Методическая статья

Строительство микроскопа высокого разрешения с обычными и голографические оптические возможности отлова

DOI:

10.3791/50481

⸱

22 апреля 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, University of Utah

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система, описанная в данном документе, использует традиционный оптической ловушки, а также независимые голографический оптический захват линия, способная создания и управления несколькими ловушками. Это обеспечивает создание сложных геометрических механизмов светоотражающие частицы в то же время позволяет одновременно высокой скоростью и с высоким разрешением измерения активности биологических ферментов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокое разрешение микроскопа системах с оптическими ловушками обеспечивать точное манипулирование различных объектов преломления, таких как диэлектрическая шарики 1 или клеточных органелл 2,3, а также высокое пространственное и временное разрешение считывания их положения относительно центра ловушки. Система, описанная здесь, имеет одно из таких "традиционных" ловушку работающий на длине волны 980 нм. Это дополнительно обеспечивает второй оптической системы захвата, который использует коммерчески доступные голографической пакет одновременного создания и управления сложными узорами захвата в поле зрения микроскопа 4,5 на длине волны 1064 нм. Сочетание этих двух систем позволяет манипуляцию нескольких объектов преломления в то же время, одновременно осуществляя высокой скоростью и высокой измерений разрешение движения и силы на производство и piconewton нанометрового масштаба.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Оптический захват является одним из основных методов в области биофизики 6. Важным шагом вперед в оптических захвата была разработка голографических ловушки, которые позволяют создавать трехмерные модели захвата вместо обычных ловушек точке 7. Такие голографические ловушки обладают преимуществом универсальности в позиционировании преломления объектов. Однако обычные ловушки могут быть легко выровнены, чтобы быть более симметричным, чем коммерчески доступные наборы голографический. Они также позволяют для быстрого точного отслеживания захваченных объектов. Здесь мы опишем системы (рис. 1), которая сочетает в себе два подхода захвата в одном приборе и позволяет пользователю использовать преимущества обоих по мере необходимости.

Общих соображений построения оптических ловушек (на основе одного или нескольких лазерных лучей) подробно обсуждаются в другом месте 8-10. Здесь мы наметим конкретные соображения с нашимПуск в эксплуатацию и обеспечивают деталь нашего процедуру выравнивания. Например, в системах с двумя оптических пучков захвата были описаны ранее (например, ссылка 11), обычно с использованием одного лазерного луча для улавливания преломления объекта и использование другого (намеренно низкой мощности пучка) для отделены считывания положения захваченного объект . Здесь, однако, как лазерные лучи должны быть высокой мощности (300 мВт или выше), потому что оба будут использоваться для улавливания. Для измерений биологических систем, лазеров, используемых для улавливания должно оптимально входят в конкретное окно ЧМР длины волны света, чтобы минимизировать деградацию белка 1. Здесь мы решили использовать диод 980 нм и 1064 нм DPSS лазеры из-за их низкой стоимости, высокой доступности и простоте в эксплуатации.

Мы также решили использовать пространственного модулятора света (SLM) для создания и редактирования нескольких ловушек одновременно в реальном времени 4,5. Эти устройства являются коммерчески доступнымиОднако их интеграция в полной установки представляет уникальные задачи. Здесь мы опишем практический подход, который решает эти потенциальные трудности и обеспечивает универсальный инструмент. Мы предоставляем явный пример для конкретной установки, описанной которые могут быть использованы в качестве руководства для измененных конструкций.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Установка длины волны 980 нм Одноместный оптическую ловушку

