Методическая статья

Coculture Анализ внеклеточных белковых взаимодействий влияющие секрецию инсулина клетками поджелудочной железы бета

DOI:

10.3791/50365

⸱

15 июня 2013 г.

 ,  , 
1Pediatric Diabetes Research Center, University of California, San Diego, 2Janssen Research & Development, 3Department of Medicine, University of California, San Diego

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Трансцеллюлярному взаимодействий белка являются важными факторами, определяющими панкреатических бета-клеток. Общий Вот метод, адаптированный из сокультивирования модель синаптогенезе-исследования, как конкретные трансмембранных белков влияют секрецию инсулина. Трансфицированных клеток НЕК293 выразить интерес белков, бета-клетки не нужны для трансфекции или иным образом непосредственно возмущенных.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Взаимодействие белков клеточной поверхности помогать координировать функции соседних ячеек. Панкреатические бета-клетки группируются вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы. Становится все более ясно, что взаимодействие между трансмембранных белков на поверхности соседней бета-клетки являются важными детерминантами бета-клеток.

Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения мРНК и белка выражения, которые могут повлиять бета-клеток здоровью и / или функции способами, которые могут посрамить анализов влияния специфических взаимодействий. Эти подходы также изменить уровни внутриклеточные домены целевых белков и может предотвратить эффекты вследствие взаимодействия между белками в пределах одной клеточной мембраны быть дисплееотмеченной от воздействия трансцеллюлярного взаимодействий.

Здесь способ для определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток представлена. Этот способ применим к бета-клеточных линий, например, INS-1 клетками, а также диссоциированных первичной бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток идентифицированных белков важна для вождения формирование синапсов. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клетки функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий. Мы разработали систему, в которой бета-клетки культивируют на слое НЕК293 клетках, экспрессирующих белок, представляющий интерес. В этой модели, бета-клеток цитоплазма затрагивается при внеклеточный белок-белковых ВЗАИМОДЕЙСТВИЕнс манипулируют. Хотя здесь мы сосредоточены в основном на исследованиях глюкозо-стимулированной секреции инсулина, другие процессы могут быть проанализированы, например, изменения в экспрессии генов, как определено с помощью иммуноблоттинга или количественной ПЦР.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь описан способ для облегчения исследования как внеклеточные домены конкретных трансмембранные белки влияют на секрецию инсулина. Метод зондов эффекты взаимодействия белка, представляющего интерес с белками (или, возможно, другие молекулы) в панкреатических бета-клеток поверхности. Метод позволяет исследований того, как на поверхности клеток белков, экспрессируемых бета-клетками или другими соседними клетками (например, эндотелиальные клетки, нейроны, клетки панкреатической альфа) влияет на бета-клеток через трансцеллюлярного взаимодействия (т.е. через взаимодействие с партнерами взаимодействие на поверхности соседних бета-клеток).

Клеточной мембраны плазма содержит сложный комплекс структурных и функциональных белков, выступающая в качестве мостов с внеклеточной средой. По формированию трансцеллюлярному соединения или инициированием пластиковых сигнальных событий, взаимодействия между белков клеточной поверхности может помочь координироватьФункция соседних ячеек. Панкреатических бета-клетках сгруппированы вместе в панкреатических островках и действовать согласованно для поддержания гомеостаза глюкозы 1. Как показал, например, по важности внеклеточного EphA-ephrinA и нейролигина-2 взаимодействий в регуляции глюкозо-стимулированной секреции инсулина, становится все более ясно, что повышение уровня знаний внеклеточной взаимодействия, происходящие между белками на поверхности соседних бета-клетки будут иметь большое значение для получения полного представления о секреции инсулина бета-клетки функционального созревания и поддержания гомеостаза глюкозы 1-3. Цель метода, описанного здесь, чтобы исследования влияния на функцию бета-клетки трансцеллюлярного взаимодействий с конкретными трансмембранной или иным-клеточной поверхности, белки, ассоциированные. При совместном культивировании с бета-клеток НЕК293 клетках, трансфицированных различные экспрессирующие конструкции, воздействие на бэта-клеточной функции различных белков клеточной поверхности или мутированные варианты могут быть эффективно исследовали. Это достигается без трансфекции бета самих клеток.

Выяснение роли, особенно трансцеллюлярному взаимодействий нокдаун, нокаут или избыточной экспрессии исследования в культуре клеток бета-или в естественных условиях требует прямого возмущения бета-клеток мРНК и белка выражение, могут повлиять на здоровье бета клеток и / или функции способами, которые могут посрамить анализы влияние конкретных внеклеточный взаимодействий. Эти подходы также изменить уровней внутриклеточных доменов целевых белков и, кроме того, не позволяют эффектов из-за взаимодействия между белками или в той же камере следует отличать от последствий трансцеллюлярного взаимодействий. Здесь описан способ определения влияния конкретных трансцеллюлярного взаимодействий на способность секретирующих инсулин и оперативность бета-клеток является описание экспозицийIBED. Этот способ применим к секретирующих инсулин бета-клеток линий, таких как INS-1 клетки 4 и диссоциированной первичный грызуна или человека бета-клеток. Он основан на совместное культивирование модели, разработанные нейробиологов, которые обнаружили, что воздействие культивируемых нейронов конкретных нейронов белки экспрессируются на HEK293 (или COS) слоев клеток могли идентифицировать белки, которые привод формирование синапсов 5,6. Учитывая параллели между секреторной техники нейронных синапсов и бета-клеток, мы рассуждали, что бета-клеток и функциональное созревание может быть обусловлен подобный трансцеллюлярному взаимодействий 7-9. Для того чтобы исследовать эти взаимодействия, мы разработали систему, описанную здесь, в котором бета-клетки совместно культивировали на слой клеток НЕК293, экспрессирующие белок 10. Эта система позволяет бета-клеток цитоплазма остается нетронутой в то время как внеклеточный белок-белковых взаимодействий манипулируют.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Трансфекцию HEK293 слоя

  1. Подготовка HEK293 клеточной среде путем добавления к 500 мл бутылки DMEM (с 4,5 г / мл глюкозы и фенол красный и без глутамина): 50 мл ФБС, 5 мл 100X раствор пенициллина / стрептомицина, 5 мл 100x L-глутамина раствора и 500 мкл амфотерицин B.
  2. Пластина из клеток НЕК293 в 24-луночный планшет с использованием 0,5 мл HEK293 среды на лунку. Убедитесь, что клетки равномерно распределены по всей нижней части пластины.
  3. Когда НЕК293 клетки достигают 100% слияния, трансфекции 0,8 мкг плазмиды кодирования интерес белка (вставлены в экспрессирующий вектор млекопитающих) и 2 мкл липофектамина 2000 в соответствии с Липофектамином протокола. Мы решили использовать PcDNA 3,3 позвоночник сконструированы для экспрессии в клетках млекопитающих.
  4. Необязательно, после 6 часов инкубации обмена трансфекции среды, описанные в протоколе Lipofectamine с нормальным HEK293 СМИ.
  5. Для оценки экспрессии трансфицированных PROTEв, подмножество трансфицированных скважины культуры тканей могут быть использованы для иммунофлуоресцентного обнаружения экспрессированного белка или для Вестерн-блоттинга экспрессии белков с использованием стандартных методик.

2. Дополнительная фиксация НЕК293 выражая Трансфицированных Белки

Трансфицированных клеток НЕК293 может быть слегка фиксировали в целях облегчения совместного культивирования в среде, которые могут быть вредны для живой клетки НЕК293 (например, шаг 3,9 ниже), либо, чтобы позволить эффективной подготовки заранее пластин для нескольких экспериментах все сразу (см. обсуждение).

  1. Проведение экспериментальных исследований для определения времени ход экспрессии белка в клетках HEK293.
  2. После трансфекции HEK293 слой клеток, аспирация СМИ из клеток в после трансфекции момент времени, связанный с высоким уровнем экспрессии. Если это происходит в течение первых 24 часов, не надо аспирации до 24 часов после трансфекции.
  3. Вымойте HEK293 клетки осторожно D-PBS, затем добавляют 500 мкл 4% параформальдегида (PFA) и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. (Чтобы сделать 4% PFA решение, начните с 16% раствор в 1X PBS и разбавленной 1:4 1X PBS.)
  4. С помощью стерильной PBS, осторожно промыть клетки три раза и инкубировали в PBS O / N при 4 ° С.
  5. Вымойте клетки 3 раза стерильной PBS, а затем добавить PBS и оставить на 4 не ° C до необходимости (максимальный срок хранения может меняться в зависимости от белка выражено. Мы храним НЕК293 трансфицированными выразить нейролигина изоформ на срок до 2 недель без значительных изменений в наблюдаемых эффектов на секрецию инсулина).

