Методическая статья

RNAi-опосредованной Двухместный Нокдаун гена и вкусовые восприятия измерений в медоносных пчел (

14.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50446

⸱

25 июля 2013 г.

 ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University , 2Department of Chemistry, Biotechnology, and Food Science, Norwegian University of Life Sciences

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе, мы описываем две стратегии, которые одновременно подавляют два гена (двойной нокдаун гена) в медоносных пчел. Затем мы представляем, как использовать хоботком ответ расширения (PER) анализа для изучения влияния двойного нокдауна гена на пчелиный мед вкусового восприятия.

Аннотация

Это видео демонстрирует роман метода РНК-интерференции (РНК-интерференции), которые подавляют двух генов одновременно в медоносных пчел использованием двухцепочечной РНК (дцРНК) инъекций. В нем также представлены протокол хоботка расширение ответа (PER) анализа для измерения вкусового восприятия.

RNAi-опосредованной генной нокдаун является эффективным методом понижающей регуляции экспрессию гена-мишени. Этот метод обычно используется для одной манипуляции генов, но он имеет свои ограничения для обнаружения взаимодействия и совместные эффекты между генами. В первой части этого видео, мы представляем две стратегии одновременно сбить двух генов (так называемый двойной нокдаун гена). Мы покажем, как стратегии способны эффективно подавлять двух генов, вителлогенин (VG) и ultraspiracle (USP), которые находятся в нормативных обратной связи. Этот двойной подход нокдауна гена может быть использовано, чтобы анализировать взаимосвязи между генами и могут легко применяться вразличных видов насекомых.

Вторая часть этого видео является демонстрацией хоботка расширение ответа (PER) в анализе медоносных пчел после обработки двойного нокдауна гена. На анализ является стандартным тестом для измерения вкусового восприятия в мед пчелы, которая является ключевым предиктором как быстро поведенческих созревания меда пчелы есть. Большой вкусового восприятия гнезда пчел указывает на повышенный поведенческое развитие, которое часто связано с более ранним возрастом начала кормления и кормления специализации в пыльце. Кроме того, на анализ может быть применен для идентификации метаболического состояния сытости или голода в медоносных пчел. Наконец, на анализ в сочетании со спариванием различных стимулов для кондиционирования запахом пчел также широко используется для обучения и памяти в исследования медоносных пчел.

Введение

Интерференции РНК (RNAi) представляет собой РНК на основе пост-транскрипционный генов, которое происходит в различных эукариотических организмов. Процесс РНК-интерференции вызваны эндогенными или экзогенными двухцепочечной РНК (дцРНК) прекурсоров. ДсРНК активирует рибонуклеазы Dicer белок, который связывает и расщепляет дсРНК к небольшим фрагментам (20-25 б.п.). Затем небольшие фрагменты направляющей дцРНК признание и расщепление дополнительный мРНК по Argonaute белки, каталитический компонент РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC) 1. У млекопитающих дцРНК длиннее 30 нуклеотидов, активирует противовирусный ответ (интерферон ответ IFN), что приводит к неспецифической деградации РНК-транскрипты 2. Однако длинные дцРНК доказали свою эффективность и конкретные насекомых, поскольку существует недостаток этого IFN 3.

Длинные дцРНК были использованы для понижающей регуляции генов-мишеней в различных видов насекомых. Медоносные пчелы являются одним из пионовEER организмов насекомых, в котором функции многих важных генов в развитии и поведении были выявлены с помощью дсРНК 4,5. Несколько доставки дсРНК методов были проведены в медоносных пчел: дсРНК кормления эффективно подавляет экспрессию гена-мишени в меде 6 личинок пчел, тогда как дсРНК инъекций является эффективным подходом для генной нокдаун в мед пчелы эмбрионов 4 и взрослых пчел 7,8.

