Генерация неприсоединения функциональной ткани миокарда Через микроконтактной печати

Краткое содержание

Поколение унифицированных ткани миокарда является ключевым требованием для адаптации последних достижений в области биологии стволовых клеток в клинической полезных целей. Здесь мы описываем подход микроконтактной печати для точного контроля формы и функционирование клеток. Использование высокоочищенного популяций эмбриональных стволовых клеток, полученных кардиальных предшественников, мы затем генерировать анизотропные функциональной ткани миокарда.

Аннотация

Расширенный сердечная недостаточность представляет собой крупный неудовлетворенной клинической проблемой, возникающие в связи с потерей жизнеспособности и / или полностью функциональный клетки сердечной мышцы. Несмотря на оптимальную медикаментозную терапию, сердечная недостаточность представляет собой основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальной и больной человеческой физиологии миокарда в пробирке. Кроме того, серьезные проблемы в регенеративной биологии сердечной вращаются вокруг выявление и изоляция пациента конкретных кардиальных предшественников в клинически значимых количествах. Эти клетки должны быть собраны в функциональные ткани, которая напоминает родной архитектуры ткани сердца. Микроконтактной печати позволяет создавать точные micropatterned белка формы, которые напоминают структурной организации сердца, обеспечивая тем самым геометрическую сигналы для контроля клеточной адгезии пространстве. Здесьмы описываем наш подход для выделения высокоочищенного клеток миокарда из плюрипотентных стволовых клеток дифференциации в пробирке, поколение рост клеток поверхности micropatterned с белками внеклеточного матрикса, и сборка стволовых клеток, полученных клетки сердечной мышцы в анизотропном ткани миокарда.

Введение

Несмотря на последние достижения в области медикаментозной терапии, тяжелой сердечной недостаточностью остается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Клинический синдром возникает в результате потери функциональной ткани миокарда, а затем неспособности сердечной недостаточности для удовлетворения метаболических потребностей пострадавших лиц. Так как сердце имеет ограниченный регенеративной способностью, аутологичной трансплантации сердца является единственным текущей клинической терапии принимается непосредственно направленные на восполнение потерянных функциональной ткани сердца. Значительные недостатки трансплантации сердца, в том числе ограниченного числа доноров сердца и потребность в долгосрочных иммуносупрессивной терапии, препятствует широкому распространению использования этой терапии. В результате, медикаментозная терапия была основным методом лечения для пациентов с заболеваниями сердца. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальных и больных инфарктом физиологии в пробирке.

Последнее сближение биологии стволовых клеток и технологии тканевой инженерии ставит новые перспективные направления для регенерации сердца. Создание функциональной ткани миокарда из возобновляемых пациента конкретного источника будет важным шагом вперед в этой области. Это позволит обеспечить развитие болезни специфического клеточного анализа для разработки лекарств и открытие и заложит основу для сердечной регенеративной медицины. Человека эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и, что более важно, человеческого индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток представляют собой потенциально возобновляемых конкретного пациента источник желудочка клеток-предшественников и зрелые миоциты желудочка. Сочетание биологии стволовых клеток и тканевой инженерии стратегии решает эту проблему путем создания функциональной ткани сердца в пробирке, которые могут быть использованы при разработке клеточных анализов для открытия новых лекарств или в восстановительной сердечной подходы для лечения тяжелой сердечной недостаточностью.

