Выделение Родные почвенных микроорганизмов с потенциалом для Breaking Down биоразлагаемых пластиковых Фильмы Мульча используется в сельском хозяйстве

Краткое содержание

Полимерные пленки с надписью "биоразлагаемый" коммерчески доступны для сельскохозяйственного использования в качестве мульчи. Почвы представляет собой привлекательный методом удаления, но деградация в полевых условиях еще плохо изучены. Целью данного исследования была разработка методов выделения родной почвенные грибы и бактерии, которые колонизировали пластиковые пленки мульчу после полевых захоронения.

Аннотация

Грибы рода сельскохозяйственных почв, что колонизировали коммерчески доступных биоразлагаемых мульчи (BDM) фильмов были выделены и оцениваются на предмет потенциального деградировать пластмасс. Как правило, когда составы пластмасс известны и источника сырья доступно, порошкообразный пластик может быть приостановлено в агар на основе информации и деградации путем визуального очистки зон. Однако такой подход плохо имитирует на месте деградации BDMs. Во-первых, BDMs не диспергирован в виде мелких частиц всей почвенной матрице. Во-вторых, BDMs не поставляется на рынок как чистых полимеров, а скорее как пленок, содержащих добавок (например, наполнители, пластификаторы и красители), которые могут влиять на рост микроорганизмов. Процедуры, описанные здесь были использованы штаммы получены из почвы похоронен фильмов мульчи. Грибковые штаммы получены из раскопанных BDMs были протестированы индивидуально для роста на куски новых, дезинфицируют BDMs уложенной поверх определенной среде, не содержащей электронной источника углеродаxcept агара. Изоляты, которые росли на BDMs далее испытывали в жидкой среде, где BDMs были единственным добавил источник углерода. После примерно десяти недель, грибковые колонизации и БДМ деградацию оценены с помощью сканирующей электронной микроскопии. Изоляты были идентифицированы с помощью анализа последовательности гена рибосомной РНК. Это сообщение описывает методы грибковых изоляции, а также бактерии были изолированы с помощью этих методов заменой среды подходит для бактерий. Наша методика должна оказаться полезной для исследования, изучающие разбивка нетронутыми пластиковые пленки или продукты, для которых пластиковые сырье или неизвестны или недоступны. Однако наш подход не обеспечивает количественный метод сравнения цены деградации БДМ.

Введение

Деградация исторически считается нежелательным атрибутом пластичных полимеров, так как разбивка продукт сокращает срок службы и долговечность. Недавно осведомленности об экологических проблемах представленных пластиковых отходов в природной среде ^1,2,3 сделал биоразлагаемых пластиков привлекательной альтернативой обычным пластмасс. Деградация (определяется как структурные изменения, фрагментация и снижению молекулярной массы, целостность и прочность ^4,5) происходит через ряд событий, в том числе и абиотических процессов (тепловой стресс, фото-окисление, гидролиз, эрозии и механических напряжений), и биологической деградации ^6. В то время как абиотических процессов может изменить размер фрагмента и характеристик пластмасс, микроорганизмы, необходимые для их конечной минерализации воды и углекислого газа (в аэробных условиях) и / или метана (в анаэробных условиях).

Значительная нишу длябиоразлагаемых пластмасс существует в сельском хозяйстве, где пластиковой мульчи используются для предотвращения роста сорняков, чтобы сохранить влажность почвы и увеличению температуры почвы ^7,8. Сотни тысяч гектаров в одних только Соединенных Штатах прикрыты пластиковыми мульчи ^9, в том числе мульчи состоит из биоразлагаемых пластиковых. После вегетационный период сельскохозяйственных культур, варианты утилизации биоразлагаемых мульчи (BDMs) включают вывозиться на свалку, сжигание с рекуперацией энергии ^10, деградация через компостирование, или деградации в почве после обработки почвы ^11. Из них наименее трудоемкие судьба вспашки BDMs в почву, но без эффективной деградации и минерализации во несельскохозяйственных месяцев (как правило, в зимнее время), пластиковые фрагменты могут оставаться и мешать сельскохозяйственного оборудования во время обработки почвы весной и посадки, а также сохраняются в окружающей среде, где они существенно повлиять Дикая жизнь, растительная жизнь, и микрофлора ^1,2,3,10.

Хотя многие пластмассовых изделий, в том числе сельскохозяйственных пленок мульча, иметь метку "биоразлагаемый" или "компостируемый", на практике деградации и минерализации может быть неэффективным и / или слишком неполной в почве разложения быть жизнеспособной альтернативой для утилизации этих продуктов. Например, оксо-биоразлагаемых полиэтилены достигнуто только 12,4% минерализации после одного года выветривания и трех последующих месяцев в 58 ° C компост, и менее половины этой суммы минерализации произошло, когда температура компоста составляла 25 ° C ^12. В зимнее время температура почвы в большинстве мест была бы ниже, чем любой из этих температур, предположительно в результате чего еще более низкую активность микробных а следовательно, меньше минерализации. Кроме того, чтобы замедлить темпы деградации, неправильного использования термина «биологически» привела к недоверию этих продуктов потребителями ^13,14, в том числе в сельском хозяйстве. Биодеградации является превращениеполимеров в диоксид углерода (и / или метан) и воды ¹⁴ на природные микроорганизмы ^4. Таким образом, биодеградации должна быть измерена химически; физической ассоциации микроорганизмов с подложкой не подразумевает микробной деградации этого материала.

В рамках усилий, чтобы изучить устойчивого использования BDMs в сельском хозяйстве, это исследование было сфокусировано на выявлении микроорганизмов рода сельскохозяйственных почв, которые колонизировали и ухудшить имеющиеся в продаже BDMs. Стандартные методы испытаний были опубликованы для химически измерения распад биоразлагаемых пластиков абиотических и биологических средств ^15,16,17. Однако эти способы не решают деградации пластмассы отдельных видов микроорганизмов, или создание способов их изоляции. Методология здесь больше напоминает стандартные методы, предназначенный для оценки пластмасс на устойчивость к разложению под воздействием бактерий после посева образцов с грибковыми спорами18,19.

Когда составы пластмасс известны и источника сырья доступно, порошкообразный пластик может быть приостановлено в агар на основе информации и деградации путем визуального зон очистки ^13. Этот метод был использован ранее для выявления микроорганизмов, которые разрушают полимеры, такие как полиуретан ^20, поли (бутилен сукцинат-со-адипат) ²¹ и поли (молочная кислота) ^22. Аналогичный способ включает суспендирующий чистый порошкообразный пластик в жидкой среде, где пластик единственного источника углерода ^20,23. Хотя эти методы имеют то преимущество, определенной системе, они плохо имитировать на месте деградации BDMs. Во-первых, площадь поверхности распределяется по-разному из-за BDMs не диспергированного в небольших частиц по почвенной матрице, а, скорее, продается и используется в качестве пленок. Во-вторых, химический состав BDMs отличается от чистых полимеров. BDMs обычно содержат добавки, такие какнаполнители, пластификаторы и красители, и эти добавки могут влиять на рост микроорганизмов и, таким образом, скорость минерализации. По этой причине, а также потому, что состав определенных коммерческих фильмов в этом исследовании были собственные, полиэтиленовая пленка в своей области-готовом виде был использован для изоляции грибков и бактерий. Для простоты ниже методы описаны только грибов, с модификациями отметить, где это уместно для бактериальной изоляции.

В недавнем исследовании ^24, три коммерчески доступных BDMs и одного экспериментального фильма были использованы на сельскохозяйственных объектах в трех различных регионах Соединенных Штатов в течение одного вегетационного периода, а затем помещают в сетку (250 микрон) сумки и похоронен в течение одной зимы в почве на тех же участках. Отверстия 250 микрон позволяет гифы гриба проникнуть исключая корни и наиболее фауны почв, а также минимизация почвы посягательства ^25,26. Нейлон материалы предотвращения деградации сумку в почве. После раскопок, Fungal изолятов были извлечены из БДМ части и оценивали роста на минимальной среде без источника углерода, за исключением агара и 5 см х 5 см поверхность дезинфицируют квадрат новый, не используется пленка БДМ, который был предварительно дезинфицируют. Большинство пластмасс используются в качестве фильмов не могут обрабатываться в автоклаве без потери целостности, так что УФ-свет был использован, чтобы убить клетки микроорганизмов, проживающих на пластмассы. ISO ¹⁹ 846 рекомендует поверхностно-обеззараживанию в 70% этаноле и последующей сушки, но если с помощью этого метода, необходимо обеспечить, чтобы ни один из компонентов или добавку фильма не оказывает отрицательное влияние этанола. С BDMs предположительно производятся выдерживать солнечного света, УФ был выбран в качестве метода очистки.