Нокдаун гена выставлены эффекты, применяя дсРНК для насекомых являются преходящими и локализованными. Исследования показали, что обе инъекции дсРНК брюшной и грудной инъекции дсРНК эффективно подавляют экспрессию гена-мишени в клетках жира в брюшной полости тела насекомых 9,10. ДсРНК вводится в брюшной и грудной полостей и жировые клетки тела в состоянии взять на себя дсРНК из гемолимфы, где клетки купаются 10. Однако гены в других органах, таких как мозг и яичников, не могут быть направлены либобрюшной полости или грудной инъекций. В целях выявления генов в мозге пчелы мед, мозг инъекцию дсРНК также была выполнена, которая эффективно воздействует на экспрессию гена-мишени в локальных областях мозга 11. Здесь мы единственный документ уколами дсРНК который чаще используется в взрослые пчелы.

РНК-интерференции была в первую очередь используется для целевого одного гена и был мощным инструментом, чтобы выявить функции гена. Тем не менее, любой ген не изолирована от других, она находится в сложных регуляторных сетей. Ключом к пониманию биологического процесса является рассекать как гены взаимодействуют друг с другом, что требует одновременного манипуляции нескольких генов, а не одного нокдаун гена. В линии клеток млекопитающих, ученые добились успеха в одновременном ингибировании двух или трех генов с помощью систем доставки 12 или нескольких микроРНК (микроРНК) шпильки конструкции 13. Но у насекомых, несколько нокдаунов гена еще не проверены. Здесь мы Presenт различных стратегий для инъекций, которые могут достичь двойного нокдауна гена. Мы целевой двух генов: вителлогенина (VG), который кодирует предшественник белка желток и ultraspiracle (USP), который кодирует предполагаемый рецептор для ювенильного гормона (JH) и может служить в качестве транскрипционного фактора посредническую ответов на JH 14 в пчелам. В.Г., JH регулируют друг друга в цепи обратной связи 15 и участвуют в мед пчелы регуляции поведения 9. Использование двойного нокдауна гена, Возмутим как В.Г., JH путей, и узнать, как они оказывают совокупное воздействие меда пчелы поведение и физиологию и как В.Г., USP и JH взаимодействуют 9.

Вкусовое восприятие поведенческих предиктором пчелиного меда социальное поведение 16. С точки зрения поведенческого развития, гнезда пчел с высокой вкусового восприятия поведенчески зрелых быстро, и, как правило корма в раннем возрасте и предпочитают собирать пыльцу 16,17. Хотя нормативные мechanisms вкусового восприятия, лежащие в основе по-прежнему неясны, исследования показали, что вкусовое восприятие связано с внутренним метаболизмом энергии 9, 18,19 гормональной секреции и биогенетическая амина путей, 20. Оба В.Г., JH важных гормональных регуляторов модуляции 7,21 вкусового восприятия. В лаборатории, изменение вкусового восприятия в медоносных пчел может быть оценена тестированием хоботком ответа абонента (PER) для различных решений сахарозы. Каждая пчела проверяется прикосновения обе антенны ее с каплей воды, а затем восходящей серии концентрации 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% сахарозы. Положительный ответ Отмечается, если пчелы полностью протягивает хобот, когда капли воды или сахароза касанием для каждой антенны. На основе количества положительных ответов на решения, вкусовые уровень восприятия каждого отдельного может быть определена 16. Тем не менее, применение PER не ограничивается измерения гustatory восприятия. PER также является эффективным методом для проверки метаболическое состояние пчел, таких как насыщение против голода. Пчелы с большей ответов на сахарозу голоднее в целом (Wang и Amdam, неопубликованные данные). Кроме того, PER парадигма также может быть использован в ассоциативных обучения и памяти у пчел. В этом случае пчелы будут обучаться связать присутствии сахарозы воду с запахом. Когда пчелы узнать ассоциации, только наличие запах может вызывать положительный ответ хобот без награждение их с сахарозой 22,23. В этом видео мы покажем, как выполнить за одну оценить вкусовые восприятия, которое было связано с В.Г. и USP двойной нокдаун в предыдущем исследовании 9.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Часть 1: RNAi-опосредованной двойной нокдаун гена

