Простой и надежный способ для визуализации и количественной дыхательных путей подвижность ресничек и реснички создан поток с помощью мыши трахеи описано. Этот способ может быть модифицирован, чтобы определить, как широкий спектр факторов, влияющих реснички подвижность, в том числе фармакологические агенты, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Ex Метод естественных условиях для высокого разрешения подвижность ресничек у грызунов эпителия дыхательных путей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Бывших естественных условиях технику для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей для количественного анализа подвижных функция ресничек важно для понимания функции мукоцилиарного клиренс был создан. Свежесобранных мыши трахею разрезают в продольном направлении через trachealis мышц и установлен в мелкой стенами палаты по стеклянным дном блюда. Образец трахеи, расположенных вдоль его продольной оси, чтобы воспользоваться trachealis мышц к скручиванию в продольном направлении. Это дает возможность получить изображение цилиарной движения в виде профиля по всей длине трахеи. Видео со скоростью 200 кадров / сек получены с использованием дифференциального интерференционного контрастной микроскопии и высокоскоростные цифровые камеры, чтобы позволить количественного анализа ресничек частота биений и цилиарного сигнала. С добавлением флуоресцентные шарики во время съемки, реснички генерируется поток жидкости также может быть определена. Протокол отрезки времени около 30 мин, всего 5 мин для приготовления камере, 5-10 мин для образцамонтаж, и 10-15 мин для видеомикроскопии.
Введение
Анализ функции подвижных ресничек эпителия дыхательных путей экспериментально важно для выяснения генетических и экологических факторов, которые могут повлиять мукоцилиарный клиренс и легочной здоровья 1. Простой протокол, разработанный для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей обеспечивает эффективный способ, чтобы допросить подвижность ресничек в дыхательных путях мутанта и нокаут модели мыши и требуются только базовые навыки в мышь рассечение тканей трахеи и бывших естественных изображений ресничками дыхательных путей с высокой подвижностью видеомикроскопии разрешение. Этот протокол был создан и уточняться в ходе крупномасштабной экрана мутагенеза мыши для обеспечения быстрой оценки функции подвижные реснички (частота реснички бить, бить форму реснички, реснички создан поток) у мутантов с врожденными пороками сердца, связанных с heterotaxy 2-5.
Современные методы используются для изучения подвижности ресничек дыхательных путей могут быть сгруппированы либо в естественных условиях острого типа бывших или LONGER термин в пробирке экспериментальных подходов. Острых опытах, последующую визуализации естественных носа человека / дыхательных путей биопсии кистью 6,7 и анализ простых поперечных срезов дыхательных путей 8. В пробирке подходы используют различные методы клеточной культуры для создания листов мерцательного эпителия дифференцированных например в воздухе жидких культур интерфейса или дыхательных путей суспензионных культур 9-11. Однако эти методы эпителия дыхательных путей reciliation требуют очень значительных затрат времени и подготовки, прежде чем какая-либо полезная мерцательного эпителия клетки производятся для экспериментов (4-6 недели 9,10). В то время как анализ естественных условиях острой Ех эпителия дыхательных путей биопсии кисти обычно используются для человека клинические исследования, этот метод не может использоваться в исследованиях на мышах усугубляется из-за механического повреждения тканей 12.
Техники, изложенные в настоящем Протоколе для анализа МОВэлектронной трахеи эпителия дыхательных путей не только простых для исполнения, но это не требует никаких специальных навыков вскрытия, ни специального оборудования, кроме тех, стандартных для работы с изображениями на видеомикроскопии. Есть много преимуществ для этого простой протокол. Во-первых, как ткани мыши трахеи урожай быстро и легко выполнить, оно позволяет для быстрой оценки функции ресничек дыхательных путей в большом количестве мышей. Это может включать острое анализ краткосрочных эффектов различных в пробирке лечения. Второй, будучи бывшим технику естественных условиях, мерцательного эпителия дыхательных путей остается прикрепленным к нему, лежащих в основе опорных тканей и, следовательно, вести соответствующие клеточных сигнальных путей. Поэтому по сравнению с в пробирке reciliated эпителия дыхательных путей, этот препарат является лучшим представлением естественной среды в ткани естественных условиях. В-третьих, этот протокол позволяет приобретение целого ряда различных количественных параметров, которые могут обеспечить объективную оценку подвижные реснички Fпомазание. Наконец, в отличие от других современных методов для визуализации ресничками дыхательных путей, этот протокол позволяет выводить реснички под прямым углом к направлению удара реснички, позволяющий вид профиля реснички, оптимальные для получения изображения с высоким разрешением реснички избили и метахрональная поколения волны .
Этот протокол может быть модифицирован различными способами для решения широкого круга экспериментальных потребностей, таких как роли фармакологических агентов, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки на функции дыхательных путей реснички и генерации / поддержание дыхательных путей бить ресничек и метахрональная распространения волны.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Реагенты установки
1.1 Вскрытие и визуализирующей среды
L-15 Лейбовица среды (L15) дополняется с FBS (10%) и пенициллин-стрептомицин (100 единиц / мл пенициллина G натрия и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата) используется как во время сбора урожая и обработки изображений образцов трахеи.
2. Неглубокой стеной палаты Ассамблеи культуры
В камере используется для хранения трахеи ткани показано на рисунке 1. Пол камеры является стеклянным дном 35 мм культуры блюдо. Верхние и боковые палаты формируется путем размещения небольшой кусочек толщиной 0,3 мм пленка силиконовая над стеклянной посуде. Край лист разрезают по размеру круглый блюдо дно и центром далее зачищается, чтобы сформировать мелкие центральной камеры (см. шаги 2.1-2.3). На вершине этой Ассамблеи, 18 мм круглые стекла покровного стекла помещают для создания закрытой камере подходят для визуализации.
- Полностью покройте 18 мм круглые стекла покровного стекла с квадратным 0,3 мм листа толщиной от силикона.
- Со стандартными острыми ножницами рассечение обрезать избыток силиконовой пленкой с краев покровного стекла (в результате кругового слоем силиконовой пленкой).
- Острым скальпелем вырезать и удалить центральную площадь силиконовой пленкой (примерно 10 квадратных мм) с середины покрытый покровного стекла (образуя верхнюю и боковые камеры Imaging).
3. Трахеи Harvest и подготовка
- Усыпить мышей в соответствии с местными институциональными уходу и использованию животных комитета и / или правительственных руководящих принципов и удалить трахею в стандартный пластиковый 35 мм культуры блюдо с достаточным L15 средств массовой информации, чтобы погрузить ткань (авторы использовали мышей непосредственно перед родами на сроке 16,5 день, вплоть до новорожденных, неонатальный и взрослых животных 2).
- Удалить, не связанного трахеи ткани прикреплены к внешнейтрахеи использованием тупым.
- Снимите с гортанью поперечный разрез чуть ниже перстневидного хряща с использованием микро рассечение ножницами (рис. 2А, линия 1).
- Удалить левой и правой основной бронхиальной ветви с поперечный разрез чуть выше киля с использованием микро ножницы рассечение (Фигура 2А, строка 2).
- Придерживая трахеи с тонким пинцетом и промыть полость 2-3 раза с ~ 1 мл купание среде L15 с Pipetman P1000 и P1000 наконечник, чтобы устранить слизи и крови.
- Вырежьте 3-4 сегмента кольца трахеи использованием поперечный разрез с микро-рассечение ножницами (рис. 2В, линия 1).
- Cut в продольном направлении через середину trachealis мышц этого короткого сегмента трахеи с использованием микро ножницы рассечение (Фиг.2В, строка 2).
- Cut в продольном направлении через середину кольца трахеи хряща с использованием микро ножницы рассечение (фиг.2С , линия), оставив двух секций трахею ткани подходят для визуализации (один раздел показано на рисунке 2D).
4. Реснички изображений
- Передача трахеи ткани сегментов, просвет стороной вниз на середину 35 мм со стеклянным дном чашки для культивирования с 100-200 мкл L-15 среды.
- Для количественной оценки реснички генерируется поток добавляют небольшое количество флуоресцентных 0,20 мкм микросферы с L-15 среда купание образца трахеи ткани (~ 1 × 10 11 частиц / мл или 20 мкл / мл Fluoresbrite 2,5% водной суспензии микросфер).
- Поместите изображения камеры подготовлены заранее (см. процедуру 1-3 выше) в верхней части трахеи силиконовые образец лист стороной вниз, образца трахеи расположен в середине мелкий стенами камеры, образованной окно разрезать на силиконовой пленки (рис. 1 ).
- Аккуратно нажмите на покровное установить на месте и удалите излишки L-15 средств массовой информации из Усин краяGA P1000 P1000 наконечник и Pipetman.
- Установите 35 мм блюдо со стеклянным дном культуры и трахеи образца на инвертированный микроскоп 100X с объективными и DIC оптики.
- С помощью высокоскоростной камеры и программное обеспечение фильм приобретение собирать фильмы ресничек подвижность при 200 кадров в секунду вдоль ресничного трахеи из изогнутого вверх краем мышцы trachealis (рис. 2D прямоугольнике, E: Пример неподвижное изображение из записанных видео) (Дополнительные Фильм 1).
- Использование FITC epifluorescent изображений и низкой освещенности ПЗС (см. список оборудования выше), собирают фильмы флуоресцентных микросфер движение по поверхности мерцательного трахеи, чтобы позже количественного ресничек генерируется поток (дополнительные фильма 2).
5. Количественный подвижность ресничек
- Загрузите DIC отображаемого фильмов в пакет программного обеспечения ImageJ и следуя методике, описанной ЯАйн Драммонд 13 использовать линию инструмент для рисования растровых линии, пересекающей избиении ресничками. "Изменить конфигурацию" этой линии генерирует изображение кимографа типа, где реснички движение по всей линии генерирует волновой картины. Количество пикселей между каждой волны пика их измерены (один пиксель = один фильм кадр), из которых количество ударов в минуту (т.е. Гц) может быть вычислена.
- Для измерения реснички генерируется поток нагрузки флуоресцентного шарик фильмов в пакет программного обеспечения ImageJ и использовать плагин MTrackJ 14 вручную отслеживать флуоресцентные шарики по всей поверхности эпителии трахеи и позволить программному обеспечению генерировать шарик скорости и направленности для каждого шарика отслеживаются.
Следует проявлять осторожность при использовании люминесцентные бусины для количественного потока по мере удаления от избиения ресничек может сильно повлиять измеренной величины потока. Шарик в движении Справочная Фильм 2 является хорошим примером этого. В этом примере шарикДвижение быстро на поверхности ресничек избиения и существенно падает для бисера дальше купания в средствах массовой информации. Чтобы контролировать это, шарик обводка должна быть собраны только на фиксированном расстоянии выше мерцательного эпителия во всех образцах, чтобы позволить правильное проводить сравнения. И, наконец, чтобы получить репрезентативные данные о жидкости, шарики должны быть найдены для как можно дольше, мы предпочитаем использовать шарик треков, которые охватывают 10 + ресничных клеток для расчета потока жидкости.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Управление ресничками дыхательных путей должно быть хорошо виден и видел биться на скоординированной основе (Справочная Movie 1; воспроизведения видео замедлился до 15% в реальном времени), с заметными поток в направлении удара ресничек (Справочная Фильм 2; воспроизведение фильма на 100% реальном времени). Количественный ресничек фильмы должны дать результаты, аналогичные тому, которое наблюдалось на рисунке 3. Коллекция высокоскоростных DIC кино делает возможным количе...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Измерение частота биений ресничек (CBF) относительно легко Использование мощных микроскопа цели и быстро аппаратного захвата изображений 13,15, и объясняет, почему CBF измерений основой Большинство исследований с целью мукоцилиарный клиренс во здоровья и болезни. Тем не менее, в то время как CBF измерений необходимо для понимания мукоцилиарный клиренс, измерение CBF только игнорирует основные важность как цилиарной создан поток и ресничек бить сигнал, оба из которых являются более трудно измерить, часто игнор...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Проект был поддержан грантом NIH U01HL098180 от Национального сердца, легких и крови институт. Материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального сердца, легких и крови институт или Национального института здоровья
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Лейбовиц s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | Без фенола красного |
| Фетальная бычья сыворотка | Hyclone | SH30088.03 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x тонкие щипцы | Roboz | RS-4976 | |
| Ножницы для вскрытия | Roboz | RS-5676 | |
| Ножницы для микродиссекции | Roboz | RS-5620 | |
| Скальпель | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 пипетка | Gilson, Inc | F123602 | |
| наконечники P1000 Molecular | BioProducts | 2079E | |
| 18 мм круглая стеклянная крышка | скользки Fisher Scientific | 430588 | |
| Пластиковые чашки для культур 35 мм | Corning | 430588 | |
| Стеклянное дно 35 мм чашки для культур | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Силиконовый лист 0,012" (0,3 мм) толщина | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0,20 μ m диаметр Fluoresbrite YG Карбоксилатные микросферы | Polysciences | 09834-10 | |
| Инвертированный микроскоп, со 100-кратным масляным объективом и фильтрами DIC | Lecia | DMIRE2 | Brand не критичен. |
| 100-ваттная ртутная лампа, эпифлуоресцентные фильтры возбуждения/излучения FITC | Lecia | Brand не критичны. | |
| Микроскоп столик Инкубатор | Lecia | 11521749 | Не требуется при визуализации ресничек при комнатной температуре |
| Высокоскоростная камера яркого поля | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand не критична. Скорость |
| люминесцентной камеры | Hamamatsu | C9100-12 | марки не должна превышать 125 кадров в секунду. Должна быть быстрее 10 кадров в секунду |
| Программное обеспечение для анализа видео | Национального института здравоохранения | ImageJ с плагином |
Ссылки
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
