Методическая статья

18.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50332

⸱

12 июня 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, University of Heidelberg

В этой статье

Краткое содержание

Моноциты, макрофаги важны клетки врожденной иммунной системы. Здесь мы описываем простой в использовании В пробирке Модель для генерации этих клеток. С помощью центрифугирования в градиенте, отрицательные шарик изоляции и конкретных условий культивирования клеток, моноцитов макрофаги могут быть созданы для фенотипических и функциональных исследований.

Аннотация

Моноциты, макрофаги представляют собой важный тип клеток врожденной иммунной системы. Мышь моделей изучения биологии макрофагов страдают от фенотипических и функциональных различий между мышиных и человеческих моноцитов макрофагов. Поэтому мы опишем здесь в пробирке модель для создания и изучения первичных человеческих макрофагах. Вкратце, после центрифугирования в градиенте плотности периферической крови, взятой из вены предплечья, моноцитов, выделенных из периферической крови мононуклеарных клеток с использованием отрицательных магнитных гранул изоляции. Эти моноциты затем культивировали в течение шести дней при определенных условиях вызывать различные типы дифференциации макрофагов или поляризации. Эта модель проста в использовании и позволяет обойти проблемы, вызванные видоспецифической различий между мышью и человеком. Кроме того, он ближе к в естественных условиях, чем при использовании иммортализованных клеточных линий. В заключение отметим, что модель, описанная здесь подходит для изучения macrophagэлектронной биологии, выявление механизмов болезни и новые терапевтические мишени. Даже если не полностью заменить эксперименты с животными или тканями человека получили посмертно, модель, описанная здесь позволяет идентификации и проверки механизмов болезни и терапевтических целей, которые могут быть весьма актуальны для различных заболеваний человека.

Введение

Моноциты, макрофаги являются важным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и способствует многих острых или хронических воспалительных процессов 1. Макрофаги играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, как атеросклероз или рака 2. Макрофаги показывают высокую степень пластичности и смогут взять на себя различные фенотипы в зависимости от местных микроокружения 3. Таким образом, изучение дифференциации макрофагов и неоднородность имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и позволить идентификации новых терапевтических мишеней и развитие новых методов лечения.

Во многих случаях, мышиных моделях используются для изучения патофизиологии конкретных болезней. Однако, изучая биологию макрофагов с помощью мыши модели сопровождается рядом недостатков: (1) доля лейкоцитов номера подмножество (т.е. моноциты и гранулоциты) в peripHeral крови мышей или людей существенно отличается предлагая различные роли моноцитов в мышиных и человеческих патофизиологии. (2) Есть существенные различия в экспрессии генов между мышиных и человеческих моноцитов периферической крови свидетельствует о наличии существенного различия в их функции во время здоровье и болезни 4. (3) количество маркеров, которые используются для выявления мышиных моноцитов и макрофагов (F4/80, Lyc и т.д.). Не существует в миелоидных клетках человека, что делает передачу результатов на мышах с человеческой ситуации довольно трудно.

Таким образом, для того, чтобы улучшить наше понимание дифференциации макрофагов и неоднородности в болезнях человека, нам необходимо использовать модели работы с человеческой макрофагов. Таким образом, мы здесь описывать модель человеческого первичный поколение макрофагов, которое легко в использовании и позволяет изучение человеческих моноцитов макрофагов в пробирке в различных условиях, что приводит к различным макрофаг роПоляризация типов. В нескольких исследованиях мы использовали в пробирке модель моноцитарных первичных человеческих макрофагах проанализировать биологии макрофагов и его потенциальное отношение к развитию атеросклероза у человека 5-7.

