Применение<em&gt; В пробирке</em&gt; Защита ДНК Assay, чтобы визуализировать Стресс посредничеству свойствах белка Dps

Краткое содержание

ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps) играет решающей роли в борьбе бактериальные стресс. В данной статье рассматриваются очистки E. палочка Dps и протокол, для В пробирке Анализе демонстрируя Dps-опосредованной защиту ДНК, образующую от деградации активных форм кислорода.

Аннотация

Окислительный стресс является неизбежной побочным продуктом аэробные жизни. Молекулярный кислород необходим для наземного метаболизм, но она также принимает участие во многих разрушительных реакции в живых организмах. Сочетание аэробного метаболизма и железа, что является еще одним жизненно важным соединением для жизни, достаточно для производства радикалов через химию Фентон и ухудшить клеточных компонентов. Деградации ДНК является, пожалуй, самым разрушительным процесс с участием внутриклеточные радикалы, как ДНК ремонт далека от тривиальными. Анализе представленные в этой статье предлагает количественные технику, чтобы измерять и визуализации эффекта молекул и ферменты на радикальных-опосредованной повреждения ДНК.

Анализе защита ДНК представляет собой простой, быстрым, и надежная инструментом для в характеристике пробирке из защитные свойства белки или химическими веществами. Она включает в себя подвергая ДНК, чтобы разрушительным реакции окислительного и добавление различными концентрациями представляющего интерес соединения. Уменьшение или увеличение из повреждение ДНК, как функцию от соединение концентрации затем визуализировал с использованием гель--электрофореза. В этой статье мы продемонстрировать технику из анализе защиту ДНК путем измерения защитных свойствах ДНК-связывающем белка из голодающих клеток (DPS). Dps представляет собой мини--ферритин, который используется более, чем на +300 бактериальный видов к мощно борьбы с экологических стрессоров. Здесь мы приводим протокол Dps очистки и оптимальных условий анализа для оценки защита ДНК от ДПС.

Введение

Аэробные организмы должны постоянно утверждаю, с реактивных видов кислорода, которые могут повредить их ДНК, а также других решающий биологический макромолекулами. Один сильнодействующий инструмент, чтобы противодействовать токсических эффектов из окислительного повреждения является ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps). С момента своего открытия в 1992 году от голода E. палочка культура ^{1, Дата} Dps была идентифицирована в более чем 300 видов бактерий и архебактерии ^2. Массивные повышающая регуляция Dps во время стационарная фаза делает его наиболее экспрессируется на высоком уровне нуклеоидом-белок, ассоциированный с из E. палочка в условиях голода, условий ^{3, 4.} Кроме того, Dps как было показано, сохранять как бактериальных, так жизнеспособность и ДНК целостность во время многие различных стрессов, в том числе голодание, высокая концентрация железо, воздействие УФ лучей света, тепла шок, и окислительного стресса ^{5, Отзывов: 6.}

Структурно, Dps самоассоциатов в стабильную гомо-олигомерный комплекс из 12 мономеры, WHICH собираться в сферической полой оболочке. ~ 4.5 нм-широкий внутреннюю полость, является доступным для экстерьер растворитель через поры, которые позволить проход малых молекул, ^+7, и оно может секвестровать минерализованный металлы, такие как железо ^8. Защитный эффект Dps вытекает из его на ряд биохимических деятельность, которая включает неспецифические ДНК-связывающий ^1, ferroxidase активности, и железа хранения ^8.

Подробные изучать полезные биохимические деятельностью Dps первая требует от своих очистки. Dps очистки является разработка процедуры, Dps должны быть разделены не только от других белков, но и от любой связанной ДНК ^7. Наши оптимизированного процесса очистки использует многие общие методы, состоящий из двух ионообменных колонках и осаждение сульфатом аммония шаг. Несколько обмены буфер необходимы, в качестве высокой степенью концентрации Dps можете осаждаются из раствора в странах с низким условий солью. Как только Dps белок был очищенный, Оно может быть применены к анализов, которые непосредственно измерить его ferroxidase активность ^8, ДНК-связывающими стехиометрией ^+9, а также механизмы из железо связывания ^+10. Очищенная Dps также имеет и другие потенциальных применений. Стабильная полые сферические структуры Dps был использован в качестве каркаса для хранения гидрофобных частиц внутри белковой полости ¹¹ и даже в качестве реакционной камере, чтобы синтезировать новые магнитные наночастицы ^12.