_content "> главная задача в регенерации сердца было выявление оптимального типа клеток. широкий спектр клеток были изучены ^1, однако до настоящего времени, хотя и отличаются мультипотентных кардиогенный прекурсоров из различных источников было обнаружено, определение ячейки Источник, который отвечает критическим требованиям, таким как приверженность миогенной судьбу клетки, обеспечение возможности для расширения в естественных условиях или в пробирке и составу функциональных тканей миокарда оказалась центральной проблемой ^2. Ранее мы уже описали двойных трансгенных мышиных системы , которая позволяет изоляции высокоочищенных популяций совершенные прародителями желудочка (CVP) из ЭС клеток дифференциации в пробирке. Мы создали новый двойной трансгенные мыши, которая выражает красный флуоресцентный белок DsRed под контролем Isl1-зависимых энхансер гена и Mef2c расширение зеленого флуоресцентного белка под контролемсердечных конкретных Nkx2.5 усилитель. Основываясь на этой двухцветной флуоресцентной системы репортер, первое и второе поле сердца предшественников из развивающихся ЭС клетки могут быть выделены с помощью флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) в соответствии с их выражением Mef2c и Nkx2.5 генов. CVP напоминают кардиомиоцитов на основе паттерны экспрессии маркеров инфаркта и структурные и функциональные качества ^3, что открывает большие перспективы для сердечной цели регенеративных тканей.

Хотя было много достижений в области тканевой инженерии, имитируя родной сотовой архитектуры остается ключевой задачей. Обычные методы для решения этой проблемы включают посев биологических или синтетических леса с клетками в лабораторных условиях. В связи с рядом недостатков лесов, в том числе быстрой деградации, ограниченные физические и механической стабильностью и низкой плотности клеток ^1,4,5, мы попытались спроектировать эшафот менее тканей. Высокий звукХью сердечных клеток может изменить их местных микроокружения на секрецию белков внеклеточного матрикса, они имеют более ограниченные возможности для самоорганизации в целях стержня формы кардиомиоцитов в отсутствие внеклеточных сигналов. Таким образом, шаблон, который предоставляет клеток соответствующих пространственных и биологические сигналы для составления функциональной ткани миокарда не требуется. Микроконтактной печати решает эту проблему, предоставляя простой и недорогой метод для точного контроля формы клеток, организация и функции ^6-8, все из которых имеют решающее значение для создания унифицированных функциональных ткани миокарда. Она включает в себя использование microtextured полидиметилсилоксана (PDMS) марки с функцией размеров в пределах до 2 мкм ^9, что позволит осаждения белков внеклеточного матрикса на подложки PDMS в точных моделей и таким образом влиять на клеточную адгезию пространстве.

При этом, мы предлагаем объединить технологии биоинженерии тканей с помощью стволовых челл биологии для создания анизотропного функциональной ткани миокарда. Соответственно, мы здесь продемонстрировать нашу недавно опубликованной подход для следующих целей: (1) об образовании поверхностей micropatterned белка на PDMS субстратов микроконтактной печати для создания шаблонов для унифицированных ткани миокарда, (2) выделение высокоочищенных кардиальных предшественников из ЭС клетки дифференциации в пробирке, и (3) комбинация обоих методов для создания соответствие функциональной ткани миокарда.

Протокол

Протокол для создания соответствие функциональной ткани миокарда можно разделить на три основные части. Изготовление мастер micropatterned помощью мягкой литографии не считаются частью следующего протокола, но могут быть сделаны на основе установленных методом ^6.

1. Микроконтактной печати фибронектина на PDMS подложках

1. Смешать Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS эластомера в 10:01 базой для лечения отношение агента и дегазации сборки с помощью эксикаторе, чтобы устранить любые воздушные пузыри.
2. Лечение PDMS против ранее изготовленный мастером с 20 мкм в ширину и 2 мкм высоких хребтов, разделенных расстоянием 20 мкм либо 2 дня при комнатной температуре или 4 часа при температуре 65 ° C для получения microtextured марки PDMS.

* Лечение в эксикаторе Настоятельно рекомендуется, чтобы устранить любые воздушные пузыри.

3. Спин слой PDMS на стекло покровные стекла (например,22x22 мм) при 5000 оборотов в минуту в течение 2 мин с использованием Coater Headway Спин для получения тонких и даже PDMS подложки толщиной 15 мкм.
4. Очистите марок с 70% этанола для удаления пыли и частиц грязи. Позвольте им высохнуть на воздухе.

* Марки могут быть использованы несколько раз, однако, обновление PDMS штампов на регулярной основе рекомендуется из-за истирания поверхности с течением времени.

5. Место марок SPI Плазма-Prep II Плазменные чистое и процесс в течение 1 мин при 275 мТорр оказать PDMS поверхности гидрофильной.

* Кислородной плазмы лечение должно быть наблюдал. Дольше раз лечение может привести к растрескиванию эластомера.

6. Стерилизовать марок с 70% этанола в течение 1 мин. Быстро высыхают при помощи сжатого воздуха.

* Дальнейшие шаги должны быть выполнены в бокс биологической безопасности для поддержания стерильности.

7. Крышка штамп поверхности Fibronectin раствора (50 мкг / мл в DDH ₂ O). Пусть он адсорбирует по крайней мере, 10 мин.
8. Избавьтесь от Фибронектин решение от штампов и быстро высыхают сжатым воздухом.
9. Создание конформного контакта между марками и PDMS субстратов в течение 2 минут и сильно прижать.
10. Промыть micropatterned подложках с DDH ₂ O. Храните их в DDH ₂ O в течение максимум 2-х недель при температуре 4 ° C, если первоначально использовался. Магазин PDMS штампов в DDH ₂ O.

2. Техническое обслуживание двойного трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток

Во-первых, подготовить следующие среды для культивирования ЭС клеток мыши:

Мышиных эмбриональных фибробластов (MEF)-Medium: Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) ES клеток или дифференциации классов, 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)-среда: DMEM, 15% FBS ЭС клеток-класса,1% Non-незаменимых аминокислот (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% Фактор ингибирующий лейкемию (LIF), 0,0007% 2-меркаптоэтанол (2-ME)

1. Пальто 6-луночные планшеты с стерильным 0,1% желатина в DDH ₂ O и пусть она адсорбирует 15 мин при 37 ° C.
2. Добавить MEFs от талых аликвоты в 50 мл PBS в конической трубе и центрифугируют их при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют MEFs в MEF-среде.
3. После адсорбции, аспирации избыточного желатин и добавить MEFs в лунки. Разрешить MEFs 1 день присоединить.

* Аликвоты в 10 миллионов достаточно для MEFs 3 6-луночных планшетах.

4. Когда MEFs приложил, добавьте ES клетки от талых аликвоты в 50 мл PBS в конической трубе и центрифугируют их при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют ЭС клеток в ESC-среде и добавить их в лунки, содержащие MEFs. Культура ЭС клеток в ESC-среде до слияния будет достигнута.

* Как только ЭС клетки достигли слияния, пассажи в RequМРЭО, чтобы избежать разрастания и поддерживать колонии ЭСК.

5. Подготовка ЭС клеток для пассирования. Аспирата ESC-среде и мыть один раз стерильной PBS.
6. Аспирируйте PBS и добавьте 500 мкл трипсина. Процесс 3,5 мин при 37 ° C.
7. Внесите раствор трипсина вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать колонии ES клетки и нейтрализует его с 500 мкл ESC-среде.
8. Прохождение ЭС клеток в зависимости от желаемого соотношения, например, передачу 33 мкл в другую и с заранее подготовленных MEFs для прохождения 1/30. Поддерживать ЭС клеток в ESC-Medium.

* Прохождение соотношение 1/30, позволяет ЭС клеток достичь слияния в течение 3 дней. Прохождение клеток ES в соответствии с вашим графиком дифференциации в пробирке.

3. В пробирке Дифференциация Двухместный трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток и выделение и посев кардиальных предшественников

Во-первых, подготовить followiнг средств массовой информации, необходимых для в пробирке дифференцировку ЭС клеток:

Адаптация-Medium: Средняя Искова изменения Дульбекко (IMDM), 15% FBS ЭС клеток-класса, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME

Дифференциация-Medium: IMDM, 15% FBS Дифференциация классов. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% аскорбиновой кислоты 0,1 М, 0,0007% 2-ME

1. Начало в пробирке дифференциации, когда ЭС клетки достигли слияния. Пальто 10 см культура блюда стерильным 0,1% желатина в DDH ₂ O и пусть она адсорбирует 15 мин при 37 ° C.

* Будьте в курсе продолжительностью в процессе дифференциации пробирке. Она занимает 8 дней до кардиальных предшественников могут быть выделены. Планирование эксперимента соответственно.

2. Урожай ЭС клетки, как раньше. После адсорбции, аспирации избыточного желатин и добавить примерно 1/3-1/2 от суспензии клеток ES в подготовленную культурыблюд, содержащих адаптации среды. Культуры клеток в течение 2 дней.

* Выберите количество ЭС клеток для адаптации в соответствии с вашими экспериментами.

3. Урожай адаптированы ЭС клеток в 50 мл коническую трубку с использованием PBS 1. 5 мл трипсина. Центрифуга диссоциированных клеток ES на 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют их дифференциация-среде.
4. Сделать эмбриоидные тела (ЭТ) около 1000 клеток на 10 мкл падение в 15 см блюд культуры с помощью многоканальной пипетки. Переверните пластины и культуры ЭТ как висит капель в течение 2,5 дней при температуре 37 ° C.
5. Через 2,5 суток, бассейн ЭТ 6-8 см 15 блюд культуры в один при помощи дифференциации среднего и культуре их для дальнейшей 3,5 дня при температуре 37 ° C.
6. Через 3,5 суток, собирать ЭТ в конической трубе 50 мл, и пусть они опускаются на дно в течение примерно 5 мин. Подлизываться супернатант и мыть ЭТ стерильной PBS. Пусть ЭТ опускаться на дно для окoximately 5 мин.
7. Диссоциируют ЭТ путем обработки их 2. 5 мл трипсина в течение 2 мин на водяной бане при температуре 37 ° C встряхивании трубки тихо. Затем добавьте 2. 5 мл стерильной PBS к решению трипсина и пипетки вверх и вниз с 10 мл серологической пипетки примерно в 8-10 раз, чтобы сломать клетку кластеров. Нейтрализовать трипсина с 10 мл буфера FACS, содержащий 7,5% FBS ES клеток или дифференциации класса и 0,01% DAPI в PBS.
8. Центрифуга диссоциированных ЭТ при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют их примерно 1 мл буфера FACS. Внесите вверх и вниз с 1 мл пипетки примерно в 8-10 раз, чтобы сломать клетку кластеров.

* Добавить FACS буфера в соответствии с предполагаемой суммы диссоциированных EB. Слишком высокая концентрация клеток может привести к засорению во время FACS и слишком низкой концентрации клеток может продлить FACS времени без необходимости.

9. Передача клетки в стерильный с круглым дном трубки с 35 мкм ячейки фильтра для получениясуспензии отдельных клеток.
10. Сортировать дифференцированных клеток ES использованием Цитометр FACSAria потока и получения очищенного населения CVP.

* Мы разработали многоступенчатый стробирования стратегия изоляции высокоочищенных цветных клеток. Короче говоря, мы первыми воротами на переднем Амплитуда рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния амплитуда (SSC-A) (рис. 1А). Это позволяет отделить целые клетки от продуктов распада клеток. Затем ворота на FSC-и вперед Scatter-Ширина (FSC-W) (рис. 1б). Это позволяет нам выделить ячейки синглетов из дублетов и другие клеточные агрегаты. Затем ворота на SSC-и бокового рассеяния-Ширина (SSC-W) (рис. 1С). Это повышает чистоту клетки майки. Затем ворота на DAPI окрашивания, чтобы изолировать жизнеспособных клеток (DAPI-отрицательные) от нежизнеспособных клеток (рис. 1D). Затем ворота на Phycoeryhthrin Амплитуда (PE-A) и PE-красителя 7 Амплитуда (PE-Cy7-A), чтобы получить истинное красный положительный (R ⁺ ) и истинный красный отрицательным (R ^-) клеток и исключить аутофлуоресцентной красно-негативные клетки (рис. 1E). R ⁺ и R ^- клетки затем закрытом отдельно на флуоресцеина изотиоцианат Амплитуда (FITC-A) и PE-для сортировки истинный зеленый положительный (G ⁺⁾ и истинный зеленый отрицательных (G ^-) клеток внутри этих групп населения (рис. 1F + 1G). Этот результат в 4 популяциях клеток следующим образом: R ⁺ G ^+, R ⁺ G ^- R ^- G ⁺ и R ^- G ^- (рис. 1H).

11. Пассивации micropatterned подложках с 1% Pluronic F-127 в DDH ₂ O в течение 10 мин. Затем промойте их 3 раза стерильной PBS.

* Pluronic F-127 представляет собой поверхностно-активное вещество, которое блокирует клеточную адгезию. Он поддерживает заключение клеточной адгезии к micropatterned области.

12. Прикрепить PDMS прокладки вокруг узорные областии плотно прижмите. Затем семена CVP на Фибронектин субстратов micropatterned.

Результаты

FACS очистки в пробирке дифференцированных клеток ES показали четыре различных популяций предшественников (рис. 1). Наличие micropatterned Фибронектин была подтверждена иммунофлюоресценции микроскопии, что отображается полная передача непрерывных линий фибронектина (рис. 2). Покрытие из FACS изолированные предшественников на Фибронектин micropatterns в результате выравнивания R ⁺ G ⁺ и часть R ^- G ⁺ населением. Хотя Pluronic F-127 в к...

Обсуждение

В этом протоколе, мы представили метод, чтобы изолировать очищенной популяции кардиогенный предшественников и семя их на micropatterned субстратов фибронектин, что позволяет им согласовать и принять сердечных миоцитов, как стержень формы. Нормальный клеточной организации имеет решающее значение для нормальной функции тканей ^8,10, в частности, для ткани миокарда. Кардиомиоцитов было показано, что развитие улучшенными механическими ^11,12 и ^11,13 электрофизиологических свойств при формирова...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Название материала	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
L-аскорбиновая кислота	Sigma-Aldrich	A4544	Подготовить 0,1 М раствор в DDH 2 O
Эксикатор, вакуумные 10 дюймов	Nova-Tech International, Inc	55206
4 ',6-диамидино-2-фенилиндола, дигидрохлорид (DAPI)	Life Technologies	D1306
Дульбекко изменения Eagle Средний	Thermo Scientific	SH30022.01
DPBS	Gibco	14190
FACSAria II потока Цитометр	BD Biosciences
Плод бычьего сывороточногоЭСК-класса	Близнецы Bio-Products	100-106
Фетальную телячью сыворотку Дифференциация классов	Близнецы Bio-Products	100-500
Фибронектин из бычьей плазмы	Sigma-Aldrich	F4759	Растворить в 1 мг / мл в DDH 2 O
Fisherfinest Премиум покровного стекла 22x22mm	Fisher Scientific	12-548-B
Желатин из кожи свиньи	Sigma-Aldrich	G1890	Подготовка 0,1% раствор в DDH 2 O
Coater Headway Спин	Headway Research, Inc	PWM32-PS-CB15
Iscove, модифицированная Дульбекко Средний	Thermo Scientific	SH30228.01
Ингибирующий лейкемию фактор	СамПодготовлен с LIF-секретирующих клеточных линий		Подготовка 500x раствора
MEM Номера для незаменимых аминокислот	Gibco	11140-050
2-меркаптоэтанол	Sigma-Aldrich	M6250
Мышиных эмбриональных фибробластов	Собранные со дня 12-15 эмбрионов мышей
Пенициллина-стрептомицина	Gibco	15140-122
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Подготовьте 1% раствор в DDH 2 O
С круглым дном трубки с фильтром 35 мкм ячейки	BD Biosciences	352235
SPI Плазма-Prep II плазменные чистых	Поставки SPI	11005-AB
Sylgard184 Силиконовый эластомер Kit	Dow Corning	184 SIL ELAST KIT 0,5 кг
0,25% трипсина-EDTA	Gibco	25200-056
Вакуумметр	Поставки SPI	11019-AB