3. Со-культивирования INS-1 бета-клеток с Клетки НЕК293

  1. Подготовка INS-1 медиа добавлением к 500 мл среды RPMI 1640 (с глюкозой и фенол красный и без глутамина): 50 мл ФБС, 5 мл 100X пенициллина / стрептомицина, 5 мл 100X L-глутамина раствор 5 мл натриевой соли пировиноградной кислоты, 500 мкл амфотерицин В, 500 мкл бета-меркаптоэтанола (это почти идентична медицинскиемкм, обычно используемых для первичной культуры островок, за исключением того бета-меркаптоэтанол).
  2. Использование Cell-стриппер (или другой неферментативного ячейки для удаления), урожай INS-1 клеток примерно на 70-80% слияния со дна T75 культуры колбу. Каждая колба обеспечит достаточное количество клеток примерно на 48 скважинах.
  3. После центрифугирования вниз клетки в центрифуге в течение 3 минут при 1200 оборотов в минуту, ресуспендируют в 50/50 смесь INS-1 и НЕК информации. Для 70-80% сливной колбу ИНС-1 клетки, ресуспендируют примерно в 25 мл смешанная техника.
  4. При использовании НЕК293, которые были исправлены в параформальдегиде чем жить НЕК293, ресуспендируйте INS-1 клеток в 100% INS-1 СМИ, а не смешанная техника.
  5. С помощью 10 мл пипетки, сместить клеток от гранул, чтобы сделать однородной клеточной суспензии.
  6. Аспирируйте носитель извлечь на НЕК293.
  7. Использование p1000 пипетки осторожно добавляют 500 мкл INS-1 клеточной суспензии на слой клетки НЕК вдоль сторон ое скважине. Через каждые 6 скважин, используют 10 мл пипетки для ресуспендирования INS-1 клетки снова для обеспечения однородной клеточной суспензии. Общая схема совместного культивирования установки показана на рисунке 1.
  8. Инкубируйте клетки в течение 24-48 часов в зависимости от экспериментальной протокола.
  9. Если больше чем 48 часов совместного культивирования период, необходимо использовать дополнительные шаги выше в разделе 2, чтобы исправить НЕК293.
  10. При использовании первичных диссоциированных грызуна или человека островков [см., например, до протоколов в JoVE 11-15], обеспечить соответствующий носитель, такой как RPMI с 5 мл пенициллина / стрептомицина, 5 мл L-Glut, 0,5 мл амфотерицина-В используется вместо INS-1 СМИ. Хотя можно использовать диссоциированных клеток островка в 24-луночный планшет, на практике из-за большого количества островков потенциально необходимости, рекомендуется рассмотреть возможность масштабирования до 48 лунками (меньше необходимого островковых клеток на лунку). На 48 лунками, добавить около 100 островков ценность диссоциацииТед клеток на чашку, чтобы начать. В зависимости от эффективности диссоциации и используемого метода, меньше островков могут быть необходимы.

4. Глюкоза Вынужденное секреции инсулина

  1. Preincubate клеток в 250 мкл 2,5 мМ глюкозы в КРФ (Кребса-Рингера бикарбонатный буфер) в течение не менее 1 часа. Чтобы preincubate, удалите сокультивирования средних и немедленно замените KRB. Этот обмен должно быть сделано одной скважины в то время, чтобы свести к минимуму воздействие INS-1 клетки окружающей кислорода. Аспирируйте одной рукой, а пипеткой низким (2,5 мм) глюкозы KRB с другим.
  2. Биржа предварительной инкубации КРФ в 250 мкл либо 2,5 мМ или 20 мМ глюкозы в КРФ буфер одной скважины за один раз.
  3. При необходимости для конкретного эксперимента, дополнительные секрецию, таких как 100 мкМ IBMX могут быть добавлены для получения более надежной стимулированный ответ секреции инсулина. Диссоциированных первичной островка бета-клеток, в частности, плохо реагируют к увеличению концентрации глюкозы Алоне, так что здесь особенно добавление IBMX или другие секреции следует рассматривать 16,17.
  4. После 1 часа инкубации, чтобы передавать мультимедийные микроцентрифужную труб и спина 1500 мкг в течение 5 мин.
  5. Удалить 200 мкл супернатанта и использовать его для анализа инсулина RIA или ELISA.
  6. Чтобы подготовить клеточного лизата, добавляют 100 мкл клеточного лизиса RIPA буфере (150 мМ NaCl, 1,0% IGEPALCA-630 или Nonidet P-40, 0,5% дезоксихолат натри, 0,1% SDS, 50 мМ Трис, рН 8,0) с ингибиторами протеазы в пластины сразу же после извлечения СМИ и инкубировать при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
  7. Спин вниз лизат в течение 15 мин при 10000 х г и удалить 50 мкл надосадочной жидкости для анализа с помощью инсулина RIA или ELISA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С помощью способа, описанного здесь, мы тестировали эффект различных вариантов белка нейролигина на секрецию инсулина. Это дополняет нашей опубликованной работе исследования влияния нейролигина-2 на бета-клеток 10. Рисунке 2, например, изображает результаты, полученные из сокультивирования INS-1 бета-клеток с НЕК293 клетках, трансфицированных выразить нейролигина изоформы называемый здесь NL- X. Этот эксперимент был разработан, чтобы проверить гипотезу, что NL-X занимается трансцеллюлярному в...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Совместное культивирование Описанный здесь метод обеспечивает эффективный способ, чтобы определить физиологическое значение конкретных бета-клеточной поверхности, трансмембранные белки, в частности их внеклеточных доменов. При культивировании бета-клетки или клетки инсулиномы (например, INS-1 клетки используют здесь) в контакте с НЕК293 отображения интересующего белка на поверхности клетки, эксперименты могут быть предназначены для определения эффектов внеклеточный белок-белковых взаимодействий, непосредственно не наруш...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа выполнена при поддержке Национального института здоровья грант R01DK080971 и детского диабета исследовательский грант Фонда 37-2009-44. Мы также высоко ценим поддержку, полученную от UCSD детского диабета исследовательский центр (PDRC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
pcDNA 3.3 вектор/костякИнвитрогенK830001
Липофектамин 2000Инвитроген18324012
DMEMMediatech45001-312
Pen/стрептококковый растворMediatech45001-652-1
Амфотерицин BMediatech45001-808-1/30
RPMI-1640Mediatech45001-404
D-PBSMediatech45001-434
Пируват натрияMediatech45001-710-1
2-Mercapt– танолInvitrogen21985023
Клеточный стрипперMediatech45000-668
T75 FlaskBD1368065
16% ПараформальдегидЭлектронная микроскопия Науки50980487
10xPBS Mediatech45001-130
Фетальная бычья сывороткаMediatechMT35010CV
IBMXSigmaI5879-100MG
Буфер для лизиса RIPASigmaR0278

