Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

PRP как новый подход для предотвращения инфицирования: подготовка и

21.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50351

⸱

9 апреля 2013 г.

 , 
1Department of Orthopaedics, School of Medicine, West Virginia University , 2Department of Orthopaedics, Stem Cell Research Center, University of Pittsburgh, 3WVNano Initiative, 4Mary Babb Randolph Cancer Center

В этой статье

Краткое содержание

Implant-инфекции, связанной значительное клиническое осложнение. Это исследование описывает подход с использованием богатой тромбоцитами плазмы (PRP), чтобы предотвратить имплантат-ассоциированных инфекций, представляет протокол для подготовки PRP с постоянной концентрацией тромбоцитов, и сообщает о вновь выявленных антимикробные свойства PRP и связанные с ними протоколы для рассмотрения таких антимикробными свойствами В пробирке.

Аннотация

Implant-инфекции, связанной становится все более и более сложных услуг в области здравоохранения по всему миру в связи с ростом устойчивости к антибиотикам, передачи устойчивых к антибиотикам бактерий между животными и людьми, и высокая стоимость лечения инфекций.

В этом исследовании, мы раскрываем новые стратегии, которые могут быть эффективными в предотвращении имплантат-ассоциированной инфекции основана на потенциальных антимикробные свойства обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP). Благодаря хорошо изученных свойств для стимулирования заживления, PRP (биологический продукт) все чаще используется для клинического применения, включая ортопедические операции, пародонта и устные хирургии, челюстно-лицевой хирургии, пластической хирургии, спортивной медицине и т. д.

PRP может быть передовых альтернативой обычным антибиотикам лечение в предотвращении имплантат-ассоциированных инфекций. Использование PRP может быть выгодным по сравнению с обычными лечения антибиотиками систь PRP менее вероятно, чтобы вызвать резистентность к антибиотикам и ПРП в антимикробным и исцеление способствующих свойства могут иметь синергетический эффект в профилактике инфекций. Известно, что патогенные микроорганизмы и клетки человека для гоночных поверхности имплантата и свойства PRP по содействию исцеление могло бы улучшить человеческие привязанности ячейки тем самым уменьшая шансы для инфекции. Кроме того, PRP изначально биосовместимых и безопасной и свободной от риска инфекционных заболеваний.

Для нашего исследования мы выбрали несколько клинических штаммов бактерий, которые обычно встречаются при инфекциях, ортопедических и изучали, может ли PRP имеет в пробирке антимикробными свойствами против этих бактерий. Мы подготовили PRP помощью центрифугирования дважды подход, который позволяет той же концентрации тромбоцитов, которые могут быть получены для всех образцов. Мы добились последовательного антимикробной выводы и обнаружил, что PRP имеет сильные в пробирке антимикробными свойствами против бактерий, таких как MethiCillin-чувствительные и метициллин-устойчивый золотистый стафилококк, стрептококк группы А, и Neisseria гонореи. Таким образом, использование PRP может иметь потенциал, чтобы предотвратить инфекцию и снизить потребность в дорогостоящих послеоперационного лечения имплантат-ассоциированных инфекций.

Введение

Implant-инфекции, связанной значительное клиническое осложнение. Золотистый стафилококк (S. стафилококк) является одним из наиболее распространенных микроорганизмов, выделенных из имплантат-ассоциированных инфекций. Он способен производить биопленки, которая покрывает поверхность имплантата и может привести к антибиотикам инфекций 1,2. Лечение имплантат-ассоциированной инфекции часто требуется длительная госпитализация для повторного debridements и длительной парентеральной антибактериальной терапии. В устойчивых к антибиотикам случаев удаления имплантата может быть необходимым. Повышение устойчивости бактерий к антибиотикам также называют Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC) как «один из наиболее актуальных проблем в мире здоровья". В свое время, без разработки новых и эффективных антимикробных лечения, не исключено, что с множественной лекарственной устойчивостью патогенных будет неизлечимыми с обычными антибиотиками. Предупреждение имплантата связанногоинфекции Поэтому важно и новых профилактических средств и подходов, необходимых для предотвращения таких инфекций.

Обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) является концентрация аутологичной крови, которая содержит более 30 факторов роста, которые могут помочь с костью и костным трансплантатом исцеления 3-5. Применение PRP по улучшению регенерации костных и мягких тканей созревания все чаще сообщается в клиниках из-за его высокой концентрации различных факторов роста выпущен тромбоцитов.

