Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из

17.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50371

⸱

7 июня 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich

В этой статье

Краткое содержание

Мы сообщаем эффективный и простой способ, чтобы изолировать эмбрионов на ранних стадиях развития от Arabidopsis THALIANA Семена. До 40 эмбрионы могут быть выделены в 1 часа до 4 часов, в зависимости от вниз по течению приложения. Процедура подходит для транскриптом, метилирование ДНК, экспрессия гена-репортера, иммунной и флуоресценции На месте Гибридизации анализов.

Аннотация

У цветковых растений, зародыш развивается в питательной ткани - эндосперма - окруженный материнской покровов семян (или семенной оболочки). Как следствие, изоляция растение эмбрионов на ранней стадии (1 клетки шаровидный этап) является технически сложной задачей из-за их относительной недоступности. Эффективное рассечение ручной на ранних стадиях сильно ухудшается малого размера молодые семена Arabidopsis и адгезивность эмбриона на окружающие ткани. Здесь мы описываем способ, который позволяет эффективно изоляции молодых эмбрионов Arabidopsis, дающие до 40 эмбрионов в 1 часа до 4 часов, в зависимости от вниз по течению приложения. Эмбрионы высвобождаются в изоляции буфер, слегка 250-750 дробление семян с пластиковой пестиком в пробирку Эппендорфа. Стакан микрокапилляра установки либо в стандартных лабораторных пипетки (через резиновую трубку) или гидравлическим управлением микроинъектор используется для сбора эмбрионов из капель местеD на мульти-и слайд на инвертированный микроскоп свет. Технических навыков, необходимых просты и легко переносятся, а основная установка не требует дорогостоящего оборудования. Сборник эмбрионы подходят для различных последовательных применений, таких как ОТ-ПЦР, РНК последовательности, анализ метилирования ДНК, флуоресценции в гибридизация (FISH), иммунные и анализы гена-репортера.

Введение

Зародыш цветковых растений окружен эндоспермом, питательные ткани, полученные из второго события оплодотворения. Оба зародыша и эндосперма окружены несколько слоев клеток семенной кожуры. Взятые вместе, эти ткани образуют семена, которые развиваются внутри плода. Таким образом, ткани и клетки конкретных анализов Arabidopsis эмбрионы сильно обесцененные из-за их недоступности. Тем не менее, эмбрионов на поздних шаровидные или более поздних стадиях, относительно хорошо поддаются ручной вскрытия с помощью тонкой иглы вольфрама под стереомикроскоп или слегка надавив на семенах с помощью щипцов, чтобы извлечь их. Такие методы были успешно использованы для транскриптома или эпигенома анализы профилирования, такие как гибридизация микрочипов, бисульфит секвенирование, или РНК последовательности (например, 1-3). Напротив, исследования эмбрионов на ранних зиготы до шаровых этапе остаются технически сложными. На сегодняшний день только несколько исследований Reported транскриптома анализы на молодых эмбрионов с использованием либо лазерным захватом микродиссекции (LCM) эмбриональных тканей со стационарных разделов семян 4 или ручного извлечения отдельных эмбрионы изнутри семена с использованием тонких инструментов 5. Тем не менее, LCM оборудования, что является невозможным и ручное извлечение эмбрионов на ранних стадиях является трудоемким и требует отличные навыки вскрытия, которые не легко передаваться. В дополнение к генома анализы, на месте анализ экспрессии генов, также трудно выполнить на молодых, целом монтажа эмбрионов Arabidopsis. В некоторой степени, молодые эмбрионы могут быть выпущены на предметные стекла микроскопа путем осторожного давления на семена и используется для анализа репортерного гена или белка обнаружения иммунного (см., например, 6,7). Этот метод, однако, не дает высокую пропускную способность эмбриона изоляции, препятствуя тем самым количественного анализа.