Защитный способность из Dps, чтобы посредничать повреждение из-за реактивных видов кислорода можете быть четко и в непосредственно продемонстрированный с использованием анализа ДНК защита ^{13, 14.} В этой в процедуре пробирке, радикальными видов производятся, когда железо катализирует H ₂ O ₂ деградации через химию Фентон. Эти радикалы непосредственно повреждению ДНК, присутствующей в реакции, и может полностью деградировать его при высоких концентрациях. Два ключевых деятельностью Dps может как непосредственно, так противодействовать эффектам Fentна-опосредованной радикалов. Dps снижает концентрацию каталитический железо через минерализация, потребляя доступный перекись водород в этом процессе. Кроме того, Dps связыванию с ДНК может потенциально оградить его физически от радикальное повреждение и конденсирует его в меньший объем с менее реакционноспособной площадь поверхности. Сочетание этих две свойств делает анализе ДНК защита хорошо подходят для целью измерения защитной активностью Dps.

В анализе ДНК защита является достаточно универсальным и может быть использована для разнообразие применений, помимо характеризацию Dps. Радикальные повреждение является распространенной формой из стресс в клетках,, и много различных белки и химические вещества используются для противодействовать его. Общий принцип, из проведением теста, с использованием ДНК целостность в качестве маркера для радикальное повреждение, могут быть использованы в комбинации с почти любом радикальный-продуцирующей реакции или противодействующий агентом. Среди прочих, анализе была успешно использована чтобы определить, анти-окислительное свойстваиз К. метельчатая экстракта для использования в пищевой промышленность ^15,, чтобы характеризовать эффекты мочевой кислоты на гидроксильных посредничеству повреждению ^16, и, чтобы получить новых способность проникновения в суть образом нужен мех: транскрипционном белки регулятором ^17.

Несмотря на многочисленными вариантами использования анализе в опубликованных работах, мы обнаружили,, что многие оптимизация и устранение неполадок шаги были требуется, что делает настройку методики для обнаружения в первый раз излишне трудоемкий процесс для многих исследователей. Протоколом мы представляем в этой статья призвана, чтобы удалить этот барьер для внесения записи.

Протокол

1. Dps Экспрессия и очистка

Получение белка высокой чистоты является важным первым шагом для ДНК-анализ защиты. Очисткой из белок Dps могут быть выполнены в +4 до 5 дней.