Некоторые характеристики PRP показывают, что PRP может также имеют антимикробные свойства 6-9. PRP содержит большое количество тромбоцитов, высокая концентрация лейкоцитов (которые могут обладать принимающей обороны действия против бактерий и грибков), а также несколько антимикробных пептидов 7,8,10. В недавнем исследовании большой группы кардиохирургических больных, было выявлено, что использование интраоперационной PRP-геля во время закрытия раны значиicantly снизилась заболеваемость поверхностной и глубокой грудиной инфекции 11. По этим причинам и наблюдения, мы предположили, что PRP, помимо своих хорошо изученный целебный способствующие свойства, обладает антимикробными свойствами. Потенциальные преимущества использования PRP, чтобы предотвратить инфекцию могут включать: (i) PRP менее вероятно, чтобы вызвать сопротивление по сравнению с обычными лечения антибиотиками. (II) PRP также обладает свойствами, которые способствуют заживлению, которая может иметь синергетический эффект по профилактике инфекций; PRP исцеления способствующих свойства могли бы обеспечить уплотнение, чтобы предотвратить прикрепление бактерий тем самым уменьшая шансы для инфекции, болезнетворных микроорганизмов и клеток человека участвуют в гонке для имплантата поверхностей 12 , 13. (III) PRP изначально биосовместимых и безопасной и свободной от риска инфекционных заболеваний.

Наша долгосрочная цель заключается в использовании PRP как новый подход к предотвращению имплантата связанных infectiДополнения. Цель данного исследования заключалась в подготовке PRP помощью центрифугирования дважды подход, изучить PRP в пробирке свойства антимикробных и для описания протоколов для оценки таких антимикробными свойствами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка и активация PRP

1,1 взятия крови

  1. Anesthetize кролика при вдыхании изофлурана (2% в O 2 для индукции и 1% за обслуживание).
  2. Ничья 2 мл 0,129 M Tri-цитрат натрия (anticoagulent раствора) в 20 мл шприц. Тринатрийцитрата раствор готовят путем растворения 1,897 г три-цитрат натрия в 50 мл дистиллированной H 2 O и фильтрации с 0,22 мкм стерильный фильтр.
  3. Стерилизовать уха кролика с использованием 70% этанола.
  4. Ничья крови (например, 5 мл) из вены уха кролика через иглу бабочка (25 г), подключенный к шприцу.
  5. Смешайте кровь с тринатрийцитрата решение, нежная агитации. Соотношение объемов крови и тринатрийцитрата решение 9:1.

1,2 PRP подготовки (рис. 1)

  1. Передача антикоагулянтом крови в 50 мл трубки центрифуги пластик. Возьмите аликвоты по 10 мклкрови для определения количества тромбоцитов использованием базовых hemocytometry.
  2. Центрифуга крови при 300 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) на центрифуге с поворотно-откидной ротор. Установить ускорение и тормоз низкой скорости (рис. 1).
  3. После центрифугирования кровь разделяется на три слоя. Нижний слой в основном красные кровяные клетки, средний слой (как правило, называют "лейкомассы") состоит из концентрированных тромбоцитов и лейкоцитов, а верхний слой в основном плазмы, которая является жидкой составляющей крови и тромбоцитов ( рис. 1). Осторожно транспортировки центрифуги трубки капот культуре клеток; не беспокоить слоев. Передача всех плазмы, лейкомассы и толщиной 2-3 мм красный слой клеток крови в 15 мл пластиковые трубки, используя 1 мл пластиковые пипетки.
  4. Центрифуга переданы образцы во второй раз в 3000 х г в течение 15 мин при комнатной температуре. Верхний слой (супернатант) считается бедной тромбоцитами плазме (PPP)D переносится в новую пробирку.
  5. Получение PRP, регулируя концентрацию тромбоцитов в оставшихся образцов крови с использованием PPP получить 2,0 х 10 6 тромбоцитов / мкл (определяется hemocytometry).

1,3 PRP активации

  1. Подготовка PRP активации раствор путем растворения 5000 МЕ бычьего тромбина с 5 мл 10% хлорида кальция, чтобы рабочие концентрации 1000 МЕ / мл.
  2. Добавить активация решение PRP и PPP, и смешивать раствор пипеткой несколько раз, чтобы сформировать PRP-и PPP-гели. Соотношение объемов активация решение PRP или PPP 1:4.