1. Синтез дсРНК

  1. Дизайн праймеров дтРНК таргетинга В.Г., USP и управления кодированием ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который не находится в геном медоносной пчелы: праймеры были разработаны с использованием свободного программного обеспечения онлайн Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
  2. дсРНК синтеза для В.Г., USP и GFP: использование RiboMax Т7 РНК-производственной системы от Promega для в пробирке транскрипции.
  3. дсРНК очистки:
    1. Денатурации и ренатурацию: тепло дсРНК до 85 ° С в течение 5 мин и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 1 часа.
    2. Я ДНКаза лечения: Добавить 1 мкл ДНКазы I в каждую реакционную дсРНК и смешивать их, щелкая труб. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
    3. Добавить 150 мкл нуклеазы без воды и 750 мкл TRIzol - LS в каждую реакцию, и осторожно перемешать их инвerting трубки. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при 30 ° С.
    4. Добавить 200 мкл хлороформа в каждом образце. Смешайте энергично в течение 20 сек. Центрифуга образцов в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С.
    5. Передача супернатант фазы в каждой новой трубки и добавляют 500 мкл изопропилового спирта в каждую пробирку. Смешайте их путем обращения трубки. Инкубируют смесь в течение 20 мин при -20 ° С. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 х г при 4 ° С.
    6. Удалить супернатант и использовать 1000 мкл 75% этанола мыть гранул. После центрифугирования пробирку в течение 5 мин при 7500 мкг при 4 ° С, воздух сухой дсРНК гранул, а также использовать нуклеазы свободной воды, чтобы растворить гранулы. Для обеспечения эффективности генной понижающая регуляция, концентрация дцРНК должна быть около 9 -10 мкг / мкл.

2. дсРНК уколами

Для двойного нокдауна гена, есть две стратегии: 1) одна инъекция: смешайте дсРНК двух генов и Injeкарат смеси; 2) двухдневный инъекций: вводят первое дцРНК ориентации одного гена в первый день, и вводят вторую дцРНК, в то же пчел на второй день.

  1. Холод вновь возникших пчел в холодильнике 4 ° С в течение 1-2 мин. Когда пчелы обездвижены, смонтировать 3-4 пчел параллельно на чашки Петри полны твердой воска с насекомыми контакты пересек между их животами и thoraces.
  2. Охладите пчелы снова в холодильник 4 ° C. Убедитесь, что пчелы совершенно неподвижными. Она занимает около 1-2 мин. Пчелы должны выглядеть свободными. Если пчелы коробиться или искаженным, значит, они охлаждаются слишком долго, которых следует избегать. Охлаждение слишком много причин высокой смертности, но полной иммобилизации важно, так как любое движение увеличивает размер раны и смертности.
  3. Положите одноразовые иглы 30 G (BD) на шприце Hamilton микро. Возьмите 3 мкл дсРНК и убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха в шприце. Игла вставлена ​​в части брюшной полости, чтобы избежать дамаГинг внутренних органов. Нажмите на поршень шприца медленно, чтобы дсРНК быть поглощенным. Поскольку дцРНК очень вязкий, он занимает 2-3 секунд, чтобы быть полностью исключен из шприца. После полного нажатия ныряльщика, оставьте иглу в ране в течение 4-5 сек. Соблюдайте пчел в течение 3-5 сек после инъекции. Если гемолимфой капли утечки из раны, отказаться от пчелы.
  4. Используйте разные цвета, чтобы отметить их thoraces соответствующей различных методов лечения. В этот момент, если один впрыск топлива был использован, пчелы могут быть помещены обратно в колонию через 1 час наблюдения. Однако, если два дня инъекции стратегии был использован после инъекции с первой дцРНК, пчелы должны быть помещены в клетку сетки цилиндра с медом поставляется на стороне, и храниться в инкубаторе при 34 ° C и относительной влажности 80% .
  5. На второй день, выполните шаги 2.2 и 2.3, чтобы охладить пчел в сетчатых клетках и смонтировать их на восковых пластин. Выполнение инъекции со вторым дцРНК, как это descriкровать в шаге 2.4.
  6. Пусть пчелы восстановиться при комнатной температуре в течение 1 часа и ввести их в колонии.