  1. Оптический захват на длине волны 980 нм часто оптимальным для экспериментов биофизики и недорогие лазерные диоды легко доступны мощность достигает 300 мВт. Желательно, чтобы лазерный диод для скрученный с поляризацией, сохраняющих одномодового волокна с известной диаметр поля моды. Волокно должно быть достаточно длинным, чтобы выступать в качестве режима фильтра и, как правило, прекращается либо с FC / PC или FC / APC разъема. Из них FC / APC, предпочтительно минимизировать обратное отражение света и потенциал неустойчивости обратной связи.
  2. Закрепите лазерный диод 980 нм в креплении, которое позволяет за власть и контроль температуры. Лучше исправить на гору, чтобы оптический стол прямо на максимальную пассивную жары и тем самым свести к минимуму опасность диода недостаточность вследствие неисправности регулятора температуры.
  3. Установить PC / APC разъем волокна к оптике луч коллиматорный. Эторешающее значение для обеспечения, что направленный луч имеют минимальное расхождение так регулируемая портов волокна являются наиболее полезными. Убедитесь, что выбранный порт волокна совпадает с диаметром поля моды волоконного косичку диода. Если луч должен быть развернут использованием акустооптического дефлектора (AOD) или электрооптического дефлектора (ПС), то коллимированный лазерный луч талии также должна быть немного меньше, чем размер дефлектор отверстием.
  4. Закрепите коллимирующих адаптер к оптическому таблицы на таком расстоянии от микроскопа, чтобы обеспечить луч маршрутизация, расширение, и размещение других необходимых компонентов. Отрегулируйте оптическим портом для обеспечения последовательного перетяжки на расстояниях, сравнимых с общими пути луча микроскопа.
  5. Установка зеркала показано на рисунке 1. Удалить объективное от микроскопа и использует зеркала, чтобы направить луч через отверстие в объективном монтажа сцены. Если предпочтительным, размещение дихроичных зеркал DM1 и DM3 не может быть опущен, покапозже. СД2 и DM3 оба shortpass и передают видимый свет, отражая ближнем ИК и выше.
  6. Это полезно временно смонтировать красный лазерный указатель на место цели, выровнены по оптической оси микроскопа. Пользовательских механической адаптера необходимо обеспечить ция лазерной указки. Видимый луч от лазерной указки может быть направлен к центру апертуры оптического порта и может быть использован для установки объективов (см. ниже).
  7. Установите 980 нм расширитель пучка (L8 и L9) на должном расстоянии от оптического порта, чтобы для будущих вставки компонентов рулевого управления (AOD или ПС) при необходимости 1. Расширил луч должен слегка переполнять задней фокальной апертуры объектива. (Здесь, линзы с фокусным расстоянием 125 мм и 60 мм на кеплеровской расположения, примерно удвоится перетяжки). Используйте видимый луч лазерной указки (см. раздел 1.6), чтобы обеспечить правильное размещение объектива и грубую центровку.
  8. Устанавливатьл 980 нм рулевого линз (L2 и L3) в телескоп, как указано расположение (здесь и есть 60-мм фокусное расстояние) 1. L3 устанавливается в плоскости, сопряженной к задней фокальной плоскости объектива. Горы L3 на точность позиционирования этап XYZ для обеспечения управления лучом. Это полезно для сцены XYZ иметь цифровые индикаторы для его микрометров, что позволяет повторяемые позиционирования и репозиционирования ловушку. 0.5 "спектр туристических обычно достаточно, однако больше путешествий для позиционирования L3 вдоль оптической оси может быть полезным. Используйте видимый луч лазерной указки (см. раздел 1.6), чтобы обеспечить правильное размещение объектива и грубую центровку.

2. Установка лазерный детектор

  1. Установите DM3 дихроичных зеркала над конденсатором, как показано на рисунке 1. Пользовательские горе, как правило, требуется. Закрепить четырех фотодиодом (QPD) или позиционно-чувствительный детектор (PSD) 8 в сторону конденсатора сборки и епзЮр, что 980 нм лазерного луча, отраженного от DM3 бьет она примерно по центру. При использовании QPD убедитесь, что она установлена ​​на небольшой сцене XY, чтобы обеспечить точное центрирование датчика на лазерный луч.
  2. Установите L1 (как правило, 30 мм объективом) между DM3 и датчиком. Позиция L1 так, чтобы сфокусировать луч до одной точки на датчике.
  3. Установите режекторного фильтра непосредственно перед L1 блокировать 1064 нм луч, а также любые паразитные отражения видимого света от подсветки микроскопа и окружающего освещения.

