Методическая статья

Исследование поляризации Использование макрофагов костного мозга макрофагов

DOI:

10.3791/50323

⸱

23 июня 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Animal Science, Texas A&M University, 2Department of Biology, Texas A&M University, 3Department of Physiology and Pharmacology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В статье описана легко легко адаптивная В пробирке Модель для изучения поляризации макрофагов. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В статье описана легко легко адаптивная в пробирке модель для исследования макрофагов поляризации. В присутствии GM-CSF/M-CSF, гемопоэтические стволовые клетки / клетки-предшественники из костного мозга направлены на дифференциацию моноцитов, а затем М1 или М2 стимуляции. Состояние активации можно отслеживать изменения в антигены на поверхности клеток, экспрессию генов и путей клеточной сигнализации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отличной от классической воспалительной реакции, макрофаги, которые пропитывают ткани часто демонстрируют поляризованного состояния активации, который играет важную роль в регуляции тканей хозяина физиологические функции 1-8. При стимуляции, активации макрофагов можно разделить на классические (M1) и альтернативные (М2) активация 2, 4, 9. M1 активации макрофагов зависит от Toll-подобных рецепторов (TLR,) и активацию ядерного фактора каппа В (NFκB) / с-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1), что приводит к продукции воспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL- 1β и активации иСОА, что приводит к увеличению образования активных форм кислорода, таких как нитрид азота (NO) 10, 11. В противоположность этому, M2 активации макрофагов новобранцев PPAR-, PPAR, или IL-4 STAT6 путей, что приводит к альтернативе, противовоспалительные (М2) активации, которая связана с активацией рецептора маннозы CD206 и аргиназа 1 (Arg1) 6, 12 - 14 </ Вир>.

Костного мозга макрофагов (BMDM) представляют идеал в пробирке модель, чтобы понять механизмы, контролирующие поляризации активированными макрофагами 15. В частности, активация М1 макрофагов может быть индуцирована липополисахаридов (ЛПС) стимуляции, тогда поляризации M2 макрофагов может быть индуцирована IL-4 и / или IL-13. Зрелые костного мозга макрофаги и активированные макрофаги могут быть идентифицированы посредством анализа потока цитометрии экспрессии поверхностных антигенов, в том числе CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 и CD86, 9, 16, 17. Кроме того, изменения в продукции цитокинов и клеточных сигнальных путей, связанных с макрофагами поляризации можно измерить с помощью ОТ-ПЦР и вестерн-блоттинга, соответственно. Таким образом, мыши костного мозга макрофаги могут служить соответствующие модели для изучения макрофаг поляризации в пробирке.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Выделение клеток костного мозга

  1. Изолировать бедра и голени кости от 6-8 недельных мышей, ополоснуть волосы, а затем разрезать кости.
  2. Используйте 21G иглу и шприц объемом 10 мл, чтобы избавиться от мозга в холодной PBS +2% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (3-5 мл / мышь).
  3. Передайте мозга через 21G иглу 4-6 раз для диссоциации клеток.
  4. Проход клеток через 70 мкм сито ячейка для удаления скопления клеток, костей, волос и других клеток / ткани.
  5. Добавить 3 объема раствора NH4Cl (0,8% раствора NH4Cl, Stemcell технологии), и инкубировать на льду в течение 10 мин для удаления красных кровяных телец.
  6. Спином вниз клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° C.
  7. Ресуспендируют осадок клеток в холодном PBS + 2% FBS (20-50 мл, в зависимости от количества клеток).

2. Формирование Индукционная BMDM

  1. Ресуспендируют изолированных клеток костного мозга в питательной среде BMDM (2х10 6 клеток / мл).

BMDM питательной среде:

Исков, модифицированной по способу Дульбекко среды (IMDM) + 10% FBS + 15% фильтровали (фильтр 0,2 мкм) L-929 клетки (АТСС, CCL-1) культурального супернатанта (содержащего моноцитов колониестимулирующий фактор, M-CSF) или 10 нг / мл M -CSF.

Примечание: L-929 клетки супернатант содержит M-CSF 18. Для обеспечения эффективной активности кондиционированной среды, 5 × 10 5 L-929 клетки высевают в T75 см2 колбах в течение 6-7 дней, кондиционированную среду собирали и пропускали через 0,45 мкм фильтр перед использованием. Средний аликвоты можно использовать сразу или хранить в -80 ° С в течение 1-2 месяцев.