Примечание: нокдаун эффекты могут быть обнаружены с помощью количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR) и вестерн-блоттинга. В общем, нокдаун эффективность варьируется и зависит от многих факторов. В нашем исследовании двойного нокдауна гена могут быть обнаружены 7 дней после однократной инъекции и двухдневные инъекций.

Часть 2: хоботок Расширение ответ (PER) анализа

1. Сбор пчел из улья

На 6 день после инъекций, собирать обработанных пчел из колонии без использования курильщика. Сбор пчел в металлических клетках сетки цилиндра. Держите 3 пчел в каждой клетке.

2. Монтаж пчел PER

Охладить пчел при 4 ° С, пока не будут полностью заблокирован. Установите каждая пчела вертикально в пластиковую трубку специально разработан для ПЕР. Держите живот внутрь трубки Усинг два небольших кусочка ленты и держать голову, торчащий из трубы. Положите трубку на стойку с двумя рядами небольших пластиковых колонн, и назначить каждой трубки (БИ) с идентификационным номером. Затем положить рассматриваться пчел на стеллажах в инкубатор (34 ° C и 80% влажности) и держать их в инкубаторе в течение 2 часов.

3. Подготовка серии растворов сахарозы воды

Подготовьте 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% и 30% растворы сахарозы воды и загрузить решений в шприцы с иглами 15-20 G.

4. На анализ

Сенсорный антенна пчелы с каплей 0% раствора (воды), а затем 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% и 30% растворы сахарозы воды. Проверьте все пчелы водой первого и позволяют не менее двух минут, как интервал между каждым раствор. Таким образом, мы, как правило, не менее 20 пчел для каждого испытания. Если пчелы полностью протягивает хобот, положительный ответ засчитывается.

5.Управление данными

Подсчитывать общую положительных ответов для каждой отдельной для вкусовых Оценка ответа (GRS). Выполните соответствующий статистический анализ данных.

Часть 3. Проверка нокдаун гена

Жир тела расчленены из другого набора 7-дневных обрабатывают пчел. Стандарт триазол процедура используется для экстракции РНК, за которым следует обработка ДНКазой I 24. Vg и USP экспрессии гена анализируют с помощью двухступенчатого QRT-PCR. Актина используется в качестве опорного ген, поскольку он имеет стабильную выражений в различных тканях медоносных пчел. Опубликованные в реальном времени ПЦР-праймеров для VG и USP гена использовали в этом эксперименте 24. Данные анализируют с использованием дельта-дельта КТ метод 25.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как единичные впрыском и двухдневные впрыском стратегии значительно снижается В.Г. (односторонний ANOVA, p <0,001) (рис. 2а) и USP (односторонний ANOVA, p <0,001) (рис. 2В) уровни транскриптов в медоносных пчел шесть дней после дцРНК вводили. Подавление стенограмму USP с помощью одной инъекции смеси дсРНК и двухдневные инъекции с В. Г. первым и вторым USP (VG / USP) был значительно ниже, чем в двухдневный инъекций USP ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Наше исследование является первой попыткой одновременно сбить два гена у взрослых насекомых. Наши результаты показывают, что две стратегии дцРНК инъекций (одной инъекции и двухдневный инъекций) являются эффективными для двойной подавление гена, и одновременное глушителей гена В.Г. и USP может быть проверена 6 дней после инъекции дцРНК в пчелами 8,9. Тем не менее, эффективность нокдаун гена различна в разных видов насекомых в зависимости от уровня транскрипта гена-мишени, уровень белка дсРНК ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Эрин Fennern для оказания помощи эксперимента. Эта работа финансировалась Исследовательским советом Норвегии (180504, 185306 и 191699), Пью Благотворительный фонд и Национальный институт по проблемам старения (NIA AG22500 P01).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Бусины GE Healthcare для ПЦР в 96-луночном планшетеGE Healthcare27-9557-01
QIAquick набор для очистки ПЦРQiagen28104
RiboMax T7 Система производства РНКPromegaP1300
Trizol LSInvitrogen10296028
Хлороформ:Изоамиловый спирт 24:1Sigma-AldrichC0549
изопропиловый спиртSigma-AldrichI9516
Микрошприц HamiltonHamilton80301
30G BD одноразовые иглыBD Biosciences305106
СахарозаSigma-Aldrich84097
1 мл ШприцBD Biosciences30960
Стереодиссекционный микроскопLeica MicrosystemsS6D
Булавки от насекомыхFine Science Tools26000-25
Восковая пластина

