Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

В этом протоколе, мы описываем две стратегии, которые одновременно подавляют два гена (двойной нокдаун гена) в медоносных пчел. Затем мы представляем, как использовать хоботком ответ расширения (PER) анализа для изучения влияния двойного нокдауна гена на пчелиный мед вкусового восприятия.

Abstract

Это видео демонстрирует роман метода РНК-интерференции (РНК-интерференции), которые подавляют двух генов одновременно в медоносных пчел использованием двухцепочечной РНК (дцРНК) инъекций. В нем также представлены протокол хоботка расширение ответа (PER) анализа для измерения вкусового восприятия.

RNAi-опосредованной генной нокдаун является эффективным методом понижающей регуляции экспрессию гена-мишени. Этот метод обычно используется для одной манипуляции генов, но он имеет свои ограничения для обнаружения взаимодействия и совместные эффекты между генами. В первой части этого видео, мы представляем две стратегии одновременно сбить двух генов (так называемый двойной нокдаун гена). Мы покажем, как стратегии способны эффективно подавлять двух генов, вителлогенин (VG) и ultraspiracle (USP), которые находятся в нормативных обратной связи. Этот двойной подход нокдауна гена может быть использовано, чтобы анализировать взаимосвязи между генами и могут легко применяться вразличных видов насекомых.

Вторая часть этого видео является демонстрацией хоботка расширение ответа (PER) в анализе медоносных пчел после обработки двойного нокдауна гена. На анализ является стандартным тестом для измерения вкусового восприятия в мед пчелы, которая является ключевым предиктором как быстро поведенческих созревания меда пчелы есть. Большой вкусового восприятия гнезда пчел указывает на повышенный поведенческое развитие, которое часто связано с более ранним возрастом начала кормления и кормления специализации в пыльце. Кроме того, на анализ может быть применен для идентификации метаболического состояния сытости или голода в медоносных пчел. Наконец, на анализ в сочетании со спариванием различных стимулов для кондиционирования запахом пчел также широко используется для обучения и памяти в исследования медоносных пчел.

Introduction

Интерференции РНК (RNAi) представляет собой РНК на основе пост-транскрипционный генов, которое происходит в различных эукариотических организмов. Процесс РНК-интерференции вызваны эндогенными или экзогенными двухцепочечной РНК (дцРНК) прекурсоров. ДсРНК активирует рибонуклеазы Dicer белок, который связывает и расщепляет дсРНК к небольшим фрагментам (20-25 б.п.). Затем небольшие фрагменты направляющей дцРНК признание и расщепление дополнительный мРНК по Argonaute белки, каталитический компонент РНК-индуцированного глушителей комплекса (RISC) ^1. У млекопитающих дцРНК длиннее 30 нуклеотидов, активирует противовирусный ответ (интерферон ответ IFN), что приводит к неспецифической деградации РНК-транскрипты ^2. Однако длинные дцРНК доказали свою эффективность и конкретные насекомых, поскольку существует недостаток этого IFN ^3.

Длинные дцРНК были использованы для понижающей регуляции генов-мишеней в различных видов насекомых. Медоносные пчелы являются одним из пионовEER организмов насекомых, в котором функции многих важных генов в развитии и поведении были выявлены с помощью дсРНК ^4,5. Несколько доставки дсРНК методов были проведены в медоносных пчел: дсРНК кормления эффективно подавляет экспрессию гена-мишени в меде ⁶ личинок пчел, тогда как дсРНК инъекций является эффективным подходом для генной нокдаун в мед пчелы эмбрионов ⁴ и взрослых пчел ^7,8.

Нокдаун гена выставлены эффекты, применяя дсРНК для насекомых являются преходящими и локализованными. Исследования показали, что обе инъекции дсРНК брюшной и грудной инъекции дсРНК эффективно подавляют экспрессию гена-мишени в клетках жира в брюшной полости тела насекомых ^9,10. ДсРНК вводится в брюшной и грудной полостей и жировые клетки тела в состоянии взять на себя дсРНК из гемолимфы, где клетки купаются ^10. Однако гены в других органах, таких как мозг и яичников, не могут быть направлены либобрюшной полости или грудной инъекций. В целях выявления генов в мозге пчелы мед, мозг инъекцию дсРНК также была выполнена, которая эффективно воздействует на экспрессию гена-мишени в локальных областях мозга ^11. Здесь мы единственный документ уколами дсРНК который чаще используется в взрослые пчелы.

РНК-интерференции была в первую очередь используется для целевого одного гена и был мощным инструментом, чтобы выявить функции гена. Тем не менее, любой ген не изолирована от других, она находится в сложных регуляторных сетей. Ключом к пониманию биологического процесса является рассекать как гены взаимодействуют друг с другом, что требует одновременного манипуляции нескольких генов, а не одного нокдаун гена. В линии клеток млекопитающих, ученые добились успеха в одновременном ингибировании двух или трех генов с помощью систем доставки ¹² или нескольких микроРНК (микроРНК) шпильки конструкции ^13. Но у насекомых, несколько нокдаунов гена еще не проверены. Здесь мы Presenт различных стратегий для инъекций, которые могут достичь двойного нокдауна гена. Мы целевой двух генов: вителлогенина (VG), который кодирует предшественник белка желток и ultraspiracle (USP), который кодирует предполагаемый рецептор для ювенильного гормона (JH) и может служить в качестве транскрипционного фактора посредническую ответов на JH ¹⁴ в пчелам. В.Г., JH регулируют друг друга в цепи обратной связи ¹⁵ и участвуют в мед пчелы регуляции поведения ^9. Использование двойного нокдауна гена, Возмутим как В.Г., JH путей, и узнать, как они оказывают совокупное воздействие меда пчелы поведение и физиологию и как В.Г., USP и JH взаимодействуют ^9.

Вкусовое восприятие поведенческих предиктором пчелиного меда социальное поведение ^16. С точки зрения поведенческого развития, гнезда пчел с высокой вкусового восприятия поведенчески зрелых быстро, и, как правило корма в раннем возрасте и предпочитают собирать пыльцу ^16,17. Хотя нормативные мechanisms вкусового восприятия, лежащие в основе по-прежнему неясны, исследования показали, что вкусовое восприятие связано с внутренним метаболизмом энергии ^{9, 18,19} гормональной секреции и биогенетическая амина путей, ^20. Оба В.Г., JH важных гормональных регуляторов модуляции ^7,21 вкусового восприятия. В лаборатории, изменение вкусового восприятия в медоносных пчел может быть оценена тестированием хоботком ответа абонента (PER) для различных решений сахарозы. Каждая пчела проверяется прикосновения обе антенны ее с каплей воды, а затем восходящей серии концентрации 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30% сахарозы. Положительный ответ Отмечается, если пчелы полностью протягивает хобот, когда капли воды или сахароза касанием для каждой антенны. На основе количества положительных ответов на решения, вкусовые уровень восприятия каждого отдельного может быть определена ^16. Тем не менее, применение PER не ограничивается измерения гustatory восприятия. PER также является эффективным методом для проверки метаболическое состояние пчел, таких как насыщение против голода. Пчелы с большей ответов на сахарозу голоднее в целом (Wang и Amdam, неопубликованные данные). Кроме того, PER парадигма также может быть использован в ассоциативных обучения и памяти у пчел. В этом случае пчелы будут обучаться связать присутствии сахарозы воду с запахом. Когда пчелы узнать ассоциации, только наличие запах может вызывать положительный ответ хобот без награждение их с сахарозой ^22,23. В этом видео мы покажем, как выполнить за одну оценить вкусовые восприятия, которое было связано с В.Г. и USP двойной нокдаун в предыдущем исследовании ^9.

Protocol

Часть 1: RNAi-опосредованной двойной нокдаун гена

1. Синтез дсРНК

1. Дизайн праймеров дтРНК таргетинга В.Г., USP и управления кодированием ген зеленого флуоресцентного белка (GFP), который не находится в геном медоносной пчелы: праймеры были разработаны с использованием свободного программного обеспечения онлайн Primer3 ( http://frodo.wi.mit.edu/ ) .
2. дсРНК синтеза для В.Г., USP и GFP: использование RiboMax Т7 РНК-производственной системы от Promega для в пробирке транскрипции.
3. дсРНК очистки:
   1. Денатурации и ренатурацию: тепло дсРНК до 85 ° С в течение 5 мин и дайте ему остыть при комнатной температуре в течение 1 часа.
   2. Я ДНКаза лечения: Добавить 1 мкл ДНКазы I в каждую реакционную дсРНК и смешивать их, щелкая труб. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С.
   3. Добавить 150 мкл нуклеазы без воды и 750 мкл TRIzol – LS в каждую реакцию, и осторожно перемешать их инвerting трубки. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при 30 ° С.
   4. Добавить 200 мкл хлороформа в каждом образце. Смешайте энергично в течение 20 сек. Центрифуга образцов в течение 15 мин при 12000 х г при 4 ° С.
   5. Передача супернатант фазы в каждой новой трубки и добавляют 500 мкл изопропилового спирта в каждую пробирку. Смешайте их путем обращения трубки. Инкубируют смесь в течение 20 мин при -20 ° С. Центрифугируют в течение 10 мин при 12000 х г при 4 ° С.
   6. Удалить супернатант и использовать 1000 мкл 75% этанола мыть гранул. После центрифугирования пробирку в течение 5 мин при 7500 мкг при 4 ° С, воздух сухой дсРНК гранул, а также использовать нуклеазы свободной воды, чтобы растворить гранулы. Для обеспечения эффективности генной понижающая регуляция, концентрация дцРНК должна быть около 9 -10 мкг / мкл.

2. дсРНК уколами

Для двойного нокдауна гена, есть две стратегии: 1) одна инъекция: смешайте дсРНК двух генов и Injeкарат смеси; 2) двухдневный инъекций: вводят первое дцРНК ориентации одного гена в первый день, и вводят вторую дцРНК, в то же пчел на второй день.

1. Холод вновь возникших пчел в холодильнике 4 ° С в течение 1-2 мин. Когда пчелы обездвижены, смонтировать 3-4 пчел параллельно на чашки Петри полны твердой воска с насекомыми контакты пересек между их животами и thoraces.
2. Охладите пчелы снова в холодильник 4 ° C. Убедитесь, что пчелы совершенно неподвижными. Она занимает около 1-2 мин. Пчелы должны выглядеть свободными. Если пчелы коробиться или искаженным, значит, они охлаждаются слишком долго, которых следует избегать. Охлаждение слишком много причин высокой смертности, но полной иммобилизации важно, так как любое движение увеличивает размер раны и смертности.
3. Положите одноразовые иглы 30 G (BD) на шприце Hamilton микро. Возьмите 3 мкл дсРНК и убедитесь, что нет никаких пузырьков воздуха в шприце. Игла вставлена ​​в части брюшной полости, чтобы избежать дамаГинг внутренних органов. Нажмите на поршень шприца медленно, чтобы дсРНК быть поглощенным. Поскольку дцРНК очень вязкий, он занимает 2-3 секунд, чтобы быть полностью исключен из шприца. После полного нажатия ныряльщика, оставьте иглу в ране в течение 4-5 сек. Соблюдайте пчел в течение 3-5 сек после инъекции. Если гемолимфой капли утечки из раны, отказаться от пчелы.
4. Используйте разные цвета, чтобы отметить их thoraces соответствующей различных методов лечения. В этот момент, если один впрыск топлива был использован, пчелы могут быть помещены обратно в колонию через 1 час наблюдения. Однако, если два дня инъекции стратегии был использован после инъекции с первой дцРНК, пчелы должны быть помещены в клетку сетки цилиндра с медом поставляется на стороне, и храниться в инкубаторе при 34 ° C и относительной влажности 80% .
5. На второй день, выполните шаги 2.2 и 2.3, чтобы охладить пчел в сетчатых клетках и смонтировать их на восковых пластин. Выполнение инъекции со вторым дцРНК, как это descriкровать в шаге 2.4.
6. Пусть пчелы восстановиться при комнатной температуре в течение 1 часа и ввести их в колонии.

Примечание: нокдаун эффекты могут быть обнаружены с помощью количественной ОТ-ПЦР (QRT-PCR) и вестерн-блоттинга. В общем, нокдаун эффективность варьируется и зависит от многих факторов. В нашем исследовании двойного нокдауна гена могут быть обнаружены 7 дней после однократной инъекции и двухдневные инъекций.

Часть 2: хоботок Расширение ответ (PER) анализа

1. Сбор пчел из улья

На 6 день после инъекций, собирать обработанных пчел из колонии без использования курильщика. Сбор пчел в металлических клетках сетки цилиндра. Держите 3 пчел в каждой клетке.

2. Монтаж пчел PER

Охладить пчел при 4 ° С, пока не будут полностью заблокирован. Установите каждая пчела вертикально в пластиковую трубку специально разработан для ПЕР. Держите живот внутрь трубки Усинг два небольших кусочка ленты и держать голову, торчащий из трубы. Положите трубку на стойку с двумя рядами небольших пластиковых колонн, и назначить каждой трубки (БИ) с идентификационным номером. Затем положить рассматриваться пчел на стеллажах в инкубатор (34 ° C и 80% влажности) и держать их в инкубаторе в течение 2 часов.

3. Подготовка серии растворов сахарозы воды

Подготовьте 0%, 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% и 30% растворы сахарозы воды и загрузить решений в шприцы с иглами 15-20 G.

4. На анализ

Сенсорный антенна пчелы с каплей 0% раствора (воды), а затем 0,1%, 0,3%, 1%, 3%, 10% и 30% растворы сахарозы воды. Проверьте все пчелы водой первого и позволяют не менее двух минут, как интервал между каждым раствор. Таким образом, мы, как правило, не менее 20 пчел для каждого испытания. Если пчелы полностью протягивает хобот, положительный ответ засчитывается.

5.Управление данными

Подсчитывать общую положительных ответов для каждой отдельной для вкусовых Оценка ответа (GRS). Выполните соответствующий статистический анализ данных.

Часть 3. Проверка нокдаун гена

Жир тела расчленены из другого набора 7-дневных обрабатывают пчел. Стандарт триазол процедура используется для экстракции РНК, за которым следует обработка ДНКазой I ^24. Vg и USP экспрессии гена анализируют с помощью двухступенчатого QRT-PCR. Актина используется в качестве опорного ген, поскольку он имеет стабильную выражений в различных тканях медоносных пчел. Опубликованные в реальном времени ПЦР-праймеров для VG и USP гена использовали в этом эксперименте ^24. Данные анализируют с использованием дельта-дельта КТ метод ^25.

Representative Results

Discussion

Наше исследование является первой попыткой одновременно сбить два гена у взрослых насекомых. Наши результаты показывают, что две стратегии дцРНК инъекций (одной инъекции и двухдневный инъекций) являются эффективными для двойной подавление гена, и одновременное глушителей гена В.Г. и USP может быть проверена 6 дней после инъекции дцРНК в пчелами ^8,9. Тем не менее, эффективность нокдаун гена различна в разных видов насекомых в зависимости от уровня транскрипта гена-мишени, уровень белка дсРНК оборота и эффективность поглощения клетками или органами. Кроме того, эффект RNAi зависит от дозы. Мы нашли недавно появившихся пчела вполне может принять 4 мкл дсРНК, но смертность резко возросла, если более 4 мкл дсРНК вводили. Таким образом, двухдневный инъекции стратегия может быть более подходящим, чем одна инъекция для эксперимента, который требует большего количества объема впрыска.

Здесь двойной нокдаун гена ⁹ </suр> мы разработали может быть использован для изучения совместное действие двух регулирующих органов. Кроме того, различные инъекции дсРНК подходы, представленные в этом видео предоставляет дополнительные инструменты для рассечения взаимосвязей между генами.

Например В.Г., JH находятся в обратной связи регулирующей пчелиного меда физиология и поведенческие ⁹ созревания ^26,27. Предыдущие исследования показали, что В.Г. нокдаун гена может повысить уровень JH медоносных пчел в ^28, в то время как местное применение может уменьшить JH В.Г. выражении ^29. Кроме того, исследования показали, USP является предполагаемый рецептор для JH, и могут опосредовать ответов на JH как транскрипционный фактор ^14,30. Тем не менее, как В.Г. модулирует JH титра ли USP и участвует в регуляции В.Г. по JH остаются малоизученными. Использование двойного подхода нокдаун, мы обнаружили подробную взаимосвязей между В.Г., USP и JH ( <strong> Рисунок 4). Во-первых, наши данные свидетельствуют о В.Г. играет центральную роль среди В.Г., USP и JH. Высокий уровень Vg не только ингибирует производство JH ^15, но тормозит систематическую обратную реакцию в нокдаун USP (рис. 4а). В В.Г. и USP пчел двойной нокдаун, JH производства увеличился более, чем ^9, что в одном В.Г. нокдаунов. Возможным объяснением является то, что резкое увеличение JH в двойных результатов нокдаунов от значительного снижения негативного эффекта В.Г. О JH вызвано В.Г. нокдаун и компенсаторная реакция к снижению трансдукции JH вызвано USP нокдаун (рис. 4В). Во-вторых, нокдаун В.Г. первым и вторым USP или одновременное нокдаун и вызвало больше снижение USP чем одного нокдауна USP сделал. Это позволяет предположить, что В. Г. подавляет чувствительность USP mRNAto своей DSРНК. Этот результат является первой ссылке Vg с процессами RNAi. Vg участвует в иммунной защите медоносных пчел в ³¹ и РНК-интерференции является одним из многих противовирусных систем ³² в эукариотических организмов. Исследования показали, что процесс РНК-интерференции включает Argonaute белки, которые сохраняются в течение ³³ эукариоты. Интересно, что мы ранее обнаружили, что Argonaute 3 (GB19389, Piwi) является одним из генов, регулирующих кандидата мед пчелы социального поведения, в которой VG / JH модуль играет центральную роль ^34. Таким образом, одной из альтернатив объясняется тем, что Vg подавляет функции белков Argonaute влияющих деградации мРНК (рис. 4а). Когда В.Г. подавляется, Argonautes более активно способствовать USP деградации мРНК, причиненный его дсРНК (рис. 4В). Наконец, мы нашли В.Г. стенограммы изобилия не было изменено нокдаун USP, и она была снижена на VG и USP двойной нокдаун в гоэлектронной же уровне, что В. Г. одного нокдаун. Эти результаты показывают, что USP не участвует в тормозящее влияние на ЮГ Vg. В целом, двойной нокдаун гена видимо это мощный подход, чтобы помочь нам понять нормативно генной сети в деталях.

PER является стандартным методом для измерения вкусового восприятия в мед пчелы, которая была использована в качестве предсказателя для развития пчел социальное поведение ^35. Пчелы с высокой чувствительностью к сахару нагула обычно начинают в раннем возрасте и предпочитают собирать пыльцу. Вкусовое восприятие также может быть проверена для прогнозирования эффекта лечения на социальное поведение перед любым другим крупные исследования поведения масштаба выполняются. Кроме того, мы показали, что вкусового восприятия коррелирует с внутренней метаболическое состояние ⁹ Таким образом, PER могут быть использованы для определения насыщения и голода уровней. Кроме того, в паре с PER запах условиях используется для изучения обученияи память у медоносных пчел. В совокупности на анализ является очень полезным методом для изучения поведения пчел медом и метаболических физиологии. Однако, согласно чувствительна к методы обработки ^36. Например, пчелы, которые делали анестезию охлаждением или CO ₂ были более отзывчивыми к сахарозы, чем управление ^36. PER также изменяется в течение дня и чувствительны к условиям окружающей среды и стресса. Таким образом, очень важно сохранить окружающую среду и процедур, соответствующих ходе эксперимента. В общем, мы закончим PER утром и то же расписание в последующие дни. Обычно мы начинаем сбор пчел в рано утром в 8:00 утра, и это занимает 3 часа, чтобы подготовиться к ПЕР. Если PER должна быть выполнена через несколько дней, важно, чтобы завершить его в течение короткого периода в случае изменения окружающей среды. PER должны быть приняты в группы, и каждая группа должна содержать более 20 пчел, потому что по крайней мере 2-минутный интервал должен быть между различными КонцентрацОНС растворы сахарозы. Мы сделали 75-100 пчел на группу.

Materials

GE Healthcare PCR beads in 96 well plate	GE Healthcare	27-9557-01
QIAquick PCR purification kit	Qiagen	28104
RiboMax T7 RNA production system	Promega	P1300
Trizol LS	Invitrogen	10296028
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1	Sigma-Aldrich	C0549
isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	I9516
Hamilton micro syringe	Hamilton	80301
30G BD disposable needles	BD Biosciences	305106
Sucrose	Sigma-Aldrich	84097
1 ml Syringe	BD Biosciences	30960
Stereo dissection microscope	Leica Microsystems	S6D
Insect pins	Fine Science Tools	26000-25
Wax plate