Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трансплантация в переднюю камеру глаза для продольной, неинвазивные

13.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50466

⸱

10 марта 2013 г.

 ,  , 
1Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Medicine, University of Miami Miller School of Medicine, 4Department of Physiology & Biophysics, University of Miami Miller School of Medicine, 5The Rolf Luft Research Center for Diabetes and Endocrinology, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

Новый подход, сочетающий внутриглазного трансплантации и конфокальной микроскопии позволяет продольные, неинвазивные изображений в реальном времени с одноклеточными резолюции в привиты тканей В естественных условиях. Мы показываем, как пересадить панкреатических островков в переднюю камеру глаза мышей.

Аннотация

Прижизненные изображения стала незаменимым инструментом в биологических исследованиях. В этом процессе много методов визуализации были разработаны для изучения различных биологических процессов у животных неинвазивно. Тем не менее, основные технические ограничения в существующих прижизненных методов визуализации является неспособность объединить неинвазивным, продольное изображение с одноклеточными возможности разрешения. Мы покажем здесь, как трансплантации в переднюю камеру глаза обходит такие значительные ограничения предлагая универсальные экспериментальной площадкой, которая позволяет неинвазивным, продольное изображение с сотового резолюцию в естественных условиях. Мы продемонстрируем процедуры трансплантации у мышей и предоставить представителю результатов, используя модель с клинической значимости, а именно поджелудочной железы трансплантации. Кроме того, включение прямой визуализации в различных тканях пересаживают в переднюю камеру глаза, этот подход обеспечивает платформу для осыпьп наркотиков, выполняя длительного наблюдения и мониторинга в тканях-мишенях. Благодаря своей универсальности, ткани / клеточной трансплантации в переднюю камеру глаза не только преимущества терапии трансплантации, он распространяется и на другие приложения в естественных условиях для изучения физиологических и патофизиологических процессов, таких как сигнальные и рак или аутоиммунные развития заболевания.

Введение

Достижения в области прижизненной микроскопии выявили физиологические явления не предсказывается в лабораторных исследованиях 1. Это указывает на проблемы в переводе данные, полученные обычными методами в пробирке в живых животных. В последнее десятилетие, визуализации тканей в живых животных была значительно улучшена благодаря техническим достижениям в области обработки изображений условий 2, 3, 4, 5, 6. Это стимулировало необходимость в естественных изображений подходов с возможным применение в экспериментальных моделях на животных для включения продольной визуализации тканей-мишеней неинвазивно.

Методы визуализации, такие как магнитно-резонансная томография и позитронно-эмиссионной томографии или биолюминесценции позволили неинвазивной визуализации органов / тканей глубоко внутри тела 7-8, 9. Но эти методы не могут достичь одной ячейки разрешение из-за высокой сигналов фона и низкого пространственного разрешения, несмотря на использование OF материалов высокого контраста или тканеспецифические 4 люминесценции. Это был адресован с появлением двух фотонов флуоресценции конфокальной микроскопии 10. Двухфотонной микроскопии включен прижизненный исследования изображений для визуализации и количественной оценки клеточных событий, с беспрецедентной детали 11, 12. Это привело к характеристике ключевых биологических процессов в норме и патологии 13, 14, 15, 16. В то время как новаторские исследования прижизненного изображения были в первую очередь "имитировал" в естественных условиях в вырезают ткани (например, лимфатические узлы), другие исследования использовались инвазивные подходы к изображению подвергаются ткани-мишени на месте 17, 18, ​​19, 20, 21. Другие исследования также использовали «окно камеры модели", чтобы обойти ограничения, связанные с инвазивными подходы и ограниченное разрешение изображения в 22 естественных, 23, 24, 25. В модели окна камеры, камеры с прозрачным окном хирургически имплантированные под кожу на разАренда мест (со спины или уха кожи, молочной жировой ткани, печени и т.д.) на животных (например, мышей, крыс, кроликов). Хотя такой подход позволяет четко высокое разрешение изображения в естественных условиях, он требует инвазивного операцию по вживлению камеры и, возможно, не в состоянии вместить продольного исследования изображений в течение нескольких недель или месяцев, 22.

Недавно было показано, что сочетание высокого разрешения конфокальной микроскопии с минимально инвазивная процедура, а именно трансплантации в переднюю камеру глаза (ACE) обеспечивает «естественный окном тела», как мощный и универсальный в естественных изображений платформе 26, 27. Трансплантация в ACE была использована в последние несколько десятилетий для изучения биологических аспектов из различных тканей 28, 29, 30, и его последние комбинации с высоким разрешением включено изучение физиологии панкреатических островков с одной ячейке разрешение не- Инвазивно и продольно 26, 27. Такой подход был использован для изучения аутоиммунных реакций при развитии сахарного диабета 1 типа на животных моделях (неопубликованные данные). Она также используется для изучения развития поджелудочной железы, а также в исследованиях функции почек путем пересадки поджелудочной железы в ACE почки или отдельных почечных клубочков, соответственно (неопубликованные данные). В недавнем докладе использовании этого подхода продемонстрировал дальнейшее его применение для изучения иммунного ответа после трансплантации островков поджелудочной железы 31. Важно отметить, что данное исследование показало, что трансплантация в переднюю камеру глаза обеспечивает естественный окно орган для выполнения: (1) продольный, неинвазивная визуализация пересаженных тканей в естественных условиях; (2) в естественных условиях cytolabeling оценить клеточный фенотип и жизнеспособность в месте; (3) реального времени отслеживать проникновение иммунных клеток в ткани-мишени, и (4) местное вмешательство местного применения или внутриглазных инъекций.

Здесь мы Demonstrate, как выполнять трансплантации в переднюю камеру глаза с помощью панкреатических островков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Следующая процедура проводится под стереоскоп в 2 этапа, первый этап предполагает загрузку островков в канюлю и вторым шагом является фактическим трансплантации в ACE. Все процедуры, проводимые на животных были утверждены институциональных и использования животных комитета (IACUC) из Университета Майами.

1. Загрузка островков в Канюля для трансплантации

  1. Центр островков в культуре блюдо, крутя блюдо в сужении круга.
  2. Отключите канюлю из «резервуара» и разместить канюли и соединительной трубки на чистую поверхность. Резервуар может быть изготовлена ​​из 300 мкл одноразовые пластиковые кончика пипетки без фильтра (рис. 1а).
  3. Флеш пузырьков воздуха из резервуара для обеспечения непрерывного потока островками, когда аспирационных в резервуар. Промывка резервуара осуществляется путем движения вперед громкой моторизованных шприц-драйвер с помощью ножной педали(Рис. 1, b, с). Это также позволит освободить место в шприц, чтобы стремление островков в водохранилище (предварительно загружены стерильный раствор, такие как физиологический раствор, PBS или культуру средств массовой информации).
  4. Аккуратно аспирации необходимое количество островков в водохранилище. Островки будет иметь тенденцию к вихрем, как они попадают в водохранилища и останется вместе ко дну. Стремление делается при движении назад моторизованных шприц-драйвер с помощью ножной педали.
  5. Снова канюлю в резервуар через соединительный трубопровод.
  6. Поместите кончик канюли обратно в культуре блюдо и промойте островки из резервуара в трубопровод, то в канюлю. Убедитесь, что островки остаются вместе, как Вам заполнить трубу / канюлю, аккуратно "стряхивая" (касание) трубки (рис. 1г). Остановить либо до, либо после все пузырьки воздуха перед островки вымываются канюли. Если вы не уверены, остановиться, как островки войти в задней части канюли, как остальные воздухапузырьки перед островков может помочь предотвратить рефлюкс (обратный) островки из ACE. Исчезнет в одночасье.
  7. На данном этапе, вы готовы, чтобы ввести островков в ACE (пожалуйста, см. следующие шаги).

2. Островок трансплантации в переднюю камеру глаза

  1. Установите наркозом мыши на теплую подкладку под стереоскоп.
  2. Поместите морду мыши в анестезии "маски", связанные с кислородом / изофлурана машина анестезии. Маска сделана из 1 мл одноразовые пластиковые пипетки (без фильтра) и подключен к анестезии трубы через узкий конец (рис. 2а, б).
  3. Аккуратно уберите веки глазной для пересадки помощью указательный палец и большой палец свободной руки и "поп" глаз за лучшую экспозицию и легкого доступа (рис. 2). Это потребует некоторой практики, чтобы совершенствоваться, не препятствуя дыханию мыши чрезмерного давления нашее или блокирование притока крови к голове.
  4. Использование одноразовых шприцев инсулина (29 - 31G) как скальпель, тщательно проникают лишь верхушка в роговице и сделать один боковой разрез. Сделайте надрез в середине между вершиной роговицы и лимба, чтобы минимизировать рефлюкс островков во время инъекции из ACE (Рис. 2d).
  5. Осторожно вставьте канюлю (с предустановленными островков) через разрез.
  6. Медленно извлечь островки из канюли и сдать их на верхнюю часть диафрагмы. Чтобы избежать островок рефлюкс из-за чрезмерного наращивания давления в ACE, извлечь островков в краткой направлений в качестве небольшого объема (ы) как можно в квадранте противоположным разрез. Это может быть обеспечено дальнейшее уплотнение островков в НКТ при загрузке канюли (пожалуйста, см. п. 1.6).
  7. Медленно отвести канюлю из ACE. Это очень важный шаг, особенно, если большой объем островков был введен как островок рефлюкса из-за давленияУбедитесь скапливаться внутри ACE может быть неизбежным. Чтобы исключить / минимизировать островок рефлюкс, аккуратно поверните канюлю в то время как внутри ACE выпустить избыточное давление через разрез вокруг канюли. Убедитесь в отсутствии признаков рефлюкс, как вы пытаетесь втянуть канюли и, при необходимости, подождите, пока давление стихает до полного втягивания канюлю из ACE.
  8. Промыть глаза с пересаженным стерильной PBS или физиологического раствора.
  9. Inject бупренорфина для послеоперационного обезболивания (0.05-0.1 мг / кг, подкожно) в течение первых 48 часов.
  10. Применяют эритромицин глазной мазь с антибиотиком, чтобы пересаженный глаз сразу после трансплантации.
  11. Поместите животное обратно в клетку нагретой, чтобы восстановление после наркоза.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Есть несколько параметров, которые определяют "хорошее" трансплантации. Хороший трансплантации является тот, который протекает без кровотечения при принятии разрез, как видно на видео. Кровотечение не имеет возможности / сведено к минимуму, проникая лишь верхушка скальпель (иглы) в ACE (рис. 3а). Это также поможет предотвратить контакт и прокол радужной оболочки. Она также будет обеспечивать небольшой разрез которые заживут очень хорошо, не вызывая помутнение роговицы с течением времени

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мышиные панкреатических островков были выделены с использованием коллагеназы пищеварения с последующей очисткой на градиентов плотности, как описано выше 33. Изолированные островки культивировали в течение ночи перед трансплантацией. Хотя это может быть не обязательно, но рекомендуется, чтобы островки, чтобы оправиться от выделения. Это очень важно, когда трансплантация осуществляется при диабетической получателей, как он будет обеспечивать трансплантации выживания / надежных островков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

PO.B. является одним из основателей биотехнологической Biocrine компании, которая будет использоваться в передней камере глаза, как коммерческую платформу обслуживания. AC находится на патент защиту этой технологии.

Благодарности

Мы признаем доктора. Камилло Ricordi, Антонелло Pileggi, Р. Дамарис Molano, Стефан Speier и Даниэль Nyqvist за плодотворные обсуждения. Мы также благодарим Eleut Эрнандес и Диего Эспиноза-Heidmann для оказания технической помощи, и Майк Вальдес и Маргарет Formoso за помощь в записи видео. Байрон Мальдонадо записали, отредактированы, и произвел окончательный видео. Исследования поддержка была оказана диабета научно-исследовательского института Foundation ( www.DiabetesResearch.org ), NIH / NIDDK / NIAID (F32DK083226 в МВД, NIH RO3DK075487 к сети переменного тока; U01DK089538 в PO.B.). Дополнительная поддержка исследований PO.B была предоставлена ​​за счет средств Каролинского института, Шведского исследовательского совета, Шведский фонд диабета, семья Эрлинг Перссон-фонда, семьи Кнута и Алисы Валленберг фонда, Skandia Страховая компания ООО, яркие ( FP7-228933-2), Стратегическая программа исследований в области диабета Каролинского Институтаitutet, Novo Nordisk фонда и Фонда причала фон Kantzow автора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Название реагента Компания Номер в каталоге Описание / Комментарии
IsoTHESIA (Isoflurane) Бутлер Animal Health питания 11695-6775-2 99,9% Isoflurane / мл
Ketaset (кетамин HCL) Fort Dodge Animal Health 0856-2013-01 Альтернативные инъекционный наркоз
Beprenex (бупренорфин HCL) Reckitt Benckiser здравоохранения (UK) Ltd 12496-075-7-1 0,3 мг / мл
Эритромицин глазной мази USP, 0,5% Akron 17478-070-35 Прикладная профилактически, чтобы пересаженный глаз
0,9% хлорида натрия (физиологический раствор) Hospira Инк 0409-7983-03 Для внутривенной инъекции. Стерильный
PBS Gibco 10010-023 1X. Стерильный
CMRL среднего 1066 Cellgro 98-304-CV Дополнен, CIT модификации. Популярные средства массовой информации для островков

Ссылки

  1. Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy: a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem. Cell Biol. 133 (5), 481-491 (2010).
  2. Leibiger, I. B., Caicedo, A., Berggren, P. O. Non-invasive in vivo imaging of pancreatic ?-cell function and survival - a perspective. Acta Physiol. (Oxf). , (2011).
  3. Wang, Y., Maslov, K., Kim, C., Hu, S., Wang, L. Integrated photoacoustic and fluorescence confocal microscopy. IEEE Trans Biomed. Eng. 57 (10), 2576-2578 (2010).
  4. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat. Methods. 7, 603-614 (2010).
  5. Aswathy, R. G., Yoshida, Y., Maekawa, T., Kumar, D. S. Near-infrared quantum dots for deep tissue imaging. Anal. Bioanal Chem. 397 (4), 1417-1435 (2010).
  6. Ghoroghchian, P. P., Therien, M. J., Hammer, D. A. In vivo fluorescence imaging: a personal perspective. Wiley Interdiscip Rev. Nanomed Nanobiotechnol. 1 (2), 156-167 (2009).
  7. Prescher, A., Mory, C., Martin, M., Fiedler, M., Uhlmann, D. Effect of FTY720 treatment on postischemic pancreatic microhemodynamics. Transplant Proc. 42 (10), 3984-3985 (2010).
  8. Leblond, F., Davis, S., Valdés, P., Pogue, B. Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications. J. Photochem. Photobiol. B. 98 (1), 77-94 (2010).
  9. Toso, C., Vallee, J. P., Morel, P., Ris, F., Demuylder-Mischler, S., Lepetit-Coiffe, M., et al. Clinical magnetic resonance imaging of pancreatic islet grafts after iron nanoparticle labeling. Am. J. Transplant. 8 (3), 701-706 (2008).
  10. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  11. Wang, B. G., Konig, K., Halbhuber, K. J. Two-photon microscopy of deep intravital tissues and its merits in clinical research. J. Microsc. 238 (1), 1-20 (2010).
  12. Denk, W., Delaney, K. R., Gelperin, A., Kleinfeld, D., Strowbridge, B. W., Tank, D. W., et al. Anatomical and functional imaging of neurons using 2-photon laser scanning microscopy. J. Neurosci. Methods. 54 (2), 151-162 (1994).
  13. Cahalan, M. D., Parker, I. Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs. Annu. Rev. Immunol. 26, 585-626 (2008).
  14. Khorshidi, M. A., Vanherberghen, B., Kowalewski, J. M., Garrod, K. R., Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H., et al. Analysis of transient migration behavior of natural killer cells imaged in situ and in vitro. Integr. Biol. (Camb). 3 (7), 770-778 (2011).
  15. Matheu, M. P., Cahalan, M. D., Parker, I. Immunoimaging: studying immune system dynamics using two-photon microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top99(2011).
  16. Celli, S., Albert, M. L., Bousso, P. Visualizing the innate and adaptive immune responses underlying allograft rejection by two-photon microscopy. Nat. Med. , (2011).
  17. Fan, Z., Spencer, J., Lu, Y., Pitsillides, C., Singh, G., Kim, P., et al. In vivo tracking of 'color-coded' effector, natural and induced regulatory T cells in the allograft response. Nat. Med. 16 (6), 718-722 (2010).
  18. Sabek, O., Gaber, M. W., Wilson, C. M., Zawaski, J. A., Fraga, D. W., Gaber, O. Imaging of human islet vascularization using a dorsal window model. Transplant Proc. 42 (6), 2112-2114 (2010).
  19. Coppieters, K., Martinic, M. M., Kiosses, W. B., Amirian, N., von Herrath, M. A novel technique for the in vivo imaging of autoimmune diabetes development in the pancreas by two-photon microscopy. PLoS One. 5 (12), e15732(2010).
  20. Martinic, M. M., von Herrath, M. G. Real-time imaging of the pancreas during development of diabetes. Immunol Rev. 221, 200-213 (2008).
  21. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window. J. Vis. Exp. (12), e678(2008).
  22. Palmer, G. M., Fontanella, A. N., Shan, S., Hanna, G., Zhang, G., Fraser, C. L., et al. In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent. 6 (9), 1355-1366 (2011).
  23. Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy. Nat. Rev. Cancer. 2 (4), 266-276 (2002).
  24. Taylor, M. The response of capillary endothelium to changes in intravascular pressure, as seen in the rabbit's ear chamber. Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 31 (5), 533-543 (1953).
  25. Shan, S., Sorg, B., Dewhirst, M. W. A novel rodent mammary window of orthotopic breast cancer for intravital microscopy. Microvasc. Res. 65 (2), 109-117 (2003).
  26. Speier, S., Nyqvist, D., Cabrera, O., Yu, J., Molano, R. D., Pileggi, A., et al. Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology. Nat. Med. 14 (5), 574-578 (2008).
  27. Speier, S., Nyqvist, D., Kohler, M., Caicedo, A., Leibiger, I. B., Berggren, P. O. Noninvasive high-resolution in vivo imaging of cell biology in the anterior chamber of the mouse eye. Nat. Protoc. 3 (8), 1278-1286 (2008).
  28. Falck, B. Site of production of oestrogen in the ovary of the rat. Nature. 184, Suppl 14. 1082(1959).
  29. Bickford-Wimer, P., Granholm, A. C., Bygdeman, M., Hoffer, B., Olson, L., Seiger, A., et al. Human fetal cerebellar and cortical tissue transplanted to the anterior eye chamber of athymic rats: electrophysiological and structural studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84 (16), 5957-5961 (1987).
  30. Adeghate, E., Donath, T. Morphological findings in long-term pancreatic tissue transplants in the anterior eye chamber of rats. Pancreas. 5 (3), 298-305 (1990).
  31. Abdulreda, M. H., Faleo, G., Molano, R. D., Lopez-Cabezas, M., Molina, J., Tan, Y., et al. High-resolution, noninvasive longitudinal live imaging of immune responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , (2011).
  32. Unutmaz, D., Xiang, W., Sunshine, M. J., Campbell, J., Butcher, E., Littman, D. R. The primate lentiviral receptor Bonzo/STRL33 is coordinately regulated with CCR5 and its expression pattern is conserved between human and mouse. J. Immunol. 165 (6), 3284-3292 (2000).
  33. Pileggi, A., Molano, R. D., Berney, T., Cattan, P., Vizzardelli, C., Oliver, R., et al. Heme oxygenase-1 induction in islet cells results in protection from apoptosis and improved in vivo function after transplantation. Diabetes. 50 (9), 1983-1991 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Трансплантация в переднюю камерутрансплантация островков поджелудочной железывизуализация глаза мышипродольная визуализация in vivoметод intravital-визуализациипроцедура заполнения канюлимоторизованный шприцевой насосметод разреза роговицыприживление глазных тканей
Трансплантация в переднюю камеру глаза для продольной, неинвазивные
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.