Поэтому мы разработали эффективный и быстрый протоколдля раннего эмбриона изоляции от семян Arabidopsis, который прост в настройке, легко переносятся, и подходит для различных последующих применений. Основной принцип состоит, чтобы аккуратно раздавить семена - вырезали у молодых стручки в пробирку Эппендорф с помощью пластикового пестика в соответствующем буфере изоляции. Экстракт семян помещают в капли на мульти-и слайдов и подвергают скринингу на присутствие выпущен эмбрионов в нужной стадии с использованием инвертированного микроскопа. Эмбрионы собирали с использованием стекла микрокапилляра прикреплен к микроинъектор или стандартный пипетки лаборатории. Для молекулярных приложений, эмбрионы дважды промывали повторяется релиз в капли новый буфер изоляции до их передачи на буфер назначения в минимальном объеме. Для цитологических приложения (репортер анализы, иммунное, FISH), стадий промывки может быть опущен.

Метод имеет ряд преимуществ: (I) он дает 25-40 эмбрионов в ~ 45 мин для цитологического приложенияликаций или через 3-4 часа для молекулярной приложений (в том числе этапов промывки), (II) она позволяет выделение специфических эмбриональных стадиях, (III) это легко передаваться другим лицам и лабораторий благодаря простоте установки, (IV) она требуется доступное по цене оборудование для базовые настройки, которые поддается модернизации, и (V) он был успешно использован для различных последовательных применений, таких как РНК последовательности 8, ген-специфических ДНК-анализа метилирования 9, репортер анализы (10 и Raissig соавт., в стадии подготовки.) и рыба (J. Jaenisch, У. Grossniklaus, С. Baroux неопубликованные, см. рисунок 5).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедура приведены в последовательности операций, показанной на рисунке 1. Микрокапиллярам и инструментальная настройки показаны на рисунках 2 и 3, и типичные шаги эмбриона изоляции показаны на рисунке 4.

1. Материал и подготовки буфера

1.1 Покрытие силиконом стекла микрокапиллярам

  1. Поместите микрокапиллярам в 15 мл трубки сокола с ~ 5 мл Sigmacote (Sigma) и перевернуть несколько раз.
  2. Снимите решение, поместите трубки сокола содержащие капилляры в алюминиевую фольгу и запечь их в течение 3 часов при 60 ° C. Хранить при комнатной температуре.

1.2 получаем ~ 50-100 мкм диаметром микрокапиллярных советы

  1. Извлеките 1 мм в диаметре стеклянных капилляров либо вручную на газовой горелки или при использовании коммерческих съемник (вертикальные нити или съемник микропипетки съемник).
  2. Использование алмазовКончик пера или лезвие, чтобы отрезать кончик вытащил капиллярной для создания нужного открытия. Выберите лучшие формы капилляров под Стерео микроскоп. Открытие должно быть 50-100 мкм (рис. 2).

1,3 по подготовке слайдов

  1. Силиконизированная чистой слайды, охватывающих все скважины с Sigmacote (~ 1 мл / слайд) в течение 5 мин, удалить. Выпекать 3 часа в алюминиевую фольгу. Хранить при комнатной температуре.
  2. Вымойте мульти-и микроскопические стеклянные слайды в течение 10 мин в 10% SDS, 2 х 2 мин в нуклеазы без воды (автоклаве DEPC-Ddh 2 O), 2 мин в 70% этаноле, 2 мин в 100% этаноле, воздушно- высохнуть. Все шаги сделаны в автоклаве банки Коплин. Слайды могут быть повторно использован многократно предоставление тщательной очистки между каждым использованием.
  3. Непосредственно перед эмбрион распространения изоляции ~ 0,5 мкл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) с помощью пипетки на всю поверхность каждой лунки и воздушно-сухой.

1,4 микроскоп и капиллярной установке

  1. Используйте инвертированный микроскоп с 10-кратным и 20-кратным увеличением цели. Оптимизация светового контраста (эмбрионы достаточно прозрачны).
  2. Наведите микроманипулятор держать стеклянный капилляр рядом с микроскопом. Стеклянного капилляра соединен с микроинъектор (фиг. 3А) или в обычный P-200 пипетки через резиновую трубку (фиг. 3В, см. Обсуждение подробное описание этой установки).
  3. Поместить капиллярную выше микроскопа при ~ 70 ° угла (фиг. 3) и отрегулировать положение иметь отверстие в поле зрения.
  4. Незадолго до эмбриона изоляции занимают и отпустите ~ 5-10 мкл BSA (1 мг / мл), чтобы покрыть капилляра.

1,5 буферов

В таблице 1 перечислены выделения и назначения буферов в зависимости от последующих применений.

  1. Подготовьте ~ 1 мл буфера на изоляцию попробовать только что перед использованием и держать его на льду.
  2. Подготовить буфер назначения в 0,5 мл Eppendorf низкого связывания пробирку на льду (молекулярная приложений) или на предметное стекло микроскопа (цитологические приложений) во влажной камере.

2. Вскрытие семян и эмбрионов Добыча

2.1 Синхронизация развития семеноводства

  1. Выхолостить цветы и держать их 2 дня в ростовой камере, избегая контакта подвергается пестики с другими цветами, то опыляют их (например, 11).
  2. Проверьте стадии развития на определенных условиях роста микроскопическое исследование очищен семена. С нашими условиями роста (16 ч света при 21 ° С, 8 ч темноты при 18 ° С и влажности 70%) семян, собранных 2,5 дней после опыления (DAP) получают главным образом 2-4 клетки эмбрионов и семян, собранных 3,5 - 4 DAP дали шаровых эмбрионов.

2.2 Вскрытие Семени и разрыв

  1. Снимите сГКПЗ от 10-15 стручки (~ 2,5 DAP) под стереомикроскопом пинцетом и инсулина игл.
  2. Погружают семена в 20 мкл буфера для изоляции в 2 мл с круглым дном пробирку Эппендорфа помещают на лед.
  3. Осторожно раздавить семена с пластиковой пестиком (предварительно очищенный с 10% SDS, промывают DEPC-DDH 2 O и промывали 70% этанолом), чтобы освободить эмбрионов, пока экстракт семян не дождь. Применять силу должна быть определена любым пользователем на судебное разбирательство.
  4. Промыть пестиком с 300 мкл буфера изоляции мыть пестиком и разбавленный образец.
  5. Замедление вращения экстракта при 5000 мкг в течение 5 сек. Аккуратно ресуспендируйте гранулированные экстракта с помощью пипетки вверх-вниз 2-3 раза.
  6. Фильтр экстракта с 30 мкм нейлоновая сетка (устанавливается на трубу адаптеров, например, от PartecCelltricks). Промойте сетку с дополнительным буфером 200 мкл изоляции.

3. Эмбрион Изоляция

3,1 по подготовке слайдов

    <литий> Поместите чистую BSA покрытием и силиконизированный мульти-и слайд на предметный столик инверсионного микроскопа, ресуспендируют отфильтрованный экстракт семян с помощью пипетки осторожно вверх и вниз и пипеткой 2 капли 40-50 мкл экстракта семян в 1 или 2 скважины . Скрининг только 1 или 2 капли в то время, предотвращает испарение образца.
  1. Место 50 мкл свежего буфера изоляции (1-й стирки капли) в лунке другой слайд полученного, как и раньше. Держите этот слайд в покрытом влажной камере для предотвращения испарения.

3.2 экран, очистить, собирать

  1. Экран капли экстракта семян для эмбрионов на нужную сцену с 10-кратного увеличения объектива. При необходимости уточнения стадии с 20-кратным увеличением. Эмбрионы обычно опускаются на дно слайдов.
  2. Вручную удалите мусор вокруг эмбриона с вольфрамовой иглы, инсулин иглы или подобного оборудования.
  3. Переместить стеклянного капилляра вблизи зародыша использованием микроманипулятор, тAKE до эмбриона с минимальным решением, как это возможно.
  4. Собрать несколько эмбрионов (например, все одной капли) и отпустить их в 1-й мыть падение (молекулярная приложения) или в буфер назначения (цитологические приложений). Каждый круглый сбора должна быть в пределах 5-10 мин и эмбрионы должны быть собраны в минимальном объеме (общий объем всех сбор раунда должно быть <5 мкл).
  5. Повторите скрининга и коллекции, пока желаемое количество эмбрионов не будет собран в 1 капле мыть й (в центре, если это возможно, для облегчения воспоминаний).
  6. Вспомнить все эмбрионы сразу от мытья каплю (если мусор переносятся, удалите их с помощью иглы, прежде чем воспоминание).
  7. Отпустите эмбрионов в 2-й мыть капли 50 мкл. Повторите 3.2.6.
  8. Отпустите эмбрионов в буфер назначения. Передача должна включать только контакт, а не погружения капилляра чаевые.
  9. Замените microcapilЛари для следующего образца.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наши процедуры выделения эмбрионов (рис. 1) позволяет выделить до 40 эмбрионов в 4 часа, если моет выполняются, например, для молекулярной приложений или менее чем за час, если моет опущены, например, для цитологического приложений. Рисунок 2 показывает высокие и низкие Качество микрокапиллярных советы и рисунке 3 показана настройке автомата изоляции эмбриона. Рисунок 4 показывает процесс эмбриона изоляции на инвертированный микроскоп....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы разработали протокол эмбриона изоляции, которая является быстрым, эффективным, и может быть легко переведены в другие лаборатории.