Даже если не полностью заменить эксперименты с животными или тканями человека получили посмертно, модель, описанная здесь позволяет идентификации и проверки механизмов болезни и терапевтических целей, которые могут быть весьма актуальны для различных заболеваний человека.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Протокол

  1. Подготовка буферов следующим образом:
    1. Подготовить буфер для Выделение РВМС: «промывочного буфера" = 0,02% ЭДТА в PBS (использование 0,5 М ЭДТА).
    2. Подготовка буфера для моноцитов изоляции: "MACS промывки буфером" = 0,5% БСА (250 мг) и 2 мМ ЭДТА (200 мкл) + PBS (50 мл). Дега буфера.
    3. Подготовка буфера FACS-окрашивание и хранения клеток: "FACS буфера" = 10% FCS в PBS и "фиксации буфера" = 1% PFA в PBS.
  2. Ничья 30 мл цельной крови из вены предплечья. Используйте ЭДТА в качестве антикоагулянта.
  3. Изолят РВМС (Histopaque) следующим образом:
    1. Приготовьте два стерильные 50 мл пробирки (без полистирола).
    2. Развести крови из стадии 2, с PBS 1:1.
    3. Добавить 25 мл Histopaque + 25 мл цельной крови / PBS на пробирку. Убедитесь, что Histopaque и кровь не смешиваются.
    4. Центрифугируют при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре, ни тормоза.
    5. Аспирируйте плазмы и выбросьте.
    6. Аспирируйте непрозрачные интерфейс и пипеткой в ​​чистую ванну 50 млé.
    7. Добавить 20 мл 0,02% EDTA в PBS.
    8. Центрифугируют при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
    9. Удалите супернатант.
    10. Добавить 10 мл 0,02% ЭДТА в PBS.
  4. Граф клеток следующим образом:
    1. Хорошо перемешать путем встряхивания в течение 10 сек.
    2. Возьмите 200 мкл суспензии клеток + 300 мкл 0,02% ЭДТА в PBS + 500 мкл трипанового синего (200-500 клеток/10 квадратов, в противном случае изменить коэффициент разбавления).
  5. Выполнение отрицательного изоляции моноцитов следующим образом:
    1. Центрифуга клетки, полученной на стадии 3,10 в течение 10 мин, 120 г х. Удалите супернатант.
    2. Мытье осадок клеток 2x путем добавления 10 мл PBS + 0,02% ЭДТА и центрифугировали в течение 10 мин, 120 г х.
    3. Добавить 9 мл стерильной воды в течение 3 сек, добавить 1 мл PBS 10X.
    4. Вымойте еще раз с PBS + 0,02% ЭДТА и центрифуги 10 мин, 120 х г.
    5. Граф во время центрифугирования.
    6. Развести в EasySep буфера при 5 х 10 7 / мл.
    7. Добавить 50 мкл / мл моноцитов петух обогащенияхвост.
    8. Инкубируют в течение 10 мин при 4 ° С.
    9. Vortex бисера в течение 30 сек.
    10. Добавить 50 мкл / мл бисером.
    11. Инкубировать в течение 5 мин при 4 ° C.
    12. Залейте буфера EasySep завершить объемом 2,5 мл. Решение появится коричневатый.
    13. Положить в магнит.
    14. Подождите 2,5 мин при комнатной температуре. За это время не-моноциты связанного с магнитным шарик будет двигаться к стенке трубы и придерживаться там.
    15. Налейте буфер с необязательными моноцитов в свежем стерильную пробирку. Это решение выглядит беловатые.
    16. Промывают один раз PBS + 0,02% ЭДТА и центрифуги в течение 10 мин, 120 х г.
  6. Пластина клеток в пластиковую чашку или многослойный пластины при плотности 0,5 × 10 6 / см 2. Добавить 1 мл культуральной среды / 1 х 10 6 клеток.
  7. Культуры клеток в условиях, представляющих интерес для 6-14 дней.
  8. Изменение среды через 3 дня заменив 50% СМИ свежей средой (см. таблицу 1 для деталей).
  9. После шести дней урожай клеток для выделения мРНК, проточной цитометрии, вестерн-блоттинга и др.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Используя протокол, описанный выше, мы регулярно получать 25,1 х 10 6 ± 2,2 х 10 6 monocytes/100 мл крови (среднее ± стандартная ошибка из 26 независимых экспериментов, рис. 1А). Моноциты чистоты, как определено с помощью проточной цитометрии окрашивание на CD14 является обычно более 95% (97,1 ± 0,4%, среднее ± стандартная ошибка из 3 независимых экспериментов, фиг.1В). Жизнеспособность клеток свежевыделенным моноциты, как это определено путем окрашивания трипановы...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Моноциты, макрофаги представляют собой ключевой типа клеток врожденной иммунной системы. Они играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, включая атеросклероз или рака 2. Таким образом, изучение биологии макрофагов имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и, чтобы позволить разработку новых методов лечения.