Изоляты, которые росли на BDM части лучше, чем на минимальной среде одни были отобраны для дальнейшего изучения. Агар, полисахаридов, полученных морских водорослей, используется, чтобы укрепить микробной среды, потому что, как правило, не используются метаболически по сельскохозяйственно и медицински нев состоянии микроорганизмов, однако, агар-гидролиза ферментами были выделены из морской бактерии ²⁷ и агар-гидролиз бактерии также были выделены из почвы ^28. БДМ полимеров и агар как ожидается, будет редким субстратов для ферментов, выделяемых почве грибков, которые не развивались в средах, содержащих эти полимеры в качестве потенциальных источников питательных веществ, но обе подложки присутствуют в пластине биологического анализа, описанные здесь (Этап 7). Грибы, которые используют BDMs но не агара в качестве источника углерода могут быть дифференцированы от грибков, которые используют агар только путем сравнения роста на отвержденную агаром среду, содержащую я) без добавления источника углерода, за исключением агара (отрицательный контроль), II) БДМ пленки (экспериментальный) и III), глюкоза (положительный контроль). Рост всех изолятов, как ожидается, на минимальной среде и глюкозы; грибов не возникающие при содержащей глюкозу пластины могут быть способны к росту на минимальной среде конкретного используемого в эксперименте. Potentiдр. BDM деструкторов должны расти на агаре затвердевшего минимальной среды + BDM фильм лучше, чем они растут на агар-затвердевших минимальной среде в одиночку. Грибы, растущие на минимальной средой являются агар-деструкторов или олиготрофов, а также ожидается, вырастет на агар, связанные с BDM фильмов в биопроб пластин, но не на сами фильмы (если они по счастливой случайности также ухудшают BDM полимеры).

Чтобы исключить возможность увидеть рост микроорганизмов за счет использования агара, а не компании BDMs, мы следовали наши первоначальные анализ для BDM колонизации агара с биопроб в определенных бульоном (шаг 9). БДМ части представлена ​​единственным известным источником углерода в биологической труб.

После первоначального скрининга, и на возрождение глицерине из изолятов, некоторые сформированный скудный, но видимый мицелия в жидком определенной среде, не содержащей известного источника углерода. Эти результаты показали, что некоторые из приобретенной изолятов были oligotrophs - организмы, которые растут на очистку очень небольших количеств углерода, азота и других питательных веществ, растворенных либо в водной среде или существующие как летучих веществ в воздухе ^29,30,31. Определение видов через 18S рибосомальной ДНК-анализа поддержал эту точку зрения, так как многие из изолятов соответствует родами грибов сообщалось ранее проявлять гипотрофия ^32. Олиготрофов, которые обычно сапрофиты, требуют широкого спектра метаболических возможности для утилизации субстрата в различных средах ^30. Таким образом, не удивительно, что теми же грибами мы изолированы от BDMs (предположительно требующих необычных возможностей ферментативного) продемонстрировал олиготрофная мощностей, и смогли расти на микропримесей, таких как кожа масла от отпечатков пальцев, пыли и следов летучих веществ в воздухе. В связи с выделением олиготрофов, мы пришли к выводу, что рост на БДМ поверхность сама по себе не может быть использован, чтобы вывести БДМ пробой. Описанные здесь способы отражают наши усилия по SCReen родной колонизаторов BDM от сельскохозяйственных почв для добросовестных пробоя BDM.

Протокол

Эта процедура требует, по крайней мере, нескольких месяцев для инкубации BDM фильмов в почве, и еще несколько месяцев для последовательного биопробы как на агар пластины и в агар-бесплатно, определенного химического бульона для оценки колонизации и деградации. Индивидуальные методы перечислены в порядке их будет выполнена.

1. Инкубация BDM Фильмы в почве

Включение BDM фильмов в почву в условиях имитирующих те, при которых они должны будут деградировать. Приобретает 400 г (сухой вес эквивалент) резидента почвы и сэндвич 10 см х 10 см БДМ с почвой в 13 х 13 см нейлоновой сеткой (250 микрон) сумке. Закрыть с нейлоновой нити. Время инкубации по усмотрению экспериментатора. Монитор и / или изменять параметры, имеющие отношение к микробной деятельности (например, температуры почвы, питательных веществ и влаги) равномерно в течение инкубационного периода по мере необходимости.

2. Подготовка СМИи реагенты

Чтобы не вводить источники питательных веществ случайно в средствах массовой информации и культуры трубы, использовать реагент класса химических веществ, вновь приобретенные трубы культуры, тип I сверхчистого (например NanoPure) воды и строго промытые посуды для смешивания сред. Избегайте перекрестного загрязнения реагентов - лучше всего использовать специальный набор реагентов и посуды для этой цели. Следует отметить, что, возможно, что грибы, могут быть выделены, чей рост ингибируется ингредиента в реагенты, перечисленные ниже. Если это произойдет, некоторые оптимизации могут быть необходимы.