Ссылки

  1. Okamura, K., Ishizuka, A., Siomi, H., Siomi, M. C. Distinct roles for Argonaute proteins in small RNA-directed RNA cleavage pathways. Genes Dev. 18, 1655-1666 (2004).
  2. Shi, Y. Mammalian RNAi for the masses. Trends Genet. 19, 9-12 (2003).
  3. Huvenne, H., Smagghe, G. Mechanisms of dsRNA uptake in insects and potential of RNAi for pest control: a review. J. Insect Physiol. 56, 227-235 (2010).
  4. Beye, M., Hartel, S., Hagen, A., Hasselmann, M., Omholt, S. W. Specific developmental gene silencing in the honey bee using a homeobox motif. Insect Mol. Biol. 11, 527-532 (2002).
  5. Amdam, G. V., Simoes, Z. L., Guidugli, K. R., Norberg, K., Omholt, S. W. Disruption of vitellogenin gene function in adult honeybees by intra-abdominal injection of double-stranded RNA. BMC Biotechnol. 3, 1(2003).
  6. Patel, A. The making of a queen: TOR pathway governs diphenic caste development. PLoS ONE. 6, e509(2007).
  7. Amdam, G. V., Norberg, K., Page, R. E., Erber, J., Scheiner, R. Downregulation of vitellogenin gene activity increases the gustatory responsiveness of honey bee workers (Apis mellifera). Behav. Brain Res. 169, 201-205 (2006).
  8. Wang, Y., et al. Down-regulation of honey bee IRS gene biases behavior toward food rich in protein. PLoS Genet. 6, e1000896(2010).
  9. Wang, Y., Brent, C. S., Fennern, E., Amdam, G. V. Gustatory perception and fat body energy metabolism are jointly affected by vitellogenin and juvenile hormone in honey bees. PLoS Genet. 8, e1002779(2012).
  10. Luna, B. M., Juhn, J., James, A. A. Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos. J. Vis. Exp. (5), e215(2007).
  11. Mussig, L., et al. Acute disruption of the NMDA receptor subunit NR1 in the honeybee brain selectively impairs memory formation. J. Neurosci. 30, 7817-7825 (2010).
  12. Stove, V., Smits, K., Naessens, E., Plum, J., Verhasselt, B. Multiple gene knock-down by a single lentiviral vector expressing an array of short hairpin RNAs. Electron J. Biotechnol. 19, 13(2006).
  13. Sun, D., Melegari, M., Sridhar, S., Rogler, C. E., Zhu, L. Multi-miRNA hairpin method that improves gene knockdown efficiency and provides linked multi-gene knockdown. Biotech. 41, 59-63 (2006).
  14. Ament, S. A., et al. The transcription factor ultraspiracle influences honey bee social behavior and behavior-related gene expression. PLoS Genet. 8, e1002596(2012).
  15. Amdam, G. V., Omholt, S. W. The hive bee to forager transition in honeybee colonies: the double repressor hypothesis. J. Theor. Biol. 223, 451-464 (2003).
  16. Pankiw, T., Page, R. E. Response thresholds to sucrose predict foraging division of labor in honeybees. Behav. Ecol. Sociobiol. 47, 265-267 (2000).
  17. Pankiw, T., Nelson, M., Page, R. E., Fondrk, M. K. The communal crop: modulation of sucrose response thresholds of pre-foraging honey bees with incoming nectar quality. Behav. Ecol. Sociobiol. 55, 286-292 (2004).
  18. Jaycox, E. R. Behavioral Changes in Worker Honey Bees (Apis mellifera L.) after Injection with Synthetic Juvenile Hormone (Hymenoptera: Apidae). J. Kan. Entomol. Soc. 49, 165-170 (1976).