1. Преобразование протеазу-дефицитный штамм из E. палочки (такие как BL21 (DE3) pLysS) с животным вектор (например, pET17), в которую Dps кодирующей белок последовательности были клонированы.
2. Подряд трансформированных клетках выходят на А. Р. Лурия Бульон (LB) чашках с агаром, содержащие соответствующее антибиотики (, такие как ампициллин и хлорамфеникол для примеров, при условии в 1.1). Инкубируйте пластинами в течение ночи при 37 ° С.
3. Инокулируйте по одну колонию от пластины в +30 мл из LB средой, содержащей соответствующие антибиотики. Выдержите в течение ночи при 37 ° C в то время как встряхивании при 200-250 оборотах в минуту.
4. Инокулируйте по 2 х 1 L LB средой, содержащей соответствующие антибиотики с помощью 10 мл каждой из ночной культуры. Grow при 37 ° C, в то время тряску,, чтобы OD ₆₀₀ приблизительно 0,6. (Рост клеток выше OD выход белка увеличивается, без заметного ущерба для чистоты конечного продукта.) Индуцируют экспрессию Dps добавлением IPTG до концентрации 0,3 мМ и инкубируют при 37 ° С в течение 3-4 часов при встряхивании.
5. Harvest клетки центрифугированием при 6000 мкг в течение 15 мин. Ресуспендируют клеточный пеллеты в 7,5 мл DEAE буфере А, (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА) на душу L из индуцированной культура ячейку. Образцы могут быть подвергнуты замораживали в жидком азоте и хранят при -80 ° C, если желательный. Эта процедура может затем быть продолжены по оттаивание образцах в ванну с водой при 4 ° C.
6. Добавить собой смесь ингибиторы протеазы (, таких как фирма Calbiochem набор III ингибиторы протеазы, по крайней +0,167 мкл на мл клеточной суспензия) к клеточной суспензии, чтобы предотвратить деградация из сверхэкспрессированный Dps.
7. Подготовьте свободный от клеток экстракт использованием французской прессе. Премьер-французской прессе с помощью 20 мл DEAE Буфер А (если с использованием непрерывного-модели потока), то disrupT образца в два раза при 20 KPSI. Центрифугируйте лизата по крайней 30000 мкг в течение +35 мин при 4 ° С до прояснить нерастворимых частиц, а также сохранять надосадочной жидкости. Осадка супернатант может затем быть заморожены с использованием жидкого азота и хранят при -80 ° C, если желательный.
8. Уравновешивают и объемом 30 мл DEAE Sepharose CL-6B колонка с DEAE Буфер А, используя FPLC. Run буфер через колонку при 1-2 мл / мин с максимальным давлением из 0,2 МПа над фоне. Загрузите в свободный от клеток экстракт на колонку, и начинаться, чтобы собрать поток-через один раз OD ₂₈₀ сигнал начинает увеличиваться выше базовую линию. Промыть колонку с DEAE Буфер А, пока не OD ₂₈₀ значение возвращается к базовая линия, в то время как непрерывного сбора проточные. Поток-через должны содержать большинством белок Dps, свободное от связанной ДНК. Промыть колонку со 100%-Буфер B (50 мМ HEPES-KOH, рН +7,5, 1 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА). Этот элюат содержит Dps-ДНК комплексов, а также другие белки, и может быть отброшено.
9. Удалите объявлениемдополнительным загрязняющих белков через осаждения сульфатом аммония. Определить объем объединенный проточные. Медленно (в течение периода из 10-20 мин) добавить сухой небольшой-зерно сульфат аммония до 62%-ное насыщение (390 мг на одно мл раствора) при 4 ° С в то время как перемешивания в а также. Размешайте смесь в течение дополнительного через 20-30 мин после добавив последняя порция из сульфат аммония, чтобы обеспечить полное уравновешивания. Dps будет оставаться растворимым, в то время как загрязняющих белков будет выпадать в осадок из раствора.
10. Удалите Осажденные белки путем центрифугирования при 20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° C и сохраните надосадочной жидкости.
11. Медленно добавить дополнительный +227 мг сульфат аммония на одно мл надосадочной жидкости, чтобы достичь 94%-ное насыщение и размешайте в течение 20-30 мин, чтобы обеспечить полное уравновешивания. Dps осаждается при эта высокой концентрации соли и может быть собрана путем центрифугирования при +20000 мкг в течение 30 мин при 4 ° C. Dps будет в гранула; надосадочной жидкости может быть отброшено. В пеллетных могут быть сохранены при температуре -80 ° С, если дезIRED.
12. Ресуспендируют Dps Осадок, содержащий в ресуспендирующего буфера (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА). Отрегулируйте объему образца до 2,5 мл.
13. Буфер обменный, чтобы удалить сульфат аммония путем использования PD-10 гель-фильтрацией колонке. Уравновешивают геля кровать с 25 Накопительный Ресуспендирование мл. Примените +2,5 мл образца ДПС по сравнении с верхней части PD-10 колонке и дайте ему впитать дюйма Откажитесь от проточных-через. Собирайте Dps путем элюирования с 3,5 ресуспендирующего буфера мл.
14. Центрифугируйте буфер-обменянный образца при 16 000 мкг в течение 10 мин при 4 ° C, чтобы удалить любые нерастворимый компонентов, а также разбавить его с 6-10 мл Разбавление Буфер (50 мМ HEPES-KOH,, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА), чтобы гарантировать о том, что концентрации соли является достаточно низкими для Dps, чтобы связываются с колонкой SP Сефароза. Особенно концентрированный образцы из Dps могут стать менее растворимый при разбавлении в более низкое-солевых буфер, о чем свидетельствует полночь будет освещено из жидкости, но может быть полностью к перерастворению за счет добавлением небольшого Амунт 5 М раствором NaCl (дополнительно 10-20 мМ).
15. Уравновешивают и объемом 30 мл SP Sepharose Fast колонка Поток с С. П. Буфер А (50 мМ HEPES-KOH, рН 7,5, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА). Run буфер через колонку при 1.5-2 мл / мин с предел давления из 0,3 МПа над фоне. Загрузите в образец на колонку. Вымойте с С. П. Буфер А, пока не OD возвращается ₊₂₈₀ следа к исходному уровню, и откажитесь от проточные. Run объемом 150 мл, линейный градиент от 0 до 100 B Буфер%, в то время как собирающий +2 мл фракциях. Dps будет элюирования в острый пик при около 50% B, хотя изменение на 10% возможен.
16. Запустите элюирования фракций на в 15% SDS-PAGE гель, и проверить его на ДНК загрязнение путем измерения OD ₂₆₀ / OD ₊₂₈₀ соотношение с использованием спектрофотометра. Гель должен показана только одна полоса вокруг весом 19 кДа, а также OD ₊₂₆₀ / OD ₂₈₀ как правило, около 0,7. Бассейн чистейший Dps фракций. Используйте центробежным фильтром единица (такие, как Amicon модуля Ultra Filtration), с10K молекулярные масса не пропускаемых-офф, чтобы сконцентрироваться Dps и обменять его в емкость для хранения буфере (50 мМ HEPES-KOH, рН +7,5, 50 мМ NaCl). Аликвоты очищенного Dps и замораживание в жидком азоте для хранения при -80 ° С.