1. До принятия СМИ, мыть всю необходимую посуду с моющим средством, а затем лабораторией кислоты стирки (например, замочить на ночь в 10% HCl). Промыть минимум двенадцать раз в дистиллированной воде и дважды в сверхчистой воде. Обложка всю стеклянную посуду с чистой алюминиевой фольги, чтобы исключить пыль. Надевайте перчатки и не прикасайтесь к краям и внутри судов, чтобы исключить кожу маслами от отпечатков пальцев. Чтобы избежать мылом житесборов и царапин на стекле, которые облегчают колонизации, культуры грибов во вновь приобрели (не используется), промыть и автоклавного стекла труб культуры и шапки.
2. Картофельный агар с декстрозой (PDA) используется для начального выделения грибов из почвы, а также для создания одного изолированных колоний и генерации инокулята для длительного хранения. Подготовьте носитель в соответствии с инструкциями производителя и после автоклавирования (при охлаждении до 50 ° С), добавить хлорамфеникол (от 10 мг / мл исходного раствора в этаноле) до конечной концентрации 30 мкг / мл, чтобы исключить бактерии. Эта среда в настоящее время называют PDA КХЛ ^30.
3. Грибковые минимальной среде (FMM) используется в качестве твердой основы для BDMs инокулировали потенциал грибковых пластиковый деструкторов. Кроме агара (при использовании для отверждения среды), это безуглеродных. Для примерно 800 мл деионизированной H ₂ O, добавляют 6,0 г NaNO _3, 0,52 г KCl, 0,52 г MgSO ₄ · 7H2 O, 1,52 г KH ₂ PO ₄ и 1 след мл Hutner в ​​элементы исходного раствора (2,2 г ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1,1 г Н ₃ ВО _3, 0,5 г MnCl ₂ · 4H ₂ O, 0,5 г FeSO ₄ · 7H ₂ O, 0,16 г CoCl ₂ · 5H ₂ O, 0,16 г CuSO ₄ · 5H ₂ O, 0,11 г (NH ₄₎ 6Mo ₇ O ₂₄ · 4H ₂ O и 5,0 г Na ₄ ЭДТА в 100 мл дистиллированной H ₂ O ^{33 34.} Доводят рН до 6,5, используя NaOH и довести объем до 1 л для жидкости биологического анализа, фильтр-стерилизовать FMM, чтобы избежать осаждения солей. Если твердый носитель желании, добавить 16 г агара и автоклаве. Когда полутвердый агар необходимости, уменьшить агар до 8 г / л При охлаждении до 50 ° С, добавляют хлорамфеникол до конечной концентрации 30 мкг / мл. Эта среда теперь называют FMM хлорофилла ^30. В качестве контроля для обеспечения того, грибковые штаммы растут эта среда, FMM должны быть маде, как указано выше, но содержащий 10 г глюкозы на литр. Это называется глюкоза минимальной среде ³⁵ (GMM).
4. Фосфатом солевом буфере ³⁶ (PBS) используется для приостановки частиц почвы и микробных клеток в начальной серийное разведение почвы подвергается BDMs. Чтобы PBS, добавить 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na ₂ НРО ₄ и 0,24 г KH ₂ PO ₄ до 800 мл дистиллированной воды. Растворить солей и доведения рН до 7,4 с помощью HCl. Довести общий объем до 1 л сверхчистой воды. Заполните чистые пробирки культуры с 9,5 мл и 4,5 мл PBS на пробирку. Автоклав.
5. 30% (об / об) глицерина используется для приостановки криоконсервированных бактериальных и дрожжевых клеток, спор и мицелия грибов во время хранения при -80 ° С. Сделать это решение измерении воды. Автоклав.
6. 0,01% (об / об) Тритона X-100 используется для приостановки грибковых спор, моющее средство действует как нетоксичные смачивающий агент для гидрофобных спор. Растворите 100 мкл Тритон Х-100 В 1 л сверхчистой воды. Автоклав.
7. 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,2), используется в качестве растворителя для глутаральдегида при фиксации SEM. Смешайте 68,4 мл 1 М Na ₂ НРО ₄ и 31,6 мл 1 М _{Na 2} PO ₄ и довести общий объем до 1 л сверхчистой водой ^36.

3. Подготовка Bioassay Материалы: Поверхность Дезактивация Фильмы BDM

1. Потому что остатки загрязнителей, такие как бумага и лента на режущий посуды являются потенциальными источниками углерода, использование новой приобретенной ножницами или свежих бритвенных лезвий, и неорганическую поверхность для резки. Надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения BDM фильмов с кожей масел. Вырезать BDM фильмов на небольшие квадраты (4,25 х 4,25 см). Этот размер квадратных вписывается в стандартные 100 х 15 мм пластины Петри.
2. Используйте бактерицидные лампы УФ (длина волны излучения = 253,7 нм) для обеззараживания BDM фильмов. Такие лампы часто встречается в стандартном шкафу биобезопасности. Убедитесь, что приУФ-света работает, нет потока наружного воздуха в шкаф биологической которые могут загрязнять БДМ фильмов.
3. Мокрые поверхности внутри колпака с 70% этанола и пусть вентилятор прибора в течение 15 мин для подачи воздуха. Затем закройте створки и обеззараживать поверхность капота с УФ в течение 2 часов.
4. Поместите BDM фильмов в дезактивацию капот, в рядах. Разрешить ультрафиолетовый свет, чтобы светить на фильмах в течение 2 часов.
5. Используйте чистую, стерилизованные щипцы, чтобы перевернуть BDM фильмов. Начало в первом ряду и работать, чтобы на заднем ряду, чтобы минимизировать время, руки и руки прямо над вновь дезактивации поверхностей BDM. Когда листать BDMs, место вновь дезинфицируют стороной вниз на чистую область облучают УФ-излучением, но не ранее в контакт с не-дезинфицируют стороне пленки.
6. Через 2 ч УФ обработки на каждой стороне, удалите BDM фильмов из кабинета биобезопасности с стерильного пинцета, снова работающий в направлении спереди назад, чтобы избежать размещения руки и руки на уже обеззараживаниеNAT-фильмов. Поместите BDM фильмов в стерильные, сухих, закрытых контейнерах, таких как покрытый фольгой стаканы. Хранить при комнатной температуре в темноте.

4. Установка плиты биопроб

Выполните все шаги в стерильных капот передачи в асептических условиях.

1. Lay УФ-дезинфицируют части БДМ на поверхность агара. Установка по одному углу первой и осторожно позволить остальной части площади рулона в контакт с агара. Избежать морщин. Некоторые фильмы образуют морщины, как во время хранения; это неизбежно. Особенно тонкие пленки могут требовать использования двух щипцов для того, чтобы заложить часть квартиры.
2. Место шарики полутвердые FMM КХЛ ³⁰ агара на вершине пластиковой пленкой, чтобы обеспечить водой и источник питательных веществ для первоначального заселения гидрофобных пластмасс. Бисер не являются необходимыми для водопроницаемых фильмов. Переплавить агара в микроволновой печи, и использовать микропипетки передать четыре 10 мкл капли расплавленного агара на мульчу (по одному в каждом Корнер). Не дотрагивайтесь до кончика пипетки непосредственно на мульчу, как это может прокол. Не должен превышать 10 мкл на падение, так как лишний вес на мульчи может вытащить пластмассу поверхность агара, когда пластины инвертируются.
3. Пусть пластины сидеть правой стороной вверх с крышками на ночь укрепить полностью, а затем сохранить запечатанный рукава агар-вверх при 4 ° С в темноте. Когда все будет готово для выполнения биотестирования (шаг 7), используйте I) одна тарелка FMM КХЛ ³⁰ (отрицательный контроль), II) Один биопроб планшет, содержащий четыре 10 мкл капли полутвердые FMM КХЛ ³⁰ на пластиковой пленкой, и III) одна пластина GMM (положительный контроль). Таким образом, четыре серии из изоляции может быть испытана на пластину среды.

5. Жидкий установки биопроб

1. Следуйте инструкциям по BDM резки в шаге 3.1. Перед разрезанием пластиковых пленок для жидкого биопроб, выберите размер, который вписывается в пробирку.Площадь, необходимая для достижения однородной массы из нескольких типов пластиковых будет зависеть от толщины пленки. Мы обнаружили, что части эквивалентно 0,0175 г хорошо вписываются в 15 х 150 мм трубы культуры.
2. Поверхностно-обеззараживания пленки с УФ-светом, как описано в пункте 3.
3. Для каждой повторности из микробных изолировать, готовят три пробирки для посева: а) 5 мл FMM содержащий БДМ фрагмент заданного размера (экспериментальный), II), 5 мл FMM, без источника углерода (отрицательный контроль), и III), 5 мл GMM (положительный контроль). Кроме того, Готовят дублирующие трубы FMM содержащие каждая BDM должны быть протестированы, но не привить их. Эти контрольные пробирки покажет любой рост микроорганизмов в результате загрязнения.

6. Выделение грибов

После инкубации образцы почвы и удаление, грибки выделяют из почвы, которая прилипает к БДМ фильмов. При желании бактерии могут simultaneouSly быть изолирована с тем же методом с использованием соответствующих средств массовой информации для выделения почвенных бактерий, таких как 1/10X триптическому разбавленный соевый агар дрожжей с добавлением 50 мкг / мл циклогексимид для сдерживания роста грибов ^37. Когда определенный средний требуется для бактериальной изоляции на шагах 5 и 7, М9 ³⁸ (плюс циклогексимиду) является хорошим выбором.

1. До обработки образцов, подготовить PBS и КПК КХЛ ^30. Разрешить PDA хлорофилла ³⁰ пластины сушат (unbagged) при комнатной температуре в течение приблизительно 24 часов для устранения конденсата на крышках и поверхность агара. Предварительно этикетке PDA КХЛ ³⁰ пластин.
2. Выкопать сетчатых мешков BDM содержащие отрывки из захоронений выбрали в шаге 1. Корабль и хранить при температуре 4 ° С не более 48 часов после извлечения из почвы.
3. Использование стерильного шпателя и пинцетом, аккуратно удалить почву, пока пластик не будет открыто, но не отмахнуться от почвы, которая цепляется за поверхность пленка BDM. Вырезать BDM пленки в 1 см2 шт до 0,5 г материала, полученного для каждой из четырех общей репликации. Передача 0,5 г BDM фильма и придает почве до 25 мл культуры пробирки, содержащие 9,5 мл PBS. Если мульча полной деградации или почву только контроль обрабатывается, добавляют 0,5 г почвы в PBS, если это возможно, выбрать части, которые все еще обесцвеченный из остаточного мульчи.
4. Вихревые культуры пробирки, содержащие 9,5 мл PBS и 0,5 г мульчи в течение 30 сек с высокой скоростью, разрушать ультразвуком в ультразвуковой водяной бане в течение 10 мин и снова вихрь в течение 30 сек. Агитация предназначен для развалится биопленки, физически удалить встроенные в клетки или придерживаясь мульчи куски, и создать однородную суспензию.
5. Приготовьтесь к серийно разбавленных PBS / почвенного раствора для получения индивидуальных колониеобразующих единиц от покрытий. Для каждого образца, место в ламинарный шкаф одной культуры трубку, заполненную 4,5 мл стерильного PBS. Для каждого образца заполнения трех скважин глубинными 96-луночный планшет заполнено 450 мкл PBS.
6. Оригинальный пластик / почвенной суспензии (0,5 г мульчи плюс 9,5 мл PBS раствор) представляет собой 5,0 х 10 ^-2 разбавления микробной материал, прилипший к пластиковым. Добавить 0.5 мл суспензии из этой первоначальной трубы до 4,5 мл стерильного PBS в пробирку, чтобы получить 5,0 × 10 ^-3 разбавления. Vortex в течение 30 сек при высокой скорости. Добавить 50 мкл до 450 мкл PBS в 96-луночный планшет. Повторите эти действия для всех образцов / повторяет. Используйте многоканальный пипетки, чтобы разбавить образцы в массовом порядке. Смешайте каждый новый разбавления с помощью пипетки вверх и вниз в десять раз. Изменить советов между разведения. Сделать разведения до 5,0 х 10 ^-6.
7. (Необязательно) бактериальных изолятов были более обильные, чем грибковых изолятов в образцах описанные здесь, таким образом, если одновременно выделения бактерий, а затем выполнить серийные разведения до 5 х 10 ^-8 в шаге 6.6 выше.
8. Равномерно распределены по 100 мкл из каждой из 5,0 × 10 ^-3 через 5,0 × 10 ^-6разведения через поверхность агара КПК КХЛ ³⁰ пластин с пламенем стерилизовать изогнутых стеклянных стержней. Магазин пластин вертикальном положении в течение 30 мин, чтобы позволить жидкости впитаться, а затем запечатать пластин парафильмом, чтобы избежать выхода из неизвестных спор изолятов. Выдержите перевернутой пластин при 20 ° С в темноте в течение 5 дней, чтобы как быстро и медленно растущих грибов образовывать колонии.

7. Первоначальный отбор Пластиковые унижающие Грибы

Важно: Все культуры с этого момента должны быть открыты только в шкафу биобезопасности (не ламинарный шкаф), чтобы избежать загрязнения окружающей среды спорами неизвестных идентичности. Некоторые почвенных грибов и бактерий являются потенциальными патогенами человека.

1. Изучить разбавления пластин, содержащих хорошо изолированные колонии. Выберите колонии, которая не касалась другой колонии.
2. Использование одного стерильной зубочистки, нежно прикасаться колония, а затем нажмите агар FMM (сделали в шаге 2.3 ), FMM + пластик (сделали в шаге 4) и GMM (сделали в шаге 2.3) плит, в таком порядке. Для инокуляции агар бусы поверх пластиковой пленки, руб зубочисткой осторожно на поверхности точка агар и затем проведите через пластиковую пленку. Повторите прививку от той же колонии источника, пока не существует четыре повторных полосы на каждой пластине.
3. Повторите шаги 7.1 через 7,2 до нескольких повторах не каждый визуально-уникальный тип колонии выбираются из каждой BDM образца.
4. Уплотнение пластин с Parafilm, инвертировать, и инкубируют при 20 ° С в темноте в течение 5 дней.
5. Определить изоляты, которые растут на BDMs лучше, чем они растут на ФММ. Если рост не является очевидным, просмотра образца при вскрытии микроскопом проверить колонизации или его отсутствие (рис. 1). Держите крышку, если крышка имеет конденсата, замените ее новой крышкой, но сделать это в кабинете биобезопасности.
6. Как только потенциальный деструкторов BDM выбираются, использование в качествеterile зубочисткой, чтобы очистить посевной из гриба колонизации пластиковых себе, а полоса для изоляции одного колониеобразующих единиц на КПК КХЛ ³⁰ пластин.
7. Уплотнение пластин парафильмом и инкубировать PDA хлорофилла ³⁰ пластины инокулировали пластик, разрушающих штаммов при 20 ° С в течение 5 дней в темноте.
8. Теперь, когда одной изолированной колонии очищаются, убедитесь, что они действительно способны колонизировать пластиковые пленки проходит испытания. Сбор инокулята (споры, дрожжевые клетки, или гиф) из одного колониеобразующих блок стерильной зубочистки. Повторите шаги 7.2 через 7.5. Через 5 дней инкубации при 20 ° С, изучить биологической пластины для роста грибов. Если изолировать растет на БДМ пленка лучше, чем он растет на FMM как в первом, (7.5) и второго (7.8) испытаний, затем сохранить выделить, как описано ниже в пункте 8.

8. Долговременное хранение пластической деструкторов

В целом, пластик, разрушающих штаммов будет испытана в пластине биоанализа (7.5), повторно очищают до одного изолированного колониеобразующих единиц (7.6), испытанные в пластине биологической снова (7.8), и, наконец, испытанные в жидкости биологического анализа ( 9.1 - 9.5). Во время тестирования изолятов должны быть переданы на свежие среды каждые месяц и рабочих пластин запас хранили при 4 ° С, как только достаточный рост является видимым. Изоляты также должен быть сохранен как глицерине при -80 ° С, и / или как сухие спор на стерильную фильтровальную дисков при 4 ° С. Оба методы хранения, описаны ниже.

1. Для каждого изолята, которые росли на BDM фильм лучше, чем это выросло на FMM как в первой (7.5) и второй (7.8) биоанализы пластины, подготовить два PDA КХЛ ³⁰ пластин с двумя или тремя стерилизовать фильтровальные диски бумаге, примерно на 1 см в диаметре , на поверхности. Привить эти две пластины изже одной колонии, выбранный в шаге 7.8 выше. Сделать газон, распространяя посевной равномерно по агара максимального роста. Уплотнение пластин парафильмом и инкубируют при 20 ° С в течение 5 дней. Этот шаг может быть начата одновременно с Шаг 7,8 для повышения эффективности.
2. Фильтр диска на поверхность агара должна быть покрыта мицелия / спор. Удалить фильтровальных дисков от поверхности агара стерильным пинцетом, и помещают в стерильную пробирку Эппендорфа. Воздух сухой фильтровальные диски ночь внутри Эппендорф труб (с шапкой) в шкафу биобезопасности или другой сухой стерильной среде с минимальным движением воздуха, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Затем запечатайте парафильмом, и хранят при температуре 4 ° С.
3. Используйте стерильный ватный тампон или зубочисткой, чтобы собрать спор и мицелия от газона пластин. Приостановить спор и гиф в 30% глицерина в криопробирки, Flash-заморозить в жидком азоте и хранят при температуре -80 ° С.

9. Строгие Confirmation пластической использованию через жидкие биопроб

1. Создание свежего споры и / или клеток, с которыми для инокуляции жидкой культуры: инокулята PDA хлорофилла ³⁰ пластин со спорами от потенциальных пластиковый унижающего изолятов. Уплотнение пластин с Parafilm, и инкубируют при 20 ° С до тех пор грибковых спор не видны.
2. В кабинете биологической безопасности, урожай спор путем промывки пластины с 0,01% Тритон Х-100 (5 мл на 15 х 100 мм чашки пластина работает хорошо) и очистка спор (или дрожжевой клетки) от поверхности стерильной изогнутого стекла стержень . Aspirate спора (или ячейки) подвески и передачи в стерильный контейнер.
3. Граф спор или клеток с гемацитометре и определения соответствующего объема добавлением 5 мл FMM бульоне в течение в общей сложности 1 × 10 ⁶ спор / трубки. Объем должен быть менее 10 мкл. Разбавление концентрированного суспензии спор на 0,01% Triton X-100 может быть необходимым.
4. В стерильных капот передачи, прививку пробирках с культурой подготовлены в Этап 5 1 × 10 ⁶ спор (или дрожжевых клеток). Уплотнение крышки парафильмом, чтобы избежать утечки споры, особенно для неизвестных изолятов. Инкубируют в темноте при 20 ° C и наблюдать образцы еженедельно для роста.
5. Мицелия рост грибков на пластиковые пленки могут быть видимыми в течение первой недели после прививки, особенно у краев пластиковых пленок. Для планктонных дрожжей (о чем свидетельствуют облачный среды), рост можно контролировать с помощью оптической плотности при 600 нм. Поскольку грибов могут придавать непосредственно к полиэтиленовой пленки, рост можно оценить на глаз, и может быть подтверждено с помощью световой микроскопии и / или сканирующей электронной микроскопии (SEM).
6. В FMM только для контроля, искать незначительный белые пятна, которые слишком малы, чтобы зарегистрировать изменения оптической плотности по спектрофотометрическим методами. Эти пятна могут быть отсасывали пипеткой Пастера и наблюдали с использованием дифференциального интерференционного (DIC) микроскопии. Пятна часто неидентифицируемые прецизионныхpitate, но в некоторых случаях они могут быть сгустки оригинального модификатора, что проросли, но не существенно выросла.
7. Использование визуальных и микроскопических наблюдений для сравнения колонизации экспериментальных образцов и контроля, а также присваивать рейтинги роста на каждом образце пленки BDM. Поскольку многие BDMs темного цвета и разрешение минимальное наблюдение с помощью микроскопа за исключением краев, и толщина пленки запрещает наблюдения в масляно-иммерсионный объектив, SEM полезно оценить я) наличие микробного роста, например, с помощью системы оценки описано в Таблице 1, и II) степень деградации BDM.

10. SEM Подготовка образцов

1. Используйте чистые, стерильные ножницы, чтобы вырезать небольшие кусочки BDM от одинаковых образцов. Исправить BDMs путем погружения в 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,2) в течение 24-48 часов.
2. В то время как фиксация происходит, обезвоживает чистого 100% этанола путем добавления 5-10% VOЛуме 3 молекулярное сито (активируется в сушильном шкафу при температуре 175-260 ° С и охлаждают в эксикаторе), и позволяют сидеть при комнатной температуре в течение ночи, чтобы гарантировать полную обезвоживания.
3. BDMs погрузить в 0,1 М натрий-фосфатного буфера (рН 7,2) в течение четырех промывок 15 мин каждый.
4. Погрузите BDMs измерении воды в течение трех промывок 5 минут каждый.
5. Высушить БДМ образцов в этаноле серии, погружение в течение 20 мин при каждой концентрации: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% и 100%. Промыть BDMs в два раза больше в 100% этаноле в течение 20 мин на полоскания.
6. Тема образцы критической точки и сушки напыления.

Результаты

В недавнем исследовании ^24, четыре повторяет каждый из трех имеющихся в продаже BDMs надписью "биоразлагаемый", а также экспериментальное кино и обычные пластиковые контроль, были размещены в минувшие почвы в качестве мульчи для томатного производства в весной 2010 года в Маунт-Верноне, штат Вашингтон, Ноксвилл, штат Теннесси, и Лаббок, Техас. Осенью 2010 года, площадей BDM фильма были вырезаны из каждой выветривания мульчи в четырех повторных участков, и родная земля была удалена из непосредственно под облас...

Обсуждение

Процедура, описанная в этом документе представляет первый проход техники выделения потенциальных деструкторов BDM из почвы, и был успешно использован для выделения грибов из BDMs похоронен в почве в течение семи месяцев. Грибы росли при reinoculated на свежий материал БДМ того же типа, что указывает на изолированных грибов были действительно колонистов, и что пленки не ингибируют рост грибов. Выделение пластиковым унижающие грибки и бактерии потенциально способны привести к их использованию, по отдельности или в комбина...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Картофельная декстроза Агар	Бектон Дикинсон	8X05491
Агар	Фишер	BP 1423-2
Хлорамфеникол	Acros Organics	200-287-4
Глутаральдегид	Electon Microscopy Sciences	16216-10	Токсичное
молекулярное сито	Fisher	M-8892
Этанол	Pharmco-Aaper	E200
Контрекс	Декон Лабс, Инк.	5204
Парапленка М	Печиней Пластиковая упаковка	S37440
Минеральные соли для буферов и сред	Fisher	Различные	Различные продавцы продают эти реагенты