Моноциты, макрофаги важны клетки врожденной иммунной системы. Здесь мы описываем простой в использовании В пробирке Модель для генерации этих клеток. С помощью центрифугирования в градиенте, отрицательные шарик изоляции и конкретных условий культивирования клеток, моноцитов макрофаги могут быть созданы для фенотипических и функциональных исследований.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Моноциты, макрофаги представляют собой важный тип клеток врожденной иммунной системы. Мышь моделей изучения биологии макрофагов страдают от фенотипических и функциональных различий между мышиных и человеческих моноцитов макрофагов. Поэтому мы опишем здесь в пробирке модель для создания и изучения первичных человеческих макрофагах. Вкратце, после центрифугирования в градиенте плотности периферической крови, взятой из вены предплечья, моноцитов, выделенных из периферической крови мононуклеарных клеток с использованием отрицательных магнитных гранул изоляции. Эти моноциты затем культивировали в течение шести дней при определенных условиях вызывать различные типы дифференциации макрофагов или поляризации. Эта модель проста в использовании и позволяет обойти проблемы, вызванные видоспецифической различий между мышью и человеком. Кроме того, он ближе к в естественных условиях, чем при использовании иммортализованных клеточных линий. В заключение отметим, что модель, описанная здесь подходит для изучения macrophagэлектронной биологии, выявление механизмов болезни и новые терапевтические мишени. Даже если не полностью заменить эксперименты с животными или тканями человека получили посмертно, модель, описанная здесь позволяет идентификации и проверки механизмов болезни и терапевтических целей, которые могут быть весьма актуальны для различных заболеваний человека.
Введение
Моноциты, макрофаги являются важным клеточным компонентом врожденной иммунной системы и способствует многих острых или хронических воспалительных процессов 1. Макрофаги играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, как атеросклероз или рака 2. Макрофаги показывают высокую степень пластичности и смогут взять на себя различные фенотипы в зависимости от местных микроокружения 3. Таким образом, изучение дифференциации макрофагов и неоднородность имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и позволить идентификации новых терапевтических мишеней и развитие новых методов лечения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Протокол
- Подготовка буферов следующим образом:
- Подготовить буфер для Выделение РВМС: «промывочного буфера" = 0,02% ЭДТА в PBS (использование 0,5 М ЭДТА).
- Подготовка буфера для моноцитов изоляции: "MACS промывки буфером" = 0,5% БСА (250 мг) и 2 мМ ЭДТА (200 мкл) + PBS (50 мл). Дега буфера.
- Подготовка буфера FACS-окрашивание и хранения клеток: "FACS буфера" = 10% FCS в PBS и "фиксации буфера" = 1% PFA в PBS.
- Ничья 30 мл цельной крови из вены предплечья. Используйте ЭДТА в качестве антикоагулянта.
- Изолят РВМС (Histopaque) следующим образом:
- Приготовьте два стерильные 50 мл пробирки (без по....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя протокол, описанный выше, мы регулярно получать 25,1 х 10 6 ± 2,2 х 10 6 monocytes/100 мл крови (среднее ± стандартная ошибка из 26 независимых экспериментов, рис. 1А). Моноциты чистоты, как определено с помощью проточной цитометрии окрашивание на CD14 является обычно более 95% (97,1 ± 0,4%, среднее ± стандартная ошибка из 3 независимых экспериментов, фиг.1В). Жизнеспособность клеток свежевыделенным моноциты, как это определено путем окрашивания трипановы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Моноциты, макрофаги представляют собой ключевой типа клеток врожденной иммунной системы. Они играют важную роль во многих воспалительных заболеваний, включая атеросклероз или рака 2. Таким образом, изучение биологии макрофагов имеет важное значение для увеличения наших знаний о патофизиологии многих заболеваний и, чтобы позволить разработку новых методов лечения.
Многие исследования применяются моделей мыши сверхэкспрессирующей или отсутствие определенных генов, представляющих инт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не должны раскрывать конфликт интересов.
Благодарности
Мы благодарим Надин Wambsganss за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана грантом Deutsche Forschungsgemeinschaft (GL599/1-1), а частично за счет гранта из инновационного фонда границы (Гейдельбергский университет), чтобы CAG
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Центрифужная пробирка 50 мл (стерильная) | Fisher | 055398 | |
| D-PBS (1X), жидкая (без кальция и магния) | Invitrogen | 14190-250 | |
| EDTA | Sigma | T9285 | |
| BSA | Sigma | A-8806 | |
| FCS | Invitrogen | ||
| EasySep Набор для обогащения моноцитов человека | StemCell Technologies | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| пробирок FACS | Fisher | 352008 | |
| Macrophage-SFM (1X) | Invitrogen | 12065-074 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Sigma | P-4458 | |
| Nutridoma-SP | Roche | 11011375001 | |
| человека M-CSF 10 μ g | Peprotech | 300-25 | |
| Планшеты для клеточных культур 6-луночный | Fisher | 07-200-80 |
Ссылки
- Gordon, S., Taylor, P. R. Monocyte and macrophage heterogeneity. Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).
- Gordon, S., Mantovani, A. Diversity and plasticity of mononuclear phagocytes. European Journal of Immunology. 41, 2470-2472 (2011).
- Martinez, F. O., Sica, A., Mantov....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