3. Установка 1064 нм длина волны Голографические ловушки

  1. Голографическая часть установки построен вокруг коммерчески доступных аппаратных / программных пакета голографических зеркал, используемых в данный пакет рассчитан на максимальную мощность инцидента 5 или 10 Вт / см 2. Одиночный режим TEM00 пучков в этом диапазоне мощности могут быть легко получены из DPSS лазер на 1064 нм.
  2. Установить 1064 нм лазер на повышенныхплатформу для примерно соответствовать высоте луча для линии 980 (см. раздел 1).
  3. Если не прямо управляемым, мощность лазера можно отрегулировать вручную путем установки половины пластины волны (ВПТ) и поляризатор (PBS) сразу после лазерной выходной апертуры. Это полезно, чтобы установить поляризатор во вращающейся сцене, чтобы быть в состоянии соответствовать требованиям голографической зеркало для поляризации пучка.
  4. Установить 1064 нм расширитель пучка (L6 и L7). Талии лазерный луч должен быть расширен в соответствии с размером диагонали голографического зеркала. Для больших степеней расширения (выше 10х) это может быть проблемой, чтобы сохранить размер расширителя мала. Таким образом, может быть желательно использовать линзы с чрезвычайно небольшим фокусным расстоянием (здесь: 16 мм и 175 мм).
  5. Установите другие зеркала, как показано, чтобы направить луч 1064 нм через объектив.
    1. Безопасные DM1 дихроичной (45 ° угла падения) в кинематической крепления и расположите сборки на пути луча 980 нм, так что она позволяет undiminisheд передачи, что луч.
    2. Активируйте лазерной указкой свет. DM1 зеркало должно отражать достаточное количество видимого света, чтобы правильно расположить пространственный модулятор света (SLM) на пути этого пучка. ОДС также должна быть наклонена так, что входящие и исходящие лазерные лучи как можно ближе к нормали. Однако угол наклона должен быть достаточно большим для того, чтобы лазерный луч не обрезаются крепления линз и других оптических компонентов. 5 ° угла должны быть легко достижимо и достаточно мал. Наконец расстояние от DM1 в ОДС должны быть точно измерены, так что введение линзы L4 и L5 (см. ниже 3.6) может сопряженные ОДС плоского зеркала и задней фокальной плоскости объектива.
    3. Установите зеркало, чтобы направлять свет от 1064 расширителем пучка нм до ОДС. Убедитесь, что свет лазерной указки попадает в отверстие расширитель пучка по центру.
  6. Установите линзы L4 и L5 (здесь: линзы с 125 и 200 мм соответственно). Этот телескоп пару сопрягает ОДС плоского зеркала в задней фокальной плоскости объектива, а также снижает перетяжке только слегка переполнения задней апертуры объектива. Мы выбрали линзы с длинными фокусными расстояниями в космос ОДС от DM1. Это не только очищает место для второй линии лазером, но также имеет тенденцию к выравниванию сделать проще.
  7. Удалить лазерной указки. Оставьте монтажный адаптер в качестве грубого выравнивания отверстия.

4. Системы Установка и выравнивание Примечания

  1. Объектив L3 и ОДС должны быть расположены так, чтобы быть оптически конъюгированных с задней фокальной плоскости объектива. Общую фокальную точку L4 и L5 оптически сопряжено плоскости образца, если оптических пучков захвата вводят в бесконечности пространства микроскопа.
  2. петь ИК-карта зрителя выровнять 980 нм луч идти вдоль центральной оси отверстия в адаптере лазерная указка.
  3. Использование ИК-карта TО гарантировать, что 1064 нм луч попадает на том же месте, поскольку луч 980 нм на DM1, L2 и L3, и что 1064 нм луч проходит вдоль центральной оси отверстия в адаптере лазерная указка.
  4. Замените лазерной указкой монтажный переходник с целью. Высокая числовая апертура масло или вода целью является типичным.
  5. Совместите ловушка длиной волны 980 нм, как описано в 9 от "хождения" лазерного луча до радиально-симметричных интерференционной картины не наблюдается на камере.
  6. С голографической от зеркала (то есть выступает в качестве пассивного зеркала) используют ОДС и ​​DM1 "ходить" недифрагированный 1064 нм луч для выравнивания 1064 нм ловушку.
  7. ОДС приводит к значительному недифрагированный пучка, что приводит к сильным неподвижным ловушку лазера в поле зрения. Это полезно для выравнивания, но может быть нежелательным для экспериментов. Чтобы блокировать эту ловушку можно вставить небольшой непрозрачный объект на пути недифрагированный свет в месте сопряженной плоскости образца (например, гоэлектронной общей фокальной точки L4 и L5). Размер этой центральной блокатор месте должен быть несколько больше, чем диаметр диска Эри для сфокусированного света (блокатор с 100-300 мкм в диаметре для системы, описанной).
  8. djust 1064 нм поляризации пучка использованием поляризатор, чтобы соответствовать ОДС ориентации. Поверните полуволновой пластинки установить выходную мощность пучка по желанию.
  9. При желании вставить AOD или EOD элементы управления лучом в лазерной линии 980 нм. Обеспечить надлежащее сопряжения этих элементов задней фокальной плоскости объектива и перестроить ловушку. Это полезно для монтажа элементов на рулевом гониометрического этапе.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Собранная установка позволяет оператору ловушку несколько объектов преломления в реальном времени и установить их во всех трех измерениях в поле зрения. Проиллюстрируем голографической возможностей инструмента захватом 11 микросферы (рис. 2). Ловушка ограничивая каждого объекта вручную повторно расположенный при захвате, так что окончательная договоренность изображен логотип Университета штата Юта, где этот эксперимент. Комбинированная функция голографических и обычные ловушки представлена ​​на ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы построили инструмент, который сочетает в себе два оптических ловушек различных типов (рис. 1), чтобы обеспечить захват отдельных помещений объекта для манипуляций и измерения. «Обычной» оптической ловушки построен вокруг диодного лазера 980 нм. Этот луч расширился, управляемые и затем вводят в нашу инвертированный микроскоп ("светло-красный" луч на рисунке 1). Голографической оптической ловушки построен вокруг 1064 нм лазер DPSS. Луч расширяется, чтобы соответствовать разме...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Финансирование было предоставлено Университете штата Юта. Мы хотели бы поблагодарить д-ра Дж. Сю (UC Merced) и д-р Редди BJN (UC Irvine) за полезные обсуждения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Оптический столNewport corporationST-UT2-56-8Irvine, CA
Микроскоп, инвертированный, Eclipse TiNikon СШАMEA53220Melville, NY
Plan apo 100X масляный объектив (1.4 NA)Nikon СШАMRD01901Melville, NY Масляный
конденсаторный объектив 1.4 NANikon СШАMEL41410Melville, NY
EMCCD камераТехнология Andor СШАIxon DU897Южный Виндзор, CT
1/3" ПЗС-IEEE1394 камераNET США IncFoculus FO124SCHighland IN
Laser, TEM00, SLM, длина волны 1,064 нмKlastech Laser TechnologiesSenza-1064-1000Dortmund; Германия
лазерный диод, TEM00, SLM, 980 нмAxcel PhotonicsBF-979-0300-P5AMarlborough,
MA крепление лазерного диодаILX LightwaveLDX-3545, LDT-5525 и LDM-4984Bozeman,
MT регулируемые оптоволоконные портыThorlabsPAF-X-11-BNewton, NJ
голографическая системаArryxHOTKIT-ADV-1064Chicago, IL
зеркальныйвалун Нелинейные системыэто часть HOTKIT-ADV-1064Lafayette, CO
Кальцитовый поляризаторThorlabsGL10-BNewton, NJ
полуволновая пластинаThorlabsWPH05M-1064Newton, NJ
Поворотная установка поляризатораThorlabsPRM1Newton, NJ
полуволновая пластина поворотная установкаThorlabsRSP1Newton, NJ
ЗатворThorlabsSH05Newton, NJ
дихроичные зеркала (DM2 & DM3); 45 ° AOIChroma Technologyt750spxrxtСильфонные водопады,
дихроичное зеркало VT (DM1); 45 ° AOIThorlabsDMSP1000RNewton, NJ
кастомный механический адаптерThorlabsSM1A11 и AD12F с увеличенным внутренним отверстиемNewton, NJ
режекторный фильтрSemrockFF01-850/310-25Rochester, NY
Акустооптический дефлектор (2-осевой)intraActionDTD-584CA28Bellwood, IL
гониометрический столикNew Focus9081Санта-Клара, Калифорния
60 мм рулевые линзыThorlabsLA1134-BNewton, NJ
16 мм асферический расширительThorlabsAC080-016-CNewton, NJ
175 мм расширительThorlabsLA1229-CNewton, NJ
Блокиратор пятен (каброн-стальная сфера)Bal-Tecдиаметр 0,0100"Лос-Анджелес, Калифорния
Микросферы ( Карбоксил-полистирол)СферотекCP-45-10Озерный лес, Иллинойс