2. Экстракорпоральное антимикробной Тест PRP Использование убийство Кривой анализа (рис. 2)

  1. С помощью стерильного посева петлю, добавить несколько колоний S. золотистого от ночной культуры пластины в 5 мл Мюллера Хинтона (MHB) в пластиковой трубке. Vortex кратко и затем инкубировать образец в течение 2 часов при температуре 37 ° C. Следующий, Оптическая плотность бактериальных средств массовой информации определяли с помощью спектрофотометра и доводят до оптическая плотность равна ~ 1 х 10 8 КОЕ / мл на основе заранее определенной стандартной кривой.
  2. Сделать 100x разбавления с использованием PBS для получения 1 х 10 6 КОЕ / мл и поместите амеб на льду.
  3. Настройка и маркировать стерильный, одноразовый 5 мл с круглым дном трубы полистирола, а также подготовить следующие группы образцов, как указано в таблице 1 для конечного объема 2 мл в каждую пробирку.
  4. Добавить PRP, PPP, или PBS первый полистирола трубы, а затем тромбина решение для активации (геля). Затем добавьте MHB, а затем S. золотистого амеб (1 х 10 6 КОЕ / мл) для получения конечной концентрации 1 х 10 5 КОЕ / мл.
  5. Инкубировать пробирки при 37 ° C с орбитальной агитации при 150 оборотах в минуту.
  6. На заранее определенных временных точках (0, например, 1 и 2 часа), смешать решений в каждой трубе через повтор пипетирования (этошаг важен, так как бактерии могут попасть внутрь геля PRP). Возьмите 10 мкл образца, развести серийно стерильным 0,9% физиологическим раствором, и пипеткой 100 мкл каждого разведения на Триптический соевый агар (TSA, с 5% овечьей крови) пластины для подсчета КОЕ.
  7. Культура агара в течение ночи при 37 ° C, то рассчитывать и записывать пластинки колонии. Участок данные о масштабах logarithimic со временем (час) на оси х и КОЕ / мл на оси ординат.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

ПРП воспроизводимо подготовлен с использованием подхода в два раза центрифугированием (рис. 1). PRP находится представить сильные (до 100-кратное снижение КОЕ) в пробирке антимикробными свойствами против метициллин устойчивый С. стафилококк (MRSA) (рис. 3), которая обычно находится в больницах по всему миру 14. Точно так же, PRP имеет сильные антибактериальные свойства против метициллин чувствительными С. стафилококка (MSSA), стрептококка г...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Обогащенной тромбоцитами плазмы все чаще используется для клинического применения благодаря своим целебным свойствам способствующих 15-17. В настоящем исследовании, PRP был представлен в качестве нового подхода к профилактике инфекции. PRP было обнаружено сильное антимикробными свойствами в отношении MRSA, MSSA, стрептококка группы А, и Neisseria гонореи. Основные преимущества PRP, по сравнению с обычными лечения антибиотиками, для профилактики инфекции, включают: (1) данной терапии антибиот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Therwa Хамза, John E. Tidwell, Нина Кловис, и Сюзанна Смит для экспериментальных помощи и Сюзанна Смит для корректуры. Авторы также благодарят Джон Томас, доктор философии для обеспечения бактериальной клинических изолятов и Джон Б. Барнет, PhD за поддержку и использование биологических лабораторий безопасности на кафедре микробиологии, иммунологии и клеточной биологии в Университете Западной Вирджинии. Авторы признают, финансовой поддержки со стороны остеосинтеза и травматологической помощи Фонда и Национального научного фонда (# 1003907). Микроскоп экспериментов и анализа изображений были также проведены в Университете Западной Вирджинии изображений фонд, который при частичной поддержке Марии Babb Randolph онкологический центр и NIH грант P20 RR016440.

Животное использование крови привлекает были одобрены Университета Западной Вирджинии Институциональные уходу и использованию животных комитета. Все эксперименты были выполнены в соответствии со всеми guidelinES, правил и регулирующих органов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Тромбин крупного рогатогоKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-05Тромбин (бычьего происхождения)
Хлорид кальцияKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-0510% хлорид кальция
ЭтанолSigma-AldrichE7023
ИзофлуранBaxter1001936060
Мюллер Хинтон бульонBecton, Dickinson and Company275710
Фосфатно-солевой буферSigma-AldrichD8662
Тринатрия цитратSigma-AldrichW302600
Триптический соевый агарFisher ScientificR01202
ЦентрифугаKendro Laboratory Products750043077
Шприцевой фильтрMilliporeSLGP033RS
скота

Ссылки

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity? Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Богатая тромбоцитами плазмаприготовление БТПбактериальный инокулятактивация тромбиномколониеобразующие единицыснижение КОЕдвукратное центрифугированиеметициллин-резистентный Staphylococcus aureusзаживляющие свойства ран
PRP как новый подход для предотвращения инфицирования: подготовка и
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.