  19. Jaycox, E. R., Skowronek, W., Guynn, G. Behavioral changes in worker honey bees (Apis mellifera) induced by injections of a juvenile hormone mimic. Ann. Entomol. Soc. Am. 67, 529-534 (1974).
  20. Scheiner, R., Pluckhahn, S., Oney, B., Blenau, W., Erber, J. Behavioural pharmacology of octopamine, tyramine and dopamine in honey bees. Behav. Brain Res. 136, 545-553 (2002).
  21. Robinson, G. E. Effects of a juvenile hormone analogue on honey bee foraging behaviour and alarm pheromone production. J. Insect. Physiol. , 277-282 (1985).
  22. Giurfa, M., Malun, D. Associative mechanosensory conditioning of the proboscis extension reflex in honeybees. Lear Memory. 11, 294-302 (2004).
  23. Scheiner, R., Page, R. E., Erber, J. The effects of genotype, foraging role, and sucrose responsiveness on the tactile learning performance of honey bees (Apis mellifera L.). Neurobiol. Learn Mem. 76, 138-150 (2001).
  24. Wang, Y., et al. PDK1 and HR46 gene homologs tie social behavior to ovary signals. PLoS ONE. 4, e4899(2009).
  25. Wang, Y., et al. Regulation of behaviorally associated gene networks in worker honey bee ovaries. J. Exp. Biology. 215, 124-134 (2012).
  26. Amdam, G. V., Csondes, A., Fondrk, M. K., Page, R. E. Complex social behaviour derived from maternal reproductive traits. Nature. 439, 76-78 (2006).
  27. Amdam, G. V., Ihle, K. E., Page, R. E. Hormones, Brain and Behavio. Pfaff, D., et al. , Elsevier Academic Press. (2009).
  28. Guidugli, K. R., et al. Vitellogenin regulates hormonal dynamics in the worker caste of a eusocial insect. FEBS Letters. 579, 4961-4965 (2005).
  29. Corona, M. juvenile hormone, insulin signaling, and queen honey bee longevity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7128-7133 (2007).
  30. Sinha, S., Ling, X., Whitfield, C. W., Zhai, C., Robinson, G. E. Genome scan for cis-regulatory DNA motifs associated with social behavior in honey bees. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 16352-16357 (2006).
  31. Amdam, G. V., et al. Hormonal control of the yolk precursor vitellogenin regulates immune function and longevity in honeybees. Exp. Gerontol. 39, 767-773 (2004).
  32. Wang, Q. C., Nie, Q. H., Feng, Z. H. RNA interference: antiviral weapon and beyond. World J. Gastroenterol. 9, 1657-1661 (2003).
  33. Carmell, M. A., Xuan, Z., Zhang, M. Q., Hannon, G. J. The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2733-2742 (2002).
  34. Hunt, G. J. Behavioral genomics of honeybee foraging and nest defense. Naturwissenschaften. 94, 247-267 (2007).
  35. Pankiw, T., Waddington, K. D., Page, R. E. Modulation of sucrose response thresholds in honey bees (Apis mellifera L.): influence of genotype, feeding, and foraging experience. J. Comp. Physiol. A. 187, 293-301 (2001).
  36. Pankiw, T., Page, R. E. Effect of pheromones, hormones, and handling on sucrose response thresholds of honey bees (Apis mellifera L.). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens. Neural. Behav. Physiol. 189, 675-684 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи