ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps) играет решающей роли в борьбе бактериальные стресс. В данной статье рассматриваются очистки E. палочка Dps и протокол, для В пробирке Анализе демонстрируя Dps-опосредованной защиту ДНК, образующую от деградации активных форм кислорода.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Окислительный стресс является неизбежной побочным продуктом аэробные жизни. Молекулярный кислород необходим для наземного метаболизм, но она также принимает участие во многих разрушительных реакции в живых организмах. Сочетание аэробного метаболизма и железа, что является еще одним жизненно важным соединением для жизни, достаточно для производства радикалов через химию Фентон и ухудшить клеточных компонентов. Деградации ДНК является, пожалуй, самым разрушительным процесс с участием внутриклеточные радикалы, как ДНК ремонт далека от тривиальными. Анализе представленные в этой статье предлагает количественные технику, чтобы измерять и визуализации эффекта молекул и ферменты на радикальных-опосредованной повреждения ДНК.
Анализе защита ДНК представляет собой простой, быстрым, и надежная инструментом для в характеристике пробирке из защитные свойства белки или химическими веществами. Она включает в себя подвергая ДНК, чтобы разрушительным реакции окислительного и добавление различными концентрациями представляющего интерес соединения. Уменьшение или увеличение из повреждение ДНК, как функцию от соединение концентрации затем визуализировал с использованием гель--электрофореза. В этой статье мы продемонстрировать технику из анализе защиту ДНК путем измерения защитных свойствах ДНК-связывающем белка из голодающих клеток (DPS). Dps представляет собой мини--ферритин, который используется более, чем на +300 бактериальный видов к мощно борьбы с экологических стрессоров. Здесь мы приводим протокол Dps очистки и оптимальных условий анализа для оценки защита ДНК от ДПС.
Введение
Аэробные организмы должны постоянно утверждаю, с реактивных видов кислорода, которые могут повредить их ДНК, а также других решающий биологический макромолекулами. Один сильнодействующий инструмент, чтобы противодействовать токсических эффектов из окислительного повреждения является ДНК-связывающими белка из голодающих клеток (Dps). С момента своего открытия в 1992 году от голода E. палочка культура 1, Дата Dps была идентифицирована в более чем 300 видов бактерий и архебактерии 2. Массивные повышающая регуляция Dps во время стационарная фаза делает его наиболее экспрессируется на высоком уровне нуклеоидом-белок, ассоциированный с из
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Dps Экспрессия и очистка
Получение белка высокой чистоты является важным первым шагом для ДНК-анализ защиты. Очисткой из белок Dps могут быть выполнены в +4 до 5 дней.
- Преобразование протеазу-дефицитный штамм из E. палочки (такие как BL21 (DE3) pLysS) с животным вектор (например, pET17), в которую Dps кодирующей белок последовательности были клонированы.
- Подряд трансформированных клетках выходят на А. Р. Лурия Бульон (LB) чашках с агаром, содержащие соответствующее антибиотики (, такие как ампициллин и хлорамфеникол для примеров, при условии в 1.1). Инкубируйте пластинами в течение ночи при 37 ° С.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Процесс очистки для Dps описано здесь очень воспроизводимыми. Dps очистка в соответствии с описанными протокол, при помощи +2 L из E. палочка культуру в качестве отправной точке, будете типично уступать +2,5 мл из белком, содержащим Dps +12 при концентрациях, между 5 и 12 мкМ. Более длинные экспериментах устанавливались время индукции (4 HR), кажется, уменьшить эту изменчивостью. Белки чистота составляет стабильно выше 99%, о чем свидетельствует помощью электрофореза в ДСН-PAGE гелей (Рисунок.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Способ очистки по Dps, как описано в этой статье является очень надежным. Чистоты последовательно была высокими (> 99%); никакой другой белки не появляются на SDS-PAGE гели, как видимых полос. Несмотря на это, некоторые партии очищенного Dps, кажется, есть нуклеазная активность, о чем свидетельствует частичная деградация ДНК при инкубации с очень высокими концентрациями ДПС. Это может указывать на наличие высокоактивных ДНКаз при низкой концентрации, что мы были не в состоянии удалить через очищение. Тем не менее, эт.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Мы никогда имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарны Микела де Мартино, Уилфред Р. Хаген и Kourosh Honarmand Ebrahimi за полезные обсуждения. Этот работа выполнена при поддержке определенный начальный уровень финансирования от Дельфтского технологического университета.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| BL21(DE3)pLysS компетентные клетки | Promega | L1195 | |
| pET-17b ДНК | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB порошок бульона | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ампициллин натриевая соль | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Хлорамфеникол | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Гидроксид калия | Merck | 105033 | |
| хлорид натрия | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Набор ингибиторов протеазы III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-сефароза | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Сульфат аммония | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Обессоливающие колонны | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Фильтр (10K MWCO) | Миллипор | UFC901024 | |
| Сульфат железа гептагидрат | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Раствор перекиси водорода | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| раствор SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Бромид этидия | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Статический инкубатор | Hettich | INE500 | |
| Встряхивающий инкубатор | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Охлаждаемая центрифуга | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Настольная центрифуга | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/ | |
| FPLC Очиститель | General Electric | AKTA | |
| Герметичные флаконы | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Иглы для шприцев | BD | 305128 | |
| пипетки | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
Ссылки
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
