Method Article

Транскриптомных анализ человеческой сетчатки Хирургические образцы Использование Журнала

DOI:

10.3791/50375

⸱

August 14th, 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1U968, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, 2UMR S 968, Université Pierre et Marie Curie, 3UMR 7210, Centre National de la Recherche Scientifique, 4Départment d'Ophtalmologie, Centre Hospitalier Universitaire de Bordeaux

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали образцы из сетчатки retinectomy для анализа транскриптомных отслойки сетчатки. Мы разработали процедуру, позволяющую РНК сохранения между хирургических блоков и лаборатории. Мы стандартизированный протокол для очистки РНК с помощью ультрацентрифугирования цезий хлорида чтобы гарантировать, что очищенный РНК пригодны для анализа микрочипов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отслойка сетчатки (RD) описывает разделение нейросенсорной сетчатки от пигментного эпителия сетчатки (RPE). НПП имеет важное значение для нормальной функции светочувствительных нейронов, фоторецепторов. Отряд сетчатку от НПП создает физический разрыв, который заполняется внеклеточной жидкости. RD инициирует клеточные и молекулярные неблагоприятных событий, которые влияют как на нейросенсорной сетчатки и ПЭС, так как физиологические обмена ионов и метаболитов резко нарушается. Следствием для зрения связана с длительностью отряда с быстрым reapposition из двух тканей приводит к восстановлению зрения 1. Лечение RD исключительно хирургическое. Удаление стекловидного тела (витрэктомия) сопровождается удалением несущественных часть сетчатки вокруг удаленные районы и в пользу отслойки сетчатки. Удалены сетчатки образцы ничейная вещь (ничего) и, следовательно, обычно уничтожается.Для восстановления РНК из этих хирургических образцах, мы разработали процедуру журнал, который позволяет РНК сохранение во время передачи из хирургического блока в лабораторию. Мы также стандартизированный протокол для очистки РНК цезием ультрацентрифугирование хлорида чтобы гарантировать, что очищенная РНК подходят для глобального анализа экспрессии генов. Качество РНК была подтверждена как ОТ-ПЦР и анализ микрочипов. Анализ полученных данных показывает одновременное участие воспаления и дегенерацию фоторецепторов в течение RD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основной терапевтической цели в отслойка сетчатки (RD), чтобы найти способ ограничить фоторецептора повреждения клеток и воспаление сетчатки в результате разделения фоторецепторов от сетчатки пигментированных эпителиальных клеток. Во RD, RPE клетки активируются, мигрируют, дедифференцироваться и размножаться на поверхности отслоение сетчатки, оказывая сократительной силы приводит к осложнениям. Транскриптомика анализ RD является способом для выявления целевых генов с измененной экспрессии после RD и, следовательно, будущих терапевтических молекул, которые могли бы улучшить конечный визуальный результат в сочетании с хирургией. Хорошо известно, рибонуклеиновая кислота (РНК) не является стабильным как дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), последнее время широко используется для генетических исследований, его устойчивость разрешил секвенирование генома неандертальца от палеонтологических образцов более чем 30 000 лет 2. Транскрипции ДНК генов из генома в РНК являетсяосновным процессом в экспрессии генов и мРНК лабилен для того, чтобы представлять собой сигнала. РНК очень быстро разрушается ферментами, которые заканчиваются РНКазы сигнала. Когда ткань выделяют из организма, РНК очень часто деградированных перед выражением изучается в научно-исследовательской лаборатории. Деградированных РНК не подходит для анализа экспрессии генов. Потому что сотрудники лаборатории не могут участвовать в операции, мы разработали процедуру, которая легко и требует лишь, что хирург для восстановления тканей в соответствующих РНКазы решение. РНК из тканей является стабильным и может быть проанализирована без каких-либо признаков деградации после 72 ч при комнатной температуре в этом растворе. РНК из образцов очищали с помощью стандартного метода с участием ультрацентрифугирования в градиенте хлорида цезия после того, как были переданы в лаборатории 3. Затем качества РНК оценивали с помощью электрофореза в агарозном геле и ОТ-ПЦР. Протокол очистки РНК имеетПреимущество разделения молекул в зависимости от их плотности, которая отличается для ДНК и РНК, и гарантирует, что РНК не загрязняется молекулы ДНК, которые будут генерировать искусственной сигналов в исследования экспрессии генов. Кроме того, передача РНК (тРНК), который количественно наиболее распространенным РНК в клетке, отделены соответствии с теми же физическими свойствами из рибосомной РНК (рРНК) и матричными РНК (мРНК), эти два последних из которых конечного продукта процесса очистки. Удаление тРНК из препарата полезно, так как большинство микрочипов протоколов аналитический связано с использованием обратной транскриптазы и РНК-полимеразы, которые ингибируется тРНК 4-6. Очищенные РНК из хирургических образцов помечены с использованием стандартного протокола и гибридизовали с микроструктурного чипа, а результаты анализировали с помощью двух дополнительных методов, ложный способ скорость открытия, и с использованием нового метода, основанного на взаимной информации и визуализациюЮНЕСКО нашла на веб-сервере Retinobase 7,8.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Journal: Процедура восстановления Образцы из операционный блок

В лаборатории

  1. Получить контракты на импорт от компании экспресс-доставки.
  2. Заполнить 10 (или 25) отправка форм с почтовой адрес лаборатории с указанием контактного лица в лаборатории (Номер телефона и адрес электронной почты).
  3. Подготовка 10 (или 25) Образцы форм пронумерованы от 1 до 10 (или 25). Эти формы включают в себя выделенный пространства сообщить о) анонимная идентификация пациента, б) дата операции и в) любые дополнительные замечания хирург хотел бы добавить. Подготовьте 10 (или 25) конверты с окном (150 х 210 мм).
  4. Получали с использованием РНКазы реагентов 25 (или 65) мл 6 М гуанидин-хлорида в диэтилпирокарбонатом (DEPC) обработанных H 2 O (GHCL).
  5. Заполнить 10 или 25 номером 5 мл стерильной полиэтиленовой трубы круглого дна с 2,4 мл GHCL решение.
  6. Использовано аргоном заполнить верхнюю часть этих труб, чем прессе тиghtly на крышке, чтобы предотвратить окисление GHCL раствору в течение нескольких лет хранения в хирургический кабинет.
  7. Введение каждые 5 мл пробирки в 50 мл стерильной полипропиленовой коническую трубку с нижней крышки. Используйте кусок чистой ткани бумаги провести 5 мл трубки в 50 мл трубки, закройте трубу.
  8. Поместите 50 мл пробирок на стойке полистирола и стойки в картонную коробку с конвертами, судоходная формы, образцы форм.
  9. Вставить инструкциям (см.: 1.12-1.19) внутри крышки картонной коробки для облегчения их чтения.
  10. Отправить картонную коробку по почте к контактному лицу в больнице.

В больнице

  1. Принесите картонную коробку из хирургического кабинета хирургической комнате. Внимание Примечание: Если процедура включает в себя ослабленным иммунитетом пациента, картона не должны быть доведены до хирургической комнате.
  2. Во время операции, поместите сетчатки specimEN на пронумерованные 5 мл стерильной полипропилена заполнены GHCL решение. Закрыть плотно трубки.
  3. Верните пробирки.
  4. Поместите пробирку на рокера трубки крови в течение 10 мин.
  5. Заполните прилагаемый образец бланка сочтены.
  6. Сообщить идентификационный номер на соответствующий номером 50 мл трубки.
  7. Введем 5 мл трубки с хирургическим образца в 50 мл трубки, заменить бумажные ткани и закрепите трубу.
  8. Введем трубки и заполненный образец формы в него в одном из прилагаемой конверты. Закрыть его.
  9. Позвоните в компанию экспресс-доставки для забрать.

2. Очистки РНК

В лаборатории

  1. Однородный образец в 5 мл полипропиленовую пробирку с GHCL решение с помощью гомогенизатора в течение 1 мин при перемещении трубки вверх и вниз.
  2. Добавить 270 мкл 2 М раствора ацетата рН 5,0. Энергично встряхните в течение 10 мин, помещая трубку на качалке в своемгоризонтальное положение (420 мин -1).
  3. Центрифугируют 10 минут при 5000 оборотов в минуту (6500 мкг) при 20 ° С.
  4. Аспирируйте плавно растворимой фракции, не нарушая гранул.
  5. Перевод на 14 мл стерильной пробирке.
  6. Добавить 5.3 мл 100 мМ Трис рН 8,0, N-лауроилсаркозин 1%.
  7. Добавить 3,2 г хлорида цезия (CsCl) и тщательно перемешайте встряхиванием трубки.
  8. Добавить 1,8 мл CsCl / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в стерильной 11 мл центрифужную пробирку полиалломера.
  9. С 10 мл стерильной пипетки Пастера перенести решение РНК на 1,8 мл CsCl / EDTA, сдвинув медленно на край трубки, чтобы не мешать плотности подушки.
  10. Место труб (второй пробирке, содержащей буфер без сетчатки при необходимости) в роторе.
  11. Центрифуга 24 ч при 32000 оборотов в минуту (225000 х г) при 20 ° С.
  12. Снимите Улучшенный часть решения стерильной пипетки Пастера и выбросьте его.
  13. Удалить постепенно во время проверкимомент, когда ДНК (вязкие) всасывается со второй стерильной пипетки Пастера и выбросьте его.
  14. Удалите оставшийся раствор, стараясь не выпустить осадок РНК с третьей стерильной пипетки Пастера.
  15. Раздел нижней части трубы скальпелем пламени стерилизовать, а затем положить оставшуюся часть трубки вверх дном на стерильной взгляда.
  16. Обратные трубки и промыть деликатно 160 мкл GHCL.
  17. Пусть сухих гранул в течение 10 мин.
  18. Ресуспендируют осадок в 150 мкл (10 мМ Трис, рН 7,5 - 1 мМ ЭДТА - 0,1% SDS).
  19. Передача раствора в 2 мл стерильной пробирке микроцентрифужных, а затем собрать остаточный осадок с 30 мкл (10 мМ Трис, рН 7,5 - 1 мМ ЭДТА - 0,1% SDS).
  20. Добавить 150 мкл (10 мМ Трис, рН 7,5 - 1 мМ ЭДТА).
  21. Добавить 30 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,0, вихревой трубки.
  22. Добавить 900 мкл этанола 100% (-20 ° С), вихревой трубки.
  23. Поместите пробирку 30 мин при плавлении льда.
  24. Центрtrifuge трубки 30 минут при 15000 оборотов в минуту при 4 ° С.
  25. Аспирируйте деликатно растворимой фракции, и выбросьте его.
  26. Добавить 500 мкл 70% этанола (RT), вихревые трубки.
  27. Центрифуга трубки 20 мин при 15000 оборотов в минуту (18000 х г) при 4 ° С.
  28. Повторить этап полоскания (70% этанол).
  29. Центрифуга кратко и устранить оставшиеся этанола с помощью пипетки Р200.
  30. Пусть гранул сухого воздуха в течение 10 мин.
  31. Ресуспендируют осадок в 50 мкл DEPC-обработанной H 2 O.
  32. Смешайте энергично встряхиванием.
  33. Инкубируют 15 минут при 45 ° С на водяной бане.

3. Анализ РНК помощью гель-электрофореза

  1. Налейте агарозном геле внутри химических капотом.
  2. В стерильную пробирку на 1,5 мл микроцентрифужных, добавляют по 2 мкл РНК должны быть проанализированы и 6,4 мкл образца буфера преп.
  3. Во втором 1,5 мл пробирку, добавляют 3 мкл стандартов РНК и 9,6 мкл буфера для образцов преп.
  4. Нагреть трубы 15 мин при 65 ° C, Положить их на лед.
  5. Добавить 1 мкл бромистого этидия (EB) загрузка буфера без красителя в трубке РНК образца и 1 мкл EB загрузки буфера с красителем в трубке РНК стандартам.
  6. Не Run гель при 80 - 100 В Внутри химической капот в рабочем буфере, пока один из красителей (бромфеноловый синий) достигает 2/3 от нижней части геля.
  7. Промойте гель дважды 15 мин с 250 мл де DEPC-обработанной 2х SSC.
  8. Возьмите оцифрованные изображения в ультрафиолетовом освещении.
  9. Рассчитайте соотношение между верхней полосе (23S рРНК) и нижняя полосы (16S рРНК).

4. Окончательную очистку РНК

  1. Регулировка объема образца РНК до 100 мкл DEPC-обработанной Н 2 О (при необходимости).
  2. Добавить 100 мкл кислота фенол (1 мл фенола, насыщенного в DEPC-обработанной H 2 O + 130 мкл 50 мМ ацетата натрия, рН 5,2), вихревые энергично.
  3. Центрифугируют 10 мин при 13000 оборотов в минуту (15000 х г) при комнатной температуре.
  4. Recoveт тщательно и передавать водной фазы (верхн фаза) в новый стерильный 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
  5. Добавьте 10 мкл 3 М ацетата натрия, рН 5,2 и 250 мкл 100% этанола (-20 ° C).
  6. Инкубируйте пробирку 30 мин в тающий лед.
  7. Центрифуга трубки 30 минут при 14000 оборотов в минуту (18000 х г) при 4 ° С.
  8. Аспирируйте тщательно растворимой фракции, и выбросьте его.
  9. Добавить 500 мкл 70% этанола (комнатная температура), и вихревой трубки.
  10. Центрифуга трубки 20 мин при 14000 оборотов в минуту (18000 х г) при 4 ° С.
  11. Повторить этап полоскания (70% этанол).
  12. Центрифуга кратко и устранить оставшиеся этанола с помощью пипетки Р200.
  13. Пусть воздух сухой осадок в течение 10 мин.
  14. Ресуспендируют гранул в 50 мкл DEPC обработанных H 2 O.
  15. Инкубируют затем трубка 15 мин при 45 ° С.
  16. Измеряют поглощение (Abs) при 260 нм и 280 нм на 2 мкл образца РНК. Расчетное соотношение Abs260/Abs280.
    17. <литий> хранить образцы РНК при -80 ° С (стабильны в течение нескольких лет).

5. Решения и процесса очистки

  1. Ацетат калия 2 М, рН 5,0: Растворить 19,6 г ацетата кали в 70 мл DEPC обработанных H 2 O. Очистка зонда рН-метра, погрузив его в 1 М NaOH в течение 15 мин, а затем 5 промывок DEPC обработанных H 2 O. Доведения рН до 5,0 с помощью уксусной кислоты затем отрегулировать объем до 100 мл с DEPC обработанных H 2 O.
  2. Трис-HCl, 100 мМ, рН 8,0, N-лауроилсаркозин 1%: растворите 2 г N-лауроилсаркозин (под колпаком) в 40 мл 0,5 М Трис-основание рН 8,0. Настройка громкости до 200 мл DEPC обработанных H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 г CsCl в 50 мл 10 мМ ЭДТА, рН 7,5, приготовленные из DEPC обработанных H 2 O. Автоклав и регулировать громкость до 100 мл DEPC обработанных H 2 O. Проверьте рН <7,5.
  3. Агарозном геле 1%: Положите 1 г агарозы в 62 мл DEPC обработанных H 2 O. Варить в микроволновой печи. Добавить 18 мл 12,3 Mформальдегида, 20 мл 5x MOPS. Налейте внутрь химических капотом.
  4. Буфер пробоподготовки: быть готовым импровизированный. Смешайте внутри химических капотом 8 мкл 5x швабры, 16 мкл 12,3 M формальдегида и 40 мкл формамидом.
  5. EB загрузки буфера (без красителей): быть готовым импровизированный. Добавить 4 мкл 10 мг / мл этидий-бромида в 20 мкл 80%-ного глицерина, приготовленные из DEPC обработанных H 2 O.
  6. EB загрузки буфера (с красителем): быть готовым импровизированный. Добавить 2 мкл 10 мг / мл этидий-бромида в 10 мкл 80%-ного глицерина, содержащего 0,25% Ксилен цианол, 0,25% бромфенола синего цвета с DEPC обработанных H 2 O.
  7. Запуск буфер: К 60 мл 5x швабры, добавить 54 мл 12,3 М формальдегида и 186 мл DEPC обработанных H 2 O.
  8. DEPC обработанных H 2 O: Инкубировать дистиллированной воде с 0,1% об / об диэтилпирокарбонатом течение 2 ч при 37 ° С при перемешивании. Стерилизовать в автоклаве.
  9. Очистка гомогенизатора: добавить 25 мл моющего раствора (RBS) в 1 л DEPC-обрабатывают H 2 O, и Измерения температуры оси 1 мин при перемешивании. Инкубируют 2 ч при 60 ° С. Тщательно промыть DEPC обработанных H 2 O Wrap прибора в алюминиевые и введены в прибор коробку. Оберните коробку. Стерилизовать в автоклаве.
  10. Очистка электрофореза устройства: Вымойте аппарат, лоток и 15 скважин расческой. Инкубируют 15 минут при 3% перекиси водорода. Полоскание один раз 100% этанолом. Воздух сухой.
  11. Очистка стекла блюда: Очистите стекло блюд RBS 2% всю ночь, а затем промыть дистиллированной водой до стерилизации при 200 ° С.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедура журнала (рис. 1) позволяет восстановить образцы сетчатки от хирургического блока очищенной РНК, а также проанализировать транскриптома отслойки сетчатки. Сетчатки результаты отрядом в регуляция хемотаксиса моноцитов MCP1 CCL2 гена, а в уменьшение экспрессии стержня фоторецепторов трансдукции гена GNAT1, короткая волна конуса опсин OPN1SW и homeogene CRX (рис. 2). Индукция CCL2 в результате воспаления 9, тогда как сопутств...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Развитие процедуру ткани восстановление после хирургического блока была необходима для транскриптом анализа отслойки сетчатки. Следует заметить, что такого рода операции практикуется в чрезвычайной ситуации и о том, что операционная офтальмологи имеют мало времени для участия в программе биологических исследований, когда они работают. Это retinectomy также выполняется стохастически в каждой службе, так что простой способ достичь статистической номерами является работа с сетью. В такой сети, стандартизация коллекции ткан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Сашу Райхман и Доминик Santiard-барона за помощь в редактировании протокола очистки РНК.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ЦентрифугаBeckman CoulterAventi J-E
РоторBeckman CoulterJS-5.3
УльтрацентрифугаBeckman CoulterLE 80K
РоторBeckman CoulterSW41
Источник питанияBioradPac 3000
PolytronTMKinematicaPT 2100В комплекте с PT-DA 2105:2
Аппарат для электрофореза в агарозном гелеBioradMiniGel Cell GT
Imaging System BioradGelDoc-It Imager
5 мл стерильная полиэтиленовая пробиркаGreiner115261
Стерильная полиалломеровая центрифуга пробирка Beckman Coulter331372
Химические реактивыSigmaКласс молекулярной биологии (продукты без РНКазы и ДНКазы)
Чистящий раствор VWRRBS
микрочипAffymetrixHuman U133 плюс 2 матрицы

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitry, D., Charteris, D. G., et al. The epidemiology of rhegmatogenous retinal detachment: geographical variation and clinical associations. The British Journal of Ophthalmology. 94 (6), 678(2010).
  2. Green, R. E., Krause, J., et al. A draft sequence of the Neandertal genome. Science. 328 (5979), 710(2010).
  3. Glisin, V., Crkvenjakov, R., et al. Ribonucleic acid isolated by cesium chloride centrifugation. Biochemistry. 13 (12), 2633(1974).
  4. Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., et al. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (5), 1663(1990).
  5. Cavalieri, L. F., Yamaura, I. E. coli tRNAs as inhibitors of viral reverse transcription in vitro. Nucleic Acids Research. 2 (12), 2315(1975).
  6. Sawadogo, M. On the inhibition of yeast RNA polymerases A and B by tRNA and alpha-amanitin. Biochemical and biophysical research communications. 98 (1), 261(1981).
  7. Delyfer, M. N., Raffelsberger, W., et al. Transcriptomic analysis of human retinal detachment reveals both inflammatory response and photoreceptor death. PloS ONE. 6 (12), e28791(2011).
  8. Kalathur, R. K., Gagniere, N., et al. RETINOBASE: a web database, data mining and analysis platform for gene expression data on retina. BMC Genomics. 9, 208(2008).
  9. Nakazawa, T., Hisatomi, T., et al. Monocyte chemoattractant protein 1 mediates retinal detachment-induced photoreceptor apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (7), 2425(2007).
  10. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Science Translational Medicine. 2 (26), 26ps16(2010).
  11. Chalmel, F., Leveillard, T., et al. Rod-derived Cone Viability Factor-2 is a novel bifunctional-thioredoxin-like protein with therapeutic potential. BMC Molecular Biology. 8, 74(2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal DetachmentRNA PurificationCesium Chloride UltracentrifugationTranscriptomic AnalysisJouRNAl ProcedureHuman Retinal SpecimensInflammation MarkersPhotoreceptor DegenerationGene Expression AnalysisGel Electrophoresis

Related Articles