Мы измеряли напряжение выпуска в аксон, который был частично поврежденных с помощью лазера рассекатель одновременное измерение силовой спектроскопии проводили на оптически-ловушки зонд приклеен к мембране аксона. Разработанный экспериментальный протокол оценивает аксон адгезию к культуральной подложки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Измерение Ослабление натяжения в процессе лазерного поражения Индуцированные Axon для оценки аксонов адгезию к основанию и Piconewton в миллисекундах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Формирование функциональных соединений в разработке нейронной сети зависит от внешних сигналов. Нейрита роста развивающихся нейронов подлежит химической и механической сигналов и механизмы, с помощью которых он чувствует и реагирует на механические сигналы плохо изучены. Выяснения роли силы в камере созревания позволит конструкции каркасов, которые могут способствовать клеточной адгезии и цитоскелета связи с подложкой, и, следовательно, улучшить способность различных типов нейронов к регенерации после травмы.
Здесь мы опишем метод применять одновременные измерения силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Мы измеряем снимающее напряжение в частично поврежденных аксонов одновременным интерферометрическом отслеживания оптической ловушке зонда придерживался мембране аксона. Наш экспериментальный протокол определяет снимающее напряжение с чувствительностью piconewton и динамика ослабления натяжения намиллисекунду временным разрешением. Поэтому оно предлагает высокое разрешение способ изучить, как механическая связь между клетками и субстраты могут быть модулированы по фармакологическому лечению и / или различные механические свойства подложки.
Введение
Оптическая микроскопия является одним из менее инвазивных система визуализации доступны для наблюдения живых клеток. С эксплуатацией эффекты, такие как давление излучения (как в оптических пинцетов 1), или высокой энергии потока фотонов (как в лазерных диссекторе 2), эта технология была распространена на нано-манипуляции. Оптической системы дает точного контроля для визуализации и управления суб клеточных мишеней 3. В то же время, благодаря точной калибровки поставляемых мощности лазера и оптических инструментов достижения мягкой или инвазивные манипуляции образца с беспрецедентной воспроизводимости.
Неско....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Оптическая схема
Вся оптическая система была описана ранее 15. Кратко, оптическая система пинцетом основана на иттербия непрерывной волны (CW) операционной волоконным лазером на длине волны 1064 нм (IPG Laser GmbH). Пространственный модулятор света (ПМС) (LCOS-SLM, модель X10468-07 - Hamamatsu) изменяется фаза входящих ИК лазерный луч для управления положением захвата точка фокусировки на чашку для культивирования при компьютером голограммы. Свободном доступе Blue-пинцет программного обеспечения (веб-ссылка на оборудовании таблицу) синтезированных голограмм проецируется на пространственный модулятор света. Интерферометр для из....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Элемент генерирует тяговых усилий на подложке ее фокальные адгезии. Сила, порожденная элементами цитоскелета находятся в равновесии с противодействующей силой культуры подложке. После лазерной индуцированной повреждением аксонов, некоторые из напряженной кабелей цитоскелета разрушаются и их уравновешенной напряжение снимается, поскольку противоположные силы субстрата адгезии устраняется. Выпустила напряженность частично распределяется по неповрежденную фокальные адгезии, и шарик прикреплен к клеточной мембране, которая .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы сообщаем в этой работе количественные методы для сравнения нейрита адгезией к подложке культуры, при проведении одновременных измерений силовой спектроскопии при лазерном клетки, вызванное поражением. Измеренные снятие напряжения связан со степенью адгезии клетка с подложкой: клетки с более высоким числом фокальные адгезии должен освободить меньше напряжения. Измерение снятие напряжения с точки зрения piconewtons обеспечивает физическую величину, с помощью которых можно оценить аксонального адгезию к культуре поддерж.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Альберто Guiggiani для развития реального времени система управления, Эвелина Chieregatti и Ханако Цусима для обсуждений проницательный, Джакомо Pruzzo и Алессандро Пароди для разработки пользовательских электроники и программного обеспечения, и Клавдия Chiabrera и Марина Нанни за их экспертные консультации и помощь в подготовке ячейки культуры.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Полимерные микросферы, 4 μ m, COOH покрытый Bangs | laboratories | PC05N/6700 | |
| PolyLink Protein Coupling Kit | Polyscience 19539 | ||
| EQUIPMENT | |||
| ИК-лазер | IPG Laser GmbH | YLM-5-SC-LP | иттербиевый волоконный лазер непрерывной волны (CW) работает на длине волны 1064 нм, с линейной поляризацией |
| Пространственный модулятор света | Hamamatsu | LCOS-SLM 10468-07 | |
| Программное обеспечение для синего пинцета | Группа оптики, Университет Глазго | Бесплатное загружаемое программное обеспечение | http://www.physics.gla.ac.uk/Optics/projects/tweezers/slmcontrol/ |
| ImageJ | Hamamatsu | Бесплатное загружаемое программное обеспечение | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
| QPD | Thorlabs | S5980 с платой C5460SPL 6041 | Четырехквадрантный фотодиод для измерения смещения зонда x, y захваченный PD |
| Teem Photonics | PDA100A-EC | Фотодиод для измерения смещения z-захваченного зонда | |
| нано-импульсный УФ-лазер | AA-оптоэльктоника | PNV-001525-040 | Импульсный лазер UVA, длительность импульса 400 пс |
| Акустический оптический модулятор | Olympus | MQ110-A3-UV, 355 нм плавленый диоксид | |
| Вертикальный микроскоп | Andor | BX51 | Оснащен объективом погружения в воду 60, 0,9 NA, |
| ПЗС-матрица | Warner Instruments | V887ECSUVB EMCCD | |
| Устройство Пельтье | Physic Instruments | QE1 резистивный нагрев с двухканальным нагревателем TC-344B контроллер | |
| Микроскопический столик: микро+пьезостолик | National Instruments | Три линейных столика М-126. CG1 с отдельным 3-осевым пьезоэлектрическим нанопозиционирующим столиком P-733.3DD | |
| Daq | NI PCI-6229 | Получение x, y, z положения захваченного зонда и отправка сигналов петли обратной связи на столик микроскопа | |
| Linux Real Time Application Interface (RTAI) машина | Система петли обратной связи в реальном времени, для управления положением предметного столика, разработанная на специальном рабочем столе ПК |
Ссылки
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical Trapping and Manipulation of Viruses and Bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
- Berns, M. W., Aist, J., et al. Laser microsurgery in cell and developmental biology. Science. 213, 505-513 (1981).
- Nguyen, Q. T., Olson, E. S., et ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