2. Assay защита ДНК

Анализ включает в себя нескольких временных-чувствительной шаги и должны быть приурочен к второе-можно получить воспроизводимые результаты. Многие ингредиенты и пипеткой шаги, используемые, так пипетирования таблице (см. таблицу 1) Желательно, чтобы отслеживать шаги и объемов. Общее время, необходимое для проведения анализа является не более чем на 3 час.

1. Измерьте +30 мл воду в воздухонепроницаемый флаконе; промыть устройство водяного с N ₂ в течение 10 мин (при использовании две шприц игл, одна в текучей среде,, одна выше оно), чтобы удалить кислород из раствора. Добавить 0,0168 г FeSO ₄ • 7H ₂ O к воде, чтобы получить 2 мМ исходный раствор. Запечатайте флакона и на одном уровне с азота в течение 5 мин больше, то смешиваются. Решение должно бытьясны;, если любой намек на желтые, поддается обнаружению, подготовить новый решением железо.
2. Сделайте 100 мМ H ₂ O ₂ раствор (+10,87 мкл 9.2MH ₂ O ₂ в 1 воду мл); держать на льду и экранированный от света путем обертывания в алюминиевую фольгу. Используйте только для около 1-2 HR после подготовки обусловлено спонтанным распадом. Фондовый перекиси водорода составляет Точно так же подвержен разрушению, которые могут быть частично смягчены путем надлежащему хранению (в темноте, при 4 ° C). Регулярные проверки фондовом концентрацию путем измерения OD ₊₂₄₀ рекомендуются.
3. Оттепель аликвоты очищенной Dps быстро водой комнатной температуры ванны, и держать на льду. Центрифугируют в течение +10 сек при 4 000 XG в picocentrifuge таблицу вершине, чтобы осадок агрегаты. Измерьте концентрация после того, как центрифугирование с использованием спектрофотометра (OD ₂₈₀ = 1,547, показало концентрации от 100 мкМ Dps мономер).
4. Развести линейной ДНК от высоких-концентрацию ценных бумаг при использовании 12x реакционном буфере (1M MOPS-KOH рН 7,0, 1 М NaCl) до концентрации из 100 нг / мкл. Линейный ДНК используется, чтобы сделать квантификация легче, но плазмида ДНК могут быть использованы, а также.
5. Пипетка 1 мкл ДНК-буфера смесь в трубку ПЦР. Добавить достаточным количеством воды, в реакционную так что, чтобы конечный объем реакция (минус ДСН) будет составлять 12 мкл. Эта сумма должна быть рассчитанный в заранее, используя пипетирования таблицей. Добавить Dps до конечной концентрации додекамера из 3 мкМ. Инкубируйте в в течение 15 мин при комнатной температуре в, чтобы позволить для Dps для привязки к ДНК.
6. Добавьте достаточно 2 мМ FeSO ₄ решение, чтобы достичь желаемой концентрации. Типичный эксперимент использует диапазон концентраций от 0 до 1 мМ FeSO _4. Более высокие концентрации приведет к более обширной деградации ДНК, но также может привести к образованию железа Осадок в реакционной смеси. Быстро добавить 1 мкл из 100 мМ H ₂ O ₂ раствор (до 10 мМ конечная концентрация), и инкубировать при комнатной температуре в в течение 5 мин, чтобы позволить Фентон-Опосредованная реакция деградации чтобы иметь место.
7. Добавить +0,8 мкл 20% SDS (сульфат натрий додецила). Тщательно перемешать, инкубировать при 85 ° C течение 5 мин для нарушить Dps-ДНК комплексов. SDS дестабилизирует Dps-ДНК сложными и предотвращает нежелательные сдвигам гель для ДНК, что улучшает легкости из количественного определения. Опциональный шагом является, чтобы остановить реакцию по каталитически унижающему достоинство перекись водорода в нетоксичные продуктах. Для в условиях, описанных в данном протоколе, эта шаг не нужен,, чтобы получения широкого и диапазон из ДНК деградацию.
8. Инкубируют на льду в течение 1 мин, добавляют загрузки краситель, и нагрузка на агарозном геле. Запустите геля, и пятна для ДНК с использованием бромид этидия. Геля должно быть окрашенных пост-электрофореза, а не до электрофореза,, чтобы предотвратить SDS от вмешательства в этидия распределением бромидом в геле.

