Эта статья посвящена выявлению высокого уверены взаимодействия между наборами данных хозяина и возбудителем белков с использованием комбинации двух ортогональных методов: дрожжи двугибридная последующей высокой пропускной способностью анализа взаимодействия в клетках млекопитающих называют HT-GPCA.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Сравнительный подход к характеризации Пейзаж хозяин-патоген белок-белковых взаимодействий
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Значительные усилия были собраны для создания крупномасштабных всеобъемлющего белок-белковых взаимодействий карты сети. Это играет важную роль для понимания патоген-хозяин отношения и, по существу, выполняет генетические скрининги в дрожжах двух гибридных систем. Недавнее улучшение взаимодействия белок-белок обнаружения Gaussia люциферазы анализа на основе дополнения фрагмента теперь предлагает возможность развивать интегративные подходы сравнительного interactomic необходимо строго сравнить профили взаимодействия белков из различных вариантов штамма возбудителя против общий набор клеточных факторов.
Эта статья специально фокусируется на полезность объединения двух ортогональных методов для создания белок-белковые взаимодействия наборов данных: дрожжи двугибридная (Y2H) и новый анализ с высокой пропускной Gaussia принцепса белка дополнения анализа (HT-GPCA) выполняются в клетках млекопитающих. NT "> крупномасштабных идентификации ячейковых партнеров патогена протеина, в результате скрещивания на основе дрожжей двугибридная показы библиотек кДНК с использованием нескольких вариантов штамма возбудителя. подмножества взаимодействующих партнеров выбраны на высокой уверенности в себе статистические забил дальнейшего подтверждены в клетках млекопитающих для парных взаимодействий с целым набором белков патогенных вариантов использования HT-GPCA. Эта комбинация из двух взаимодополняющих методов повышения надежности взаимодействия набор данных, и позволяет выполнение строгих сравнительный анализ взаимодействия. Такой сравнительный interactomics представляют собой надежную и мощную стратегию, чтобы расшифровать любой патоген-хозяин взаимодействий.
Введение
Увеличение количества данных, собранных для генерации белок-белковое взаимодействие карты открывает перспективы для дальнейшего понимания возбудитель инфекции. В глобальном понимании возбудитель инфекции начинает появляться, он обеспечивает доступ к классам возмущений, вызванных микроорганизмами, белки при подключении протеома человека 1. Тем самым он предлагает способ понять, как патогенные манипулировать техники клетки-хозяина. В частности, отображение нескольких вирусных хозяина сетей взаимодействия показало, что вирусные белки преимущественно целевого хоста белки, которые тесно связанных в сотовой сети (концентраторы), или которые имеют решающее значен....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Дрожжи двугибридная показы
- Сделайте следующие обязательные решения:
- Полное Синтетические Из падения (SD): растворите 26,7 г минимальную базу SD с глюкозой в 1 л воды. Добавляют 2 г смеси аминокислот получали следующим образом: 2 г аденин гемисульфат, 2 г аргинина HCl, 2 г Гистидин HCl, 2 г изолейцин, лейцин 4 г, 2 г лизин HCl, 2 г метионин, фенилаланин 3 г, 2 г L -серин, 2 г L-треонин, триптофан 3 г, 2 г тирозин, 1,2 г урацил, 9 г Валин.
- Селективный отпадают SD-L/-W/-H: SD, содержащий все незаменимые аминокислоты, кроме указанных (-L:-лейцин;-W:-триптофан;-H:-гистидин).
- YPGL....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Одним из основных преимуществ HT-GPCA заключается в его высокой чувствительности, о чем свидетельствуют оценки ложноположительных и ложноотрицательных результатов для белка ВПЧ E2 на рисунке 2 (адаптировано из ссылки 13). Чтобы определить уровень ложных отрицательных, известных взаимодействиях E2 от ВПЧ-16 были оценены HT-GPCA (рис. 2А). Четыре из 18 взаимодействия не были восстановлены (соответствующий 22% уровень ложных отрицательных). Ложных положительных взаимодействий были измерены.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Независимо, дрожжи-два гибридных и млекопитающих взаимодействия анализы, такие как GST выпадающие, Люмьер или MAPPIT, зарекомендовали себя как эффективный инструмент для выявления белок-белковых взаимодействий, но ограничены высокий уровень ложно-положительных и ложно-отрицательных взаимодействий, связанных с этими методами 15. Кроме того, данные растет, что объединение ортогональных методов повышает достоверность полученных взаимодействием данных 7. Недавнее развитие HT-GPCA методику, описанную зд.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была частично поддержана финансирование от Института Пастера и грантов от Ligue Nationale Contre Le Рак (гранты R05/75-129 и RS07/75-75), Ассоциация Pour La Recherche сюр-ле-Рака (гранты ARC A09 / 1/5031 и 4867) и Национальное агентство La Recherche (ANR07 MIME-009 02 и 026 ANR09 MIEN 01). ММ был получателем стипендии MENRT.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Штаммы дрожжей | Clontech | ||
| Minimal SD База | США биологическая | D9500 | |
| Аминокислоты | Sigma | ||
| 3-амино-1,2,4-триазол (3-AT) | Acros organics | 264571000 | |
| Zymolaза | Seikagaku | 120491 | |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 31966 | |
| Фетальная бычья сыворотка | BioWest | S1810 | |
| Фосфатный буфер физиологического раствора (PBS) | Gibco-Life Technologies | 14190 | |
| Пенициллин-стрептомицин | Gibco-Life Technologies | 15140 | |
| Трипсин-ЭДТА | Gibco-Life Technologies | 25300 | |
| Анализ на люциферазу Рениллы | Promega | E2820 | |
| Белый планшет для культуры | Greiner Bio-One | 655083 | |
| 96-луночных планшетов для ПЦР | 4titude | 4t-i0730/C | |
| Инкубатор (30° C) | Инкубатор Memmert | ||
| (37 &dg; C) | Люминометр Heraeus | ||
| Berthold | Centro XS-LB 960 |
Ссылки
- Davey, N. E., Trave, G., Gibson, T. J. How viruses hijack cell regulation. Trends in Biochemical Sciences. 36, 159-169 (2011).
- Calderwood, M. A. Epstein-Barr virus and virus human protein interaction maps. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7606-7611 (2007).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