Оборудование, описанное здесь состоит из инвертированного микроскопа, микроманипулятор, стекло микрокапиллярам, ​​вертикальная нить съемник и микроинъектор (рис. 3А). Установка аналогична той, которая описана для одного изоляторе животных для анализа транскриптомика 17. Мы также успешно работает с более базовые настройки, где стекла...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Таль Nawy и Мартин Bayer за их советы на эмбрион изоляции. MTR В.Г., UG и ЦБ разработали оборудование эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ разработал протокол эмбриона изоляции. MTR В.Г., ЦБ установил протокол, изолированных зародышей и эмбрионов сгенерированный кДНК, В. Г. исполнил ПЦР, MTR окрашивания GUS, JJ FISH экспериментов. MTR В.Г., CG и UG написал рукописи. Эта работа финансировалась в университете Цюриха, в Братстве Roche Research Foundation (для MTR) и гранты от Швейцарского национального фонда (в UG и ЦБ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
SigmacoteSIGMASL2-100 мл
РНКаза OUTInvitrogen (life technologies)10777-019
First-strand bufferInvitrogen (life technologies)18064-022содержащийся в пакете Superscript II
DTTInvitrogen (life technologies)18064-022содержится в упаковке Superscript II
Бычья сыворотка альбумин (BSA) 100x =10 мг/мл New England Biolabs Inc.У разных поставщиков также будут работать
тонкостенные капилляры 1,0 ммWorld Precision InstrumentsTW100F-4
DNA LoBind tube 0,5 млVaudaux-Eppendorf0030108.035
CellTricsΔ 30 μ mPARTEC04-0042-2316
5лунок диаметром 10 мм предметные стеклаЭлектронная микроскопия Sciences63421-10
Раствор формальдегидаSigma-AldrichF1635
Superfrost Plus слайдThermo FisherJ1800AMNZMenzel-Glä ser
TrisAmaresco0497
EDTAApplichemA2937
ГлицинFluka50050
SDS гранулыRothCN30.3
Micro PestleVWR431-0094
Микротонкие инсулиновые шприцыBDU-100
DEPCSigma-AldrichD5758
ЭтанолSchaurlauET00102500
щипцы N5Dumont0108-5
Биоанализатор Pico ChipAgilent Technologies5067-1513
EQUIPMENT
Инвертированный микроскопNikon TMS (Япония),
МикроманипуляторLeitzLeica
Micomanipulator Post mount LH1 зондLeica microsystems39430101разных брендов также выполнит работу
Вертикальный съемникнити Sutter instrument модельP-20Другие модели также подходят
Cell Tram varioVaudaux-Eppendorf5176.000.033
БиоанализаторAgilent Technologies2100
Кубит ФлуориметрИнвитроген (технологии
, жизни

Ссылки

  1. Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
  2. Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
  3. Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
  4. NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
  5. Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
  6. Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
  7. Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
  8. Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
  9. Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
  10. Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
  11. Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327(2011).
  12. SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
  13. Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
  14. Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
  15. Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
  16. Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
  17. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634(2011).
  18. Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
  19. Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
  20. Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Arabidopsis
Эффективной и быстрой изоляции на ранней стадии эмбрионы из
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.