Многие исследования применяются моделей мыши сверхэкспрессирующей или отсутствие определенных генов, представляющих инт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не должны раскрывать конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Надин Wambsganss за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1), а частично за счет гранта из инновационного фонда границы (Гейдельбергский университет), чтобы CAG

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Центрифужная пробирка 50 мл (стерильная)Fisher055398
D-PBS (1X), жидкая (без кальция и магния)Invitrogen14190-250
EDTASigmaT9285
BSASigmaA-8806
FCSInvitrogen
EasySep Набор для обогащения моноцитов человекаStemCell Technologies19059
EasySep MagnetStemCell Technologies18000
пробирок FACSFisher352008
Macrophage-SFM (1X)Invitrogen12065-074
Пенициллин-стрептомицинSigmaP-4458
Nutridoma-SPRoche11011375001
человека M-CSF 10 μ gPeprotech300-25
Планшеты для клеточных культур 6-луночныйFisher07-200-80

Ссылки

  1. Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
  2. Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
  3. Martinez, F. O., Sica, A., Mantovani, A., Locati, M. Macrophage activation and polarization. Front. Biosci. 13, 453-461 (2008).
  4. Ingersoll, M. A., et al. Comparison of gene expression profiles between human and mouse monocyte subsets. Blood. 115, 10-19 (2010).
  5. Gleissner, C. A., Sanders, J. M., Nadler, J., Ley, K. Upregulation of aldose reductase during foam cell formation as possible link among diabetes, hyperlipidemia, and atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1137-1143 (2008).
  6. Gleissner, C. A., et al. CXCL4 downregulates the atheroprotective hemoglobin receptor CD163 in human macrophages. Circ. Res. , (2009).
  7. Gleissner, C. A., Shaked, I., Little, K. M., Ley, K. CXC chemokine ligand 4 induces a unique transcriptome in monocyte-derived macrophages. J. Immunol. 184, 4810-4818 (2010).
  8. Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional profiling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and polarization: New molecules and patterns of gene expression. J. Immunol. 177, 7303-7311 (2006).
  9. Verreck, F. A. W., et al. Human il-23-producing type 1 macrophages promote but il-10-producing type 2 macrophages subvert immunity to (myco)bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 4560-4565 (2004).
  10. Rey-Giraud, F., Hafner, M., Ries, C. H. In vitro generation of monocyte-derived macrophages under serum-free conditions improves their tumor promoting functions. PLoS One. 7, e42656(2012).
  11. Boyle, J. J., et al. Coronary intraplaque hemorrhage evokes a novel atheroprotective macrophage phenotype. American Journal of Pathology. 174, 1097-1108 (2009).
  12. Cho, H. J., et al. Induction of dendritic cell-like phenotype in macrophages during foam cell formation. Physiol Genomics. 29, 149-160 (2007).
  13. Vogt, G., Nathan, C. In vitro differentiation of human macrophages with enhanced antimycobacterial activity. The Journal of Clinical Investigation. 121, 3889-3901 (2011).
  14. Mikita, T., Porter, G., Lawn, R. M., Shiffman, D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus. Journal of Biological Chemistry. 276, 45729-45739 (2001).
  15. Qin, Z. Y. The use of THP-1 cells as a model for mimicking the function and regulation of monocytes and macrophages in the vasculature. Atherosclerosis. 221, 2-11 (2012).
  16. Daigneault, M., Preston, J. A., Marriott, H. M., Whyte, M. K. B., Dockrell, D. H. The identification of markers of macrophage differentiation in pma-stimulated THP-1 cells and monocyte-derived macrophages. PLoS One. 5, e8668(2010).
  17. Wahl, L. M., Wahl, S. M., Smythies, L. E., Smith, P. D. Isolation of human monocyte populations. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  18. Waldo, S. W., et al. Heterogeneity of human macrophages in culture and in atherosclerotic plaques. Am. J. Pathol. 172, 1112-1126 (2008).
  19. Martín-Fuentes, P., et al. Individual variation of scavenger receptor expression in human macrophages with oxidized low-density lipoprotein is associated with a differential inflammatory response. The Journal of Immunology. 179, 3242-3248 (2007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

M1 M2

Похожие статьи