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Svoboda, K., Block, S. M. Biological applications of optical forces. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 247-285 (1994).
  2. Ashkin, A., Schutze, K., Dziedzic, J. M., Euteneuer, U., Schliwa, M. Force generation of organelle transport measured in vivo by an infrared laser trap. Nature. 348, 346-348 (1990).
  3. Shubeita, G. T., Tran, S. L., et al. Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets. Cell. 135, 1098-1107 (2008).
  4. Polin, M., Ladavac, K., Lee, S. H., Roichman, Y., Grier, D. Optimized holographic optical traps. Opt Express. 13, 5831-5845 (2005).
  5. Sun, B., Roichman, Y., Grier, D. G. Theory of holographic optical trapping. Opt. Express. 16, 15765-15776 (2008).
  6. Moffitt, J. R., Chemla, Y. R., Smith, S. B., Bustamante, C. Recent advances in optical tweezers. Annu. Rev. Biochem. 77, 205-228 (2008).
  7. Grier, D. G. A revolution in optical manipulation. Nature. 424, 810-816 (2003).
  8. Neuman, K. C., Block, S. M. Optical trapping. Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).
  9. Sheetz, M. P. Laser tweezers in cell biology. Introduction. Methods Cell Biol. 55, xi-xii (1998).
  10. Spudich, J. A., Rice, S. E., Rock, R. S., Purcell, T. J., Warrick, H. M. Optical traps to study properties of molecular motors. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1305-1318 (2011).
  11. Visscher, K., Gross, S. P., Block, S. M. Construction of multiple-beam optical traps with nanometer-resolution position sensing. Selected Topics in Quantum Electronics. IEEE Journal of. 2, 1066-1076 (1996).
  12. Valentine, M. T., Guydosh, N. R., et al. Precision steering of an optical trap by electro-optic deflection. Opt Lett. 33, 599-601 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Holographic MicroscopeBeam AlignmