Методическая статья

Восстановление Kv канала в липидные мембраны для Структурно-функциональные исследования

19.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50436

⸱

13 июля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Процедуры для полного восстановления прототип напряжения закрытого калиевых каналов в липидных мембран описаны. Восстановленные каналы подходят для биохимических анализов, электрические записи, лиганд скрининга и электронно исследования кристаллографических. Эти методы могут иметь общего применения в структурных и функциональных исследований других мембранных белков.

Аннотация

Для изучения липид-белковых взаимодействий в редукционистский моды, необходимо включить мембранных белков в мембранах четко определенных липидной композиции. Мы изучаем липидов зависит эффект стробирования в прототипе напряжения закрытого калия (кВ) канал и разработали подробные процедуры для восстановления каналов в различных системах мембраны. Наши процедуры восстановления принимать рассмотрение как моющее средство индуцированного слияния пузырьков и слитый белок / детергент мицеллы с липидной / детергент смешанные мицеллы, а также важность достижения равновесного распределения липидов у белка / детергент / липид и моющего средства / липид смешанные мицеллы. Наши данные свидетельствуют о том, что введение каналов в липидных везикул относительно случайной ориентации, а также восстановление эффективность настолько высока, что нет обнаруживаемых совокупностей белка были замечены в фракционирование экспериментов. Мы использовали восстановитьд каналов для определения конформационных состояний каналов в различных липидов записи электрических деятельности небольшим количеством каналов включены в плоских липидных бислоев, экран конформационно-специфических лигандов из пептидных фаговых дисплеев, библиотеку и поддерживать рост кристаллов 2D каналов в мембранах. Восстановление процедуры, описанные здесь, могут быть адаптированы для изучения других мембранных белков в липидных двойных слоев, особенно для исследования липидов действие на эукариотические напряжения закрытого ионных каналов.

Введение

Клетки обмена материалами и информацией с окружающей средой через функции специфических белков мембраны 1. Мембранные белки в клеточных мембранах функционировать как насосы, каналы, рецепторы, ферменты внутримембранных, линкеры и структурные сторонников через мембраны. Мутации, которые влияют на мембранные белки были связаны со многими заболеваниями человека. В самом деле, многие мембранные белки были основными целями наркотиков, потому что они важны и легко доступны в клеточных мембранах. Поэтому очень важно понимать структуру и функцию различных мембранных белков в мембранах, и делают возможным разработать новые методы, чтобы облегчить вредных эффектов о....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Экспрессия и очистка KvAP канала (рис. 1)

  1. Подготовительные работы - день 0
    1. Промыть стекло колбы для бактериальной культуры деионизированной водой (DIH 2 O) и MilliQ Н 2 О (MQH 2 O), чтобы удалить следы моющего средства из общих мытья посуды.
    2. Автоклав 1000 мл LB среды в 2,8 л колбы Эрленмейера (всего двухлитровым культуру за образец здесь). Низкая жесткость воды было установлено, что важно для успешного культуры трансформированных бактерий.
    3. Автоклав 100 мл LB среды в 500 мл колбах
    4. Преобразование 60 мкл XL1-синий компетентных клеток с 200 нг pQE60 плазмиду, содержащую ген KvAP с сайто....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Общий поток экспериментов для очистки KvAP канал в биохимические однородность описано на фиг.1А. Типичные образцы во время экспрессии и очистки белка показаны в ДСН-ПААГ-гель в фиг.1В. Белка после очистки IMAC является относительно чистым. Выход канала KvAP составляет примерно 1,0 мг / литр культуры.

Солюбилизация липидных везикул с моющими средствами должны быть разработаны для каждой пары липидов против моющего средства. Солюбилизации небольшие однослойные.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Восстановление KvAP каналов в различных мембран был использован в нескольких исследованиях 8-10. Следуя идее обеспечения распределение липидов между моющего средства / смешанные мицеллы липидов и белков / моющее средство / липидного смешанные мицеллы, мы способны достичь почти полного восстановления KvAP в мембраны сделаны из очень различных липидов. Каждый канал тетрамерная KvAP нуждается ~ 100 молекул липидов, чтобы полностью покрыть ее трансмембранного домена. Существенным требованием является, чтобы обесп.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Исследования по KvAP в Цзян лаборатории получили значительную помощь от лаборатории доктора Родерик МакКиннон автора в Университете Рокфеллера. Особая благодарность доктору Kathlynn Браун и Майкл McQuire за их советы и помощь в нашей фага экране экспериментов. Работа выполнена при поддержке грантов от NIH (GM088745 и GM093271 к Q-XJ) и AHA (12IRG9400019 к Q-XJ).

....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ТриптонРПИ Корп.T60060
Дрожжевой экстрактRPI Corp.Y20020
NaClFisherS271-3
Tris BaseRPI Corp.T60040
Хлорид калияFisherBP366-500
n-Dodecyl-β-D-MaltosideAffymetrixD322SSol-grade
n-Octyl-β-D-глюкозид AffymetrixO311Ana-grade
AprotininRPI Corp.A20550-0.05
ЛойпептинRPI Corp.L22035-0.025
Пепстатин АRPI Corp.P30100-0.025
PMSFSIGMAP7626
Dnase iRoche13407000
Био-Бисер SM-2Био-Рад152-3920
HEPESRPI Corp.H75030
POPEAvanti Polar Lipids850757C
POPGAvanti Polar Lipids840457C
DOGSAvanti Polar Lipids870314C
DMPC Avanti Polar Lipids850345C
Biotin-DOPE Avanti Polar Lipids870282C
DOTAPAvanti Polar Lipids890890C
NeutrAvidin agarose beads Piercenet29200
Dialysis TubingSpectrum Laboratories, Inc132-570
PentaneFisherR399-1
DecaneTCI AmericaD0011
MTS-PEG5000Toronto Research CemicalsM266501

Ссылки

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 5th edition, Galand Science. New York. (2007).
  2. Lee, A. G. How lipids and proteins interact in a membrane: a molecular approach. Mol. Biosyst. 1, 203(2005).
  3. Lee, A. G.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

K

Похожие статьи