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  2. Konstantinova, I., et al. EphA-Ephrin-A-mediated beta cell communication regulates insulin secretion from pancreatic islets. Cell. 129, 359-370 (2007).
  3. Jain, R., Lammert, E. Cell-cell interactions in the endocrine pancreas. Diabetes Obes. Metab. 11, Suppl 4. 159-167 (2009).
  4. Poitout, V., Olson, L. K., Robertson, R. P. Insulin-secreting cell lines: classification, characteristics and potential applications. Diabetes Metab. 22, 7-14 (1996).
  5. Craig, A. M., Graf, E. R., Linhoff, M. W. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends in Neurosciences. 29, 8-20 (2006).
  6. Scheiffele, P., Fan, J., Choih, J., Fetter, R., Serafini, T. Neuroligin expressed in nonneuronal cells triggers presynaptic development in contacting axons. Cell. 101, 657-669 (2000).
  7. Abderrahmani, A., et al. Neuronal traits are required for glucose-induced insulin secretion. FEBS Lett. 565, 133-138 (2004).
  8. Lowe, A. W., Madeddu, L., Kelly, R. B. Endocrine secretory granules and neuronal synaptic vesicles have three integral membrane proteins in common. The Journal of Cell Biology. 106, 51-59 (1988).
  9. Suckow, A. T., et al. Expression of neurexin, neuroligin, and their cytoplasmic binding partners in the pancreatic beta-cells and the involvement of neuroligin in insulin secretion. Endocrinology. 149, 6006-6017 (2008).
  10. Suckow, A. T., et al. Transcellular neuroligin-2 interactions enhance insulin secretion and are integral to pancreatic beta cell function. The Journal of Biological Chemistry. 287, 19816-19826 (2012).
  11. Kohnert, K. D., Hehmke, B. Preparation of suspensions of pancreatic islet cells: a comparison of methods. J. Biochem. Biophys. Methods. 12, 81-88 (1986).
  12. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part I: digestion and collection of pancreatic tissue. J. Vis. Exp. (27), e1125(2009).
  13. Qi, M., et al. Human pancreatic islet isolation: Part II: purification and culture of human islets. J. Vis. Exp. (27), e1343(2009).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J. Vis. Exp. (7), e255(2007).
  15. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).
  16. Hauge-Evans, A. C., Squires, P. E., Persaud, S. J., Jones, P. M. Pancreatic beta-cell-to-beta-cell interactions are required for integrated responses to nutrient stimuli: enhanced Ca2+ and insulin secretory responses of MIN6 pseudoislets. Diabetes. 48, 1402-1408 (1999).
  17. Spiess, Y., Smith, M. A., Vale, W. Superfusion of dissociated pancreatic islet cells attached to Cytodex beads. Diabetes. 31, 189-193 (1982).
  18. Pham, P. L., et al. Transient gene expression in HEK293 cells: peptone addition posttransfection improves recombinant protein synthesis. Biotechnol. Bioeng. 90, 332-344 (2005).
  19. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 51, 187-200 (2005).
  20. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10, 9(2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

HEK293

Похожие статьи