Результаты

Процесс очистки для Dps описано здесь очень воспроизводимыми. Dps очистка в соответствии с описанными протокол, при помощи +2 L из E. палочка культуру в качестве отправной точке, будете типично уступать +2,5 мл из белком, содержащим Dps ₊₁₂ при концентрациях, между 5 и 12 мкМ. Более длинные экспериментах устанавливались время индукции (4 HR), кажется, уменьшить эту изменчивостью. Белки чистота составляет стабильно выше 99%, о чем свидетельствует помощью электрофореза в ДСН-PAGE гелей (Рисунок...

Обсуждение

Способ очистки по Dps, как описано в этой статье является очень надежным. Чистоты последовательно была высокими (> 99%); никакой другой белки не появляются на SDS-PAGE гели, как видимых полос. Несмотря на это, некоторые партии очищенного Dps, кажется, есть нуклеазная активность, о чем свидетельствует частичная деградация ДНК при инкубации с очень высокими концентрациями ДПС. Это может указывать на наличие высокоактивных ДНКаз при низкой концентрации, что мы были не в состоянии удалить через очищение. Тем не менее, эт...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
BL21(DE3)pLysS компетентные клетки	Promega	L1195
pET-17b ДНК	EMD-Millipore	69663-3
LB порошок бульона	Sigma-Aldrich	L3022
Ампициллин натриевая соль	Sigma-Aldrich	A0166
Хлорамфеникол	Sigma-Aldrich	C0378
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758
HEPES	BDH	441476L
Гидроксид калия	Merck	105033
хлорид натрия	VWR	443824T
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Набор ингибиторов протеазы III	EMD-Millipore	539134
DEAE-сефароза	Sigma-Aldrich	DFF100
Сульфат аммония	Sigma-Aldrich	A4418
PD-10 Обессоливающие колонны	GE Healthcare LS	17-0851-01
SP-Sepharose	Sigma-Aldrich	S1799
Amicon Ultra Centr. Фильтр (10K MWCO)	Миллипор	UFC901024
Сульфат железа гептагидрат	Sigma-Aldrich	F8048
Раствор перекиси водорода	Sigma-Aldrich	216763
MOPS	Calbiochem	475898
раствор SDS	Bio-Rad	161-0418
Бромид этидия	Sigma-Aldrich	E1510
Статический инкубатор	Hettich	INE500
Встряхивающий инкубатор	New Brunswick Sc.	Inova 44
Охлаждаемая центрифуга	Beckman Coulter	Avanti J-E
Настольная центрифуга	Eppendorf	5424
Cell disrupter	Constant Systems Ltd.	TS2/40/AA/
FPLC Очиститель	General Electric	AKTA
Герметичные флаконы	Cole-Parmer	EW-08918-85
Иглы для шприцев	BD	305128
пипетки	Eppendorf	Z683779-1EA, Z683795-1EA

AA