в 96-WELL пластины.
2. Клетки выращивались в течение трех дней перед снятием средств массовой информации. Всего белок извлекается с помощью буфера RIPA и стандартный BCA анализа (Lamda) был проведен количественно общего белка.
3. Образцы разбавляют до той же концентрации в RIPA, а затем варят в снижении буфера для образца в течение 5 мин.
4. Белки отделить от 4-15% Tris полиакриламидном геле с помощью электрофореза на 90 В в течение 100 мин. Калейдоскоп белка стандарт (Bio-Rad) был использован для оценки белок молекулярной массой.
5. Белки были перенесены на мембрану PVDF и блокировали 1% сухого обезжиренного молока (Bio-Rad) решение.
6. Всего актин был помечен с кроликом анти-крыса актин антител (Sigma). BM хемилюминесцентный комплект (Roche) был использован для обнаружения первичных антител. Мембраны были обследованы использованием FlourChem SP съемочной аппаратуры и интенсивность флуоресценции измеряли с помощью ImageJ программного обеспечения. Флуоресцентные интенсивность нормирована по сравнению с PRIСтайн NiTisample.

Результаты

На рис. 1) сердечно-сосудистых заболеваний выросла поликристаллического графена на Cu пленки имитирует металл кристаллических зерен (масштаб: 10 мкм). б) спектр комбинационного рассеяния из 1 SCCM (4 SCCM) графен показывает группу интенсивного (относительно слабые) G 'указывает монослоя (несколько слоев) характер, как подготовленные графена. в) АСМ изображение графен переносится на NiTi пока...

Обсуждение

Биосовместимости и цитотоксичность: химическое осаждение из паровой фазы (CVD) метод дал поликристаллических образцах графена, что передразнил Cu кристаллических зерен, как показано на рисунке 1а. Мы использовали спектроскопии комбинационного рассеяния света, чтобы подтвердить наличие монослоя (несколько слоев) графена на 1 SCCM (4 SCCM) образцов (см. рис 1b). Очевидно, что 1 SCCM (4 SCCM) образцов наблюдаются интенсивные группы (относительно слабые) G 'свидетельствует о мо...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
			Реагент
Дульбекко изменения Eagle Средний	ATCC	30-2002
Тиазолил тетразолия метила	Sigma-Aldrich	M2128
CellTiter 96 Водный Одним из решений пролиферации клеток анализа (МТС)	Promega	G3582
Диметилсульфоксид	Sigma-Aldrich	D8418
36,5% формальдегидом	Sigma-Aldrich	F8775
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Alexafluor 488 фаллоидином	Life Technologies	A12379
VECTASHIELD монтажа среду с DAPЯ	Vector Laboratories	H-1200
Сывороточного альбумина человека	Sigma-Aldrich	A9511
Фибриногена человека
Tris / глицин / SDS	Bio-Rad	161-0732
Готовый гель Трис-HCl Gel	Bio-Rad	161-1158
Уксусная кислота	Sigma-Aldrich	45726
SYPRO красный	Life Technologies	S-6653
Белки низкой анализа BCA	Lamda Biotech	G1003
Precision Plus Standard белка калейдоскоп	Bio-Rad	161-0375
Immun-блот PVDF мембраны	Bio-Rad	162-0177
Блоттинга класса блокаторов обезжиренного сухого молока	Bio-Rad	170-6404XTU
Anti-актин антитела производятся в кролика	Sigma-Aldrich	A2066
BM Хемилюминесценция вестерн-блоттинга комплект (мышь / кролик)	Roche Applied Science	11520709001
RIPA буфер	Sigma-Aldrich	R0278
NiTi (51% Ni, 49% Ti)	Альфа-Aesar	44953
			Оборудование
Horiba JobinYvon	Спектрометр комбинационного рассеяния	Dilor XY 98
Nikon	Конфокальной микроскопии	Затмение TI микроскопом
Thermoscientific	Ридер
Bio-Rad	Источник питания	164-5050	PowerPac основного источника питания
Bio-Rad	Электрофорез клетки	165-8004	Мини-PROTEAN тетра клетки
Bio-Rad	Гель для держателя кассеты	170-3931	Мини гель держатель кассеты