  1. Семенной клеток в 6 или 12-луночных планшетах для культуры тканей (в зависимости от плана эксперимента) (Corning Costar).
  2. Изменение свежую среду роста BMDM на 3 день.
  3. На 7 день, образование зрелых BMDM оценивается с помощью анализа проточной цитометриии флуорофором конъюгированных антител для обнаружения клеток, экспрессирующих CD11b и F4/80.

3. BMDM поляризованные Активация

  1. На 7 день менять на свежую среду стимуляции: для активации M1, использовать IMDM, содержащей 10% FBS и 100 нг / мл ЛПС, или 100 нг / мл ЛПС с 50 нг / мл IFN-; для M2 активации использовать IMDM, содержащей 10% FBS с 10 нг / мл IL-4 и / или 10 нг / мл IL-13.
  2. Сбор стимулировали BMDMs путем отделения их от тарелки теплой 0,05% трипсин, с последующей промывкой клетки дважды ЗФР, содержащим 10% FBS.

Примечание: Для отсоединения и ресуспендируют зрелых макрофагов после дифференцировки, 0,05% трипсина раствора (содержащего 0,48 мМ ЭДТА, Invitrogen) или 2-5 мМ ЭДТА в Са и Mg, свободный PBS или сбалансированный буфера Хенкса (HBSS), могут быть использованы. При использовании пищеварительной среды, содержащей трипсин, клетки обрабатывают при 37 ° С в течение менее 10 мин, чтобы избежать потери SurЛицо белки из-за чрезмерной пищеварения.

  1. Использование антител к детекции экспрессии антигенов клеточной поверхности, включая CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 или CD86 в различные моменты времени с использованием стандартных методов проточной цитометрии окрашивания.
  2. Определить экспрессию генов, характерных активированного M1 и M2 макрофагов в том числе IL-1β, TNF-α и IL-6 (M1 активации) или IL-10, IL-13, arginase1 и PPAR-(M2 активации) с использованием QRT-PCR. Определите активацию сигнальных путей клетки участвуют в активации М1 или М2 макрофаги помощи вестерн-блоттинга анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое описание BMDM процедура генерации представлен (Рис. 1). Высокая чистота зрелых макрофагов можно наблюдать на 7-й день, когда они представляют от 95 до 99% + F4/80 CD11b + клеток (рис. 2). Поляризованные макрофаги могут анализироваться с помощью антител против CD11b, F4/80, CD11c и CD206 последующим анализом потока цитометрии. Как показано на рисунке 3, M1 макрофагов определяются как CD11b + F4/80 CD11c + CD206 +-клеток (Q2), а M2 макрофаги CD11b + F4/80 + ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем здесь простые и легко адаптируются в пробирке процедуры, чтобы вызвать активацию макрофагов, полученных из клеток костного мозга предшественников. Эта процедура может быть использована для исследования механизмов, ответственных за поляризации макрофагов. Чистота зрелых макрофагов, полученные с использованием этого протокола среднем от 95 до 99%, и никаких дополнительных процедур очистки не требуется. Для исследования функции специфических генов интересов в контексте макрофаг поляризации, эктопическо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа выполнена при поддержке Американской Ассоциации Сердца (BGIA 7850037 доктору Beiyan Чжоу).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
IMDMThermo ScientificSH30259.01
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen10438-026
Мышиная GM-CSFPeproTech315-03
NH4ClStemCell Technologies7850
L-929ATCCCCL-1
70 μ m клеточный фильтрBD Biosciences352350
10 x PBSThermo ScientificAP-9009-10
Антимышиный CD11b-APCeBioscience17-0112-81
Антимышиный F4/80-FITCeBioscience11-4801-81
Антимышиный CD69-PEeBioscience12-0691-81
Антимышиный CD86-PEeBioscience12-0862-81
Пропидий йодинвитрогенP3566

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis. Circulation. , (2012).
  2. Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization. J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).
  3. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  4. Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
  5. Tabas, I. Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis. Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).
  6. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance. Nature. 447, 1116-1120 (2007).
  7. Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance. Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).
  8. Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation. Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).
  9. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).
  10. Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat. Med. 11, 191-198 (2005).
  11. Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice. Cell Metab. 10, 419-429 (2009).
  12. Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity. Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).
  13. Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties. Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).
  14. Bronte, V., Zanovello, P. Regulation of immune responses by l-arginine metabolism. Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).
  15. Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation. Circulation. 125, 2892-2903 (2012).
  16. Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation. J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).
  17. Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation. J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).
  18. Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor. J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).
  19. Biswas, S. K., Mantovani, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm. Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).
  20. Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas. J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M1 M2

Похожие статьи