Наличие устойчивых микроРНК (микроРНК) в экзосомах породила огромный интерес в качестве нового способа межклеточной коммуникации, на их потенциальную применимость в качестве биомаркеров и в качестве маршрута для терапевтического вмешательства. Здесь мы показываем, экзосома очистка от крови и питательных сред последующей количественной ПЦР для выявления микроРНК время транспортировки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очистка и микроРНК профилирования экзосом полученные из крови и питательных сред
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Стабильные микроРНК присутствуют во всех жидкостях организма, и некоторые циркулирующие микроРНК защищены от деградации путем секвестрации в небольших везикулах, называемых экзосомами. Экзосомы могут сливаться с плазматической мембраной, что приводит к переносу РНК и белков в клетку-мишень. Их биологические функции включают иммунный ответ, презентацию антигена и внутриклеточную коммуникацию. Доставка микроРНК, которые могут регулировать экспрессию генов в клетках-реципиентах через кровь, открыла новые возможности для целевого вмешательства. В дополнение к предложению стратегии доставки лекарств или терапевтических агентов РНК, экзосомное содержимое может служить биомаркерами, которые могут помочь в диагностике, определении вариантов лечения и прогноза.
Здесь мы опишем процедуру количественного анализа микроРНК и матричных РНК (мРНК) из экзосом, секретируемых в крови и средах клеточных культур. Очищенные экзосомы будут охарактеризованы с помощью вестерн-блоттинга на экзосомальные маркеры и ПЦР на мРНК, представляющие интерес. Для валидации экзосомальной морфологии и целостности будут использоваться просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и мечение иммунозолотом. Общая РНК будет очищена из этих экзосом, чтобы мы могли изучать как мРНК, так и микроРНК из одного и того же образца. После проверки целостности РНК с помощью биоанализатора мы проведем количественную ПЦР в реальном времени (qPCR) со средней пропускной способностью для идентификации экзосомальной микроРНК с использованием карт Taqman Low Density Array (TLDA) и исследований экспрессии генов для интересующих нас транскриптов.
Эти протоколы могут быть использованы для количественной оценки изменений экзосомальных микроРНК у пациентов, моделей грызунов и сред клеточных культур до и после фармакологического вмешательства. Экзосомное содержимое варьируется в зависимости от источника происхождения и физиологических условий клеток, которые секретируют экзосомы. Эти вариации могут дать представление о том, как клетки и системы справляются со стрессом или физиологическими возмущениями. Наши репрезентативные данные показывают вариации микроРНК, присутствующих в экзосомах, выделенных из крови мыши, крови человека и питательных сред для клеточных культур человека.
Здесь мы опишем процедуру количественного анализа микроРНК и матричных РНК (мРНК) из экзосом, секретируемых в крови и средах клеточных культур. Очищенные экзосомы будут охарактеризованы с помощью вестерн-блоттинга на экзосомальные маркеры и ПЦР на мРНК, представляющие интерес. Для валидации экзосомальной морфологии и целостности будут использоваться просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) и мечение иммунозолотом. Общая РНК будет очищена из этих экзосом, чтобы мы могли изучать как мРНК, так и микроРНК из одного и того же образца. После проверки целостности РНК с помощью биоанализатора мы проведем количественную ПЦР в реальном времени (qPCR) со средней пропускной способностью для идентификации экзосомальной микроРНК с использованием карт Taqman Low Density Array (TLDA) и исследований экспрессии генов для интересующих нас транскриптов.
Эти протоколы могут быть использованы для количественной оценки изменений экзосомальных микроРНК у пациентов, моделей грызунов и сред клеточных культур до и после фармакологического вмешательства. Экзосомное содержимое варьируется в зависимости от источника происхождения и физиологических условий клеток, которые секретируют экзосомы. Эти вариации могут дать представление о том, как клетки и системы справляются со стрессом или физиологическими возмущениями. Наши репрезентативные данные показывают вариации микроРНК, присутствующих в экзосомах, выделенных из крови мыши, крови человека и питательных сред для клеточных культур человека
Введение
Короткие микроРНК некодирующих модулировать экспрессию генов, связываясь с мРНК-мишенью. Семенной комплементарности последовательностей из ~ 7 пар оснований позволяет микроРНК связываются с мРНК-мишенью в результате ингибирования трансляции или к снижению стабильности мРНК, оба из которых могут привести к снижению экспрессии целевого белка 1. Исследования, проведенные за последнее десятилетие однозначно доказала фундаментальную роль микроРНК в обеспечении клеточных функций. Там был также значительные усилия направляются рассекает микроРНК опосредованной молекулярные изменения, лежащие в основе различных заболеваний 2,3. Кроме того, недавняя идентификация стабильного микроРНК в жидкостях организма 4-6 проложил путь к их использованию в качестве новых биомаркеров поддаются клиническому диагнозу.
Один из режимов микроРНК транспорта в жидкостях организма через экзосомах, мелкие пузырьки, которые несут мРНК, белков, липидов посредников, и микроРНК в клетки-реципиента с помощью системного циркулирующей кровииона 7-14. Это приводит к модуляции экспрессии гена в клетки-реципиенты и представляет собой новый механизм сотовой связи. Например, клетки могут модулировать иммунные регуляторные процессы путем секреции и / или поглощающие экзосомы содержащий биомолекул, участвующих в воспалении, такие как интерлейкин-1β (IL1β), фактора некроза опухоли-α (ФНО), трансформирующий фактор роста-β5 (TGFβ5), а также микроРНК, регулирующие эти гены 13. Как аберрантная экспрессия микроРНК является общей чертой в различных заболеваний человека, эти молекулы предлагаем увлекательные новые возможности для открытия и проверки новых терапевтических мишеней 2.
Циркуляционный микроРНК присутствуют во всех биологических жидкостях, и известно, что состав экзосомы отличается на основе источника клеток, из которых они были освобождены. Таким образом, они предлагают путь к изучению физиологического состояния клеток и, как клетки изменяются в сигнализации дажеTS в ответ на стресс, включая заболевания. Изучение изменений в состав экзосома может дать представление сигнала и исследовать их потенциальную полезность в качестве биомаркеров или терапевтическое вмешательство маршрутов.
Здесь мы продемонстрируем очистки экзосом из нескольких источников на основе опубликованных протоколов. Эти экзосомах будет использоваться для выделения РНК последующим кПЦР для выявления и измерения уровней микроРНК присутствуют в экзосомах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты с использованием образцов крови у человека и грызунов были выполнены с соблюдением всех соответствующих руководящих принципов, правил и регулирующих органов. Человека субъектов были зачислены после дать информированное согласие, утвержденного Drexel University медицинский колледж совета организации и все процедуры исследования, проведенные на животных, были одобрены Институциональные уходу за животными Drexel и использованию комитета.
1. Exosome очистка от крови (~ 5,5 ч)
СОВЕТЫ
- Мы ресуспендируйте экзосомах из одной пробирки с кровью (~ 10 мл крови человека и ~ 2 мл крови мышей) в 300 мкл буфера для лизиса РНК из набора для выделения микроРНК Mirvana.
- Для очистки экзосом из клеточной культуральной среде, носитель центрифугировали при 500 х г в течение 10 мин для удаления клеток и фильтровали через 0,22 мкм фильтр после центрифугирования при 12000 х г. Экзосома очистка от среды для культивирования клетокне требует разбавления в ЗФР, PBS стирки или на вторую стадию ультрацентрифугирования.
- Если очищенных экзосомах будет использоваться для протеомики исследований, добавление центрифугирование в градиенте сахарозы шагом после центрифугирования шаг уменьшения количества белковых агрегатов и загрязнителей 15.
- Наблюдаемая морфология экзосомы может различаться в зависимости от источника и этапы обработки для ПЭМ. Мы не наблюдали чашеобразных морфологии экзосомах которая была ранее отнесенных на различия в обработке образцов 9,15. Наши ПЭМ-изображения, включая метки антител аналогичны предыдущим сообщениям из различных источников, в том числе крови, желчных и корковых культуры полученные экзосомах 9,16,17.
- Инверсия ЭДТА покрытием трубки, содержащей кровь 5x и месте в вертикальном положении при комнатной температуре в течение 10-60 мин.
- Центрифуга при 2000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Собирают верхний слой, плазма, в 15 мл пробирок и держать на льду.
- Развести жидкость с равным объемом PBS. Центрифугируют 30 мин при 2000 х г при 4 ° С.
- Передача в центрифужные пробирки, добавляют 1X PBS в общем объеме 24 мл, и центрифугируют 45 мин при 12000 х г при 4 ° С.
- Трансфер в ультрацентрифуге труб и центрифуги 2 ч при 110 000 мкг при 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок в PBS и центрифугировать 1 часа при 100000 х г при 4 ° С.
- Ресуспендируют осадок в соответствующем буфере (РНК буфера для лизиса).
- Ресуспендируйте в ФБР или RIPA буфер для электронной микроскопии и вестерн-блоттинга соответственно.
2. Очистки РНК с использованием модифицированного Mirvana набора для выделения микроРНК (~ 1 час)
СОВЕТЫ
- Подготовить область выделения РНК носить средства индивидуальной защиты (СИЗ), протирая поверхности и пипетки с РНКазы ун-та, и с использованием стерильных фильтров советы и труб. Хотя протокол от поставщиков дает возможность очистки только микроРНК, мы всегда изолировать общую РНК включая мРНК и микроРНК, чтобы мы могли изучать как из того же образца.
- Добавление в колонку ДНКазы стадии обработки удаляет следы ДНК, которые могут присутствовать. В зависимости от источника экзосом, ДНК, как сообщалось, отсутствуют в экзосомы очищают от некоторых источников, включая человека и мыши мачта клеточных линий 8, но хромосомной ДНК были обнаружены в экзосомы очищают от среды культивируемых кардиомиоцитов 18.
- Мы сократили объем промывочного раствора 1 до 350 мкл (шаг 2.4 ниже), потому что поставщик предоставляет только достаточно промывочный раствор 1 для одного 700 мкл того. Если объем не уменьшается нет достаточного раствор, оставленный для использования всего содержимого комплекта. Остальные шаги были выполнены в соответствии с рекомендациями производителя.
- Добавить 1/10 VOЛуме микроРНК гомогената добавка (30 мкл) и инкубировали на льду в течение 10 мин.
- Экстрагируют объем кислота фенол: хлороформ равно начальному объему лизата. Центрифуга и восстановить верхней фазы в новую пробирку.
- Добавить 1,25 объемами 100%-ного этанола (375 мкл). Vortex. Применить для фильтрации картриджа и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
- Добавьте половину рекомендованного объема микроРНК промывочный раствор 1 (350 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
- Добавить 10 мкл ДНКазы 1 до 70 мкл буфера RDD (Qiagen) для каждого образца. Добавить 80 мкл на колонку и инкубировали 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить промывочный раствор 1 (350 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г.
- Добавить промывочного раствора 2/3 (500 мкл) и центрифуги 15 сек при 10000 х г. Повторить.
- Элюировать 40 мкл 95 ° C нуклеазы без H 2 O.
- Определить концентрацию РНК и РНК разбавить до 100 нг / мкл.
3. микроРНК профилирования экзосом от BlooD Использование Taqman низкой плотности Array (TLDA) Карты (~ 6,5 ч)
СОВЕТЫ
- Подготовить область выделения РНК СИЗ, протирая поверхности и пипетки с РНКазы ун-та, и с использованием стерильных фильтров советы и труб.
- Предварительно усиления (предварительный усилитель) шаг рекомендуется для 1-350 нг РНК (350-1000 нг образцов не требуют предварительного усилителя шагом после синтеза кДНК). Важно определить, является ли предусилитель необходимо для вашего образца, потому что вы должны относиться все образцы на равных условиях. Предварительный усилитель шаг увеличивает стоимость и Ct значения имеют более низкую приемлемым с разрезом (32 вместо 40).
- Это полезно подготовить кДНК реакцию в полосе труб вместо тарелки в зависимости от количества карт, которые могут быть запущены в течение одного дня. Это сведет к минимуму замораживания-оттаивания образцов кДНК, которые не будут обрабатываться в тот же день.
- Экзосомы собранных из разных источников имеет Diff #Аренда количества РНК. Этот протокол позволяет максимум 3 мкл РНК-матрицы для синтеза кДНК реакции. В зависимости от источника, количество экзосомальных РНК, которая может быть выделена, может быть ограничено. В то время как типичный ткани даст достаточно РНК, кДНК, что будет принято от 100 нг РНК в 3 мкл, экзосом из человеческой крови или среды для культивирования клеток, часто содержат менее РНК и ДНК должна быть изготовлена из меньше исходного материала. Экзосомы мышь крови содержат более высокие уровни РНК и по крайней мере 100 нг в 3 мкл может быть получена.
- Чтобы подготовить кДНК из РНК с использованием очищенной Megaplex бассейны обратной транскриптазы праймеров (бассейн и пул B содержат праймеры для микроРНК в микрофлюидном карты массива А и В), оттепели компонентов реакции на льду.
- Этикетка два РНКаз 1,5 мл пробирки для реакции с RT бассейн или бассейн праймеров B праймеров и добавления компонентов в графике порядке. Добавить по крайней мере один дополнительный объем компонентов для 2 или более реакций или сделать мастер-микс в соответствии с рекомендациями тОн поставщика.
| RT компонент реакции | Компонент Концентрация | Объем для 1 выборки (общий V / образец = 4,5 мкл) |
| Нуклеазы без воды | 0,20 мкл | |
| Megaplex RT буфера (10x) | 1X | 0,80 мкл |
| дНТФ (100 мМ) | 4,4 мМ | 0,20 мкл |
| MgCl 2 (25 мМ) | 5 мМ | 0,90 мкл |
| Ингибитора РНКазы (20U/μl) | 2 U | 0,10 мкл |
| Megaplex RT Праймеры А или В (10X) | 1X | 0,80 мкл |
| MultiScribe обратной транскриптазы | 75 U | 1,50 мкл |
- Инверсия трубы 6 раз, и процентаrifuge кратко. Затем пипеткой 4,5 мкл реакции RT смесь в MicroAmp 8-пробирок полосы или 96-луночных MicroAmp оптическая пластина реакции.
- Добавить 100 нг РНК и отрегулируйте громкость до 3 мкл DEPC обработанной воды, добавляют 3 мкл общей РНК, перемешать с кончика пипетки, и запечатать трубы или пластины. Спин кратко и инкубировать на льду в течение 5 мин.
- Загрузите реакции в машину ПЦР и запустите его при следующих условиях (в соответствии с рекомендациями Applied Biosystems протокола Megaplex бассейны):
| Этап | Температура | Время |
| Цикл (40x) | 16 ° C | 2 мин |
| 42 ° C | 1 мин | |
| 50 ° C | 1 сек | |
| Держать | 85 ° C | 5 мин |
| Держать | 4 ° C | ∞ |
- КДНК хранить при -20 ° С (хорошо, по крайней мере одной недели) или продолжать предварительного усилителя шаг, который можно хранить в течение одной недели.
- Оттепель предусилитель праймеров для бассейна и пул B на льду и инвертировать перемешать. Swirl Taqman предусилителя Master Mix и держать на льду тоже.
- Последуйте за диаграммой добавление по меньшей мере одного дополнительного объема компонентов для 2 или более реакций или сделать мастер-микс в соответствии с рекомендациями поставщика.
| Предусилителя компонент реакции | Объем образца в течение 1 |
| Нуклеазы без воды | 7,5 мкл |
| Taqman предусилитель Mix Master (2х) | 12,5 мкл |
| Megaplex предусилитель Праймеры А или В (10X) | 2,5 мкл |
- Внесите 2,5 мкл RT произвоКТ в MicroAmp 8-пробирок полосами или 96-луночных MicroAmp оптическая пластина реакции и обойтись 22,5 мкл предусилитель реакционной смеси в каждую лунку.
- Печать пластины, инкубировать на льду 5 мин, а затем загрузить образец в машине ПЦР. Запуск при следующих условиях.
| Этап | Температура | Время |
| Держать | 95 ° C | 10 мин |
| Держать | 55 ° C | 2 мин |
| Держать | 72 ° C | 2 мин |
| Цикл (12x) | 95 ° C | 15 сек |
| 60 ° C | 4 мин | |
| Держать | 99,9 ° C | 10 мин |
| Держать | 4 ° C | ∞ |
- После предусилителя окончания реакции кратко центрифуги трубы или пластины, а затем добавить 75 мкл 0.1X TE рН 8,0 в каждую лунку или трубки.
- Печать и смешайте и спина кратко. Хранить разбавленный продукт в течение одной недели при температуре -20 ° С или продолжать загружать пластины.
- Смешайте следующие в РНКаз 1,5 мл трубки на льду.
| Компонент | Объем карты в течение 1 |
| Taqman Universal PCR Master Mix, нет AmpErase UNG (2x) | 450 мкл |
| Разводненная предусилитель продукта | 9 мкл |
| Нуклеазы без воды | 441 мкл |
- Переверните пробирку, чтобы смешивать и центрифуги кратко. Внесите 100 мкл ПЦР смеси в каждом порту массива карты Taqman микроРНК.
- Центрифуга карта 2 х 1000 мкг в течение 1 мин. Закройте карту и запустить ее с помощью шаблона, представленного с праймерами в Applied Biosystems ручных и 384 хорошо Taqman Низкая плотность массива параметров. Мы используем Прикладная биосистем 7900HT Быстрая Real-Time PCR System.
4. мРНК Анализ Taqman (~ 1,5 ч)
- Для подготовки кПЦР реакции, смешайте компоненты реакции в порядке, в графике. Все образцы будут проанализированы с праймером зондов для представляющего интерес гена, а также 18S рРНК нормализатор гена.
| Taqman компонент реакции | Объем образца в течение 1 |
| Нуклеазы без воды | 7 мкл (корректировки на основе отдельного образца) |
| Быстрый Taqman Master Mix (2x) | 10 мкл |
| Taqman Primer зондов (20x) | 1 мкл |
| кДНК из 100 нг РНК | 2 & му, L (корректировки на основе отдельного образца) |
- Выполнить 96-луночный планшет использовании функций быстрого 96-а блока в соответствии с рекомендациями производителя (Applied Biosystems 7900HT Быстрая Real-Time PCR System).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
После выделения экзосомы с носителя крови или культуры клеток, чистота экзосомы может быть проверена с помощью электронной микроскопии (ЭМ) и вестерн-блоттинга (фиг.1А и 1В). Мы подтвердили нашу экзосома препаратов из различных источников с Е. М. и вестерн-блоттинга с использованием нескольких антител. 1а представлены EM изображения, подтверждающие, что экзосомах целы диаметром ~ 30 -100 нм и содержат CD81 на метки антител. Обычно используется экзосомальных маркеры Hsp7...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этом протоколе, мы покажем количественное микроРНК и мРНК из экзосомах очищают с помощью дифференциального центрифугирования из крови и питательных сред. Экзосомы имеют различные компоненты в зависимости от их происхождения и участвуют в ряде биологических функций, в том числе иммунного ответа, презентации антигена, внутриклеточные связи и передачи РНК и белков 9,11,12,19,20. В то время как размер и форма является детерминантой экзосома чистоты, число работ, показывающий EM экзосом данные показывают, что эт...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Работа выполнена при поддержке за счет средств от Риты Аллен грант Фонда Seena Аджит. Авторы хотели бы поблагодарить Эрика Балога и доктор Soumitra Ghoshroy из Университета Южной Каролины электронной микроскопии Центр инструмента использования, научно-технической помощи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Вакутайнер с покрытием EDTA (пробирки 10 мл) | BD Diagnostics | 366643 | Для выделения экзосом из крови человека |
| вакутайнер с покрытием EDTA (пробирки 2 мл) | BD Diagnostics | 367841 | Для выделения экзосом из крови мышей |
| PAXgene Blood RNA Tube | BD Diagnostics | 762165 | Для выделения микроРНК |
| микроРНК miRVana набор для выделения микроРНК из | Ambion | AM1561 | |
| Кислота-фенол: CHCl3 | Ambion | 9721G | |
| DNаза 1 | Qiagen | 79254 | |
| TaqMan Универсальная PCR Master Mix, без AmpErase UNG | Applied Biosystems | 4326614 | Для карт TLDA |
| Megaplex RT для грызунов Pool Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444746 | |
| Megaplex предусилитель для грызунов Набор для бассейна v3.0 | Applied Biosystems | ||
| Taqman Array Набор микроРНК A+B V3.0 | Прикладные биосистемы | 4444909 | |
| Megaplex RT Human Pool Набор V3.0 | Applied Biosystems | 4444745 | |
| Megaplex Preamp Human pool набор v3.0 | Applied Biosystems | 4444748 | |
| Taqman Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0 | Applied Biosystems | 4444913 | |
| Taqman Набор для микроРНК | RT Applied Biosystems | 4366596 | |
| Taqman fast universal PCR master mix | Applied Biosystems | 4366072 | Для мРНК qRT-PCR |
| Фактор некроза опухоли (праймер-зонд) | Прикладные биосистемы | Hs01113624_g1 | |
| фактор роста эндотелия сосудов А (праймер-зонд) | Прикладные биосистемы | Hs00900055_m1 | |
| кДНК Maxima First Strand Набор для синтеза для RT-qPCR | Thermo Scientific | K1642 | Для мРНК |
| HSP70 антитела | Abcam | ab94368 | Для вестерн-блоттинга |
| Anti-rabbit IgG-Gold | Sigma | G7402 | Для электронной микроскопии |
| Rabbit-anti CD81 | Sigma | SAB3500454 | |
| никелем 300 меш углеродные формварные сетки | Электронная микроскопия Sciences | FCF300-Ni | |
| Медные углеродные формварные сетки 300 меш | Электронная микроскопия науки | FCF300-Cu | |
| Таблица 1. Таблица конкретных реагентов. |
Ссылки
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
- Mendell, J. T., Olson, E. N. MicroRNAs in stress signaling and human disease. Cell. 148, 1172-1187 (2012).
- Esteller, M. Non-coding RNAs in human disease. Nature reviews. Genetics. 12, 861-874 (2011).
- Mitchell, P. S., et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10513-10518 (2008).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell research. 18, 997-1006 (2008).
- Gilad, S., et al. Serum microRNAs are promising novel biomarkers. PloS one. 3, e3148(2008).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature. 2, 282(2011).
- Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat Cell Biol. 9, 654-659 (2007).
- Gyorgy, B., et al. Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci. 68, 2667-2688 (2011).
- Mathivanan, S., Ji, H., Simpson, R. J. Exosomes: extracellular organelles important in intercellular communication. J. Proteomics. 73, 1907-1920 (2010).
- Ramachandran, S., Palanisamy, V. Horizontal transfer of RNAs: exosomes as mediators of intercellular communication. Wiley Interdiscip Rev. RNA. , (2011).
- Record, M., Subra, C., Silvente-Poirot, S., Poirot, M. Exosomes as intercellular signalosomes and pharmacological effectors. Biochem Pharmacol. 81, 1171-1182 (2011).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9, 581-593 (2009).
- Ludwig, A. K., Giebel, B. Exosomes: small vesicles participating in intercellular communication. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 11-15 (2012).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3 22(2006).
- Masyuk, A. I., et al. Biliary exosomes influence cholangiocyte regulatory mechanisms and proliferation through interaction with primary cilia. American journal of physiology. Gastrointestinal and liver physiology. 299, G990-G999 (2010).
- Fauré, J., et al. Exosomes are released by cultured cortical neurones. Molecular and Cellular Neuroscience. 31, 642-648 (2006).
- Waldenstrom, A., Genneback, N., Hellman, U., Ronquist, G. Cardiomyocyte microvesicles contain DNA/RNA and convey biological messages to target cells. PloS one. 7, e34653(2012).
- Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Rev Proteomics. 6, 267-283 (2009).
- Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. Characterization of extracellular circulating microRNA. Nucleic acids research. 39, 7223-7233 (2011).
- El-Andaloussi, S., et al. Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo. Nature. 7, 2112-2126 (2012).
- Singh, P. P., Smith, V. L., Karakousis, P. C., Schorey, J. S. Exosomes isolated from mycobacteria-infected mice or cultured macrophages can recruit and activate immune cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 189, 777-785 (2012).
- Etheridge, A., Lee, I., Hood, L., Galas, D., Wang, K. Extracellular microRNA: A new source of biomarkers. Mutat. Res. , (2011).
- Stenvang, J., Silahtaroglu, A. N., Lindow, M., Elmen, J., Kauppinen, S. The utility of LNA in microRNA-based cancer diagnostics and therapeutics. Seminars in cancer biology. 18, 89-102 (2008).
- Mathivanan, S., Fahner, C. J., Reid, G. E., Simpson, R. J. ExoCarta 2012: database of exosomal proteins, RNA and lipids. Nucleic acids research. 40, D1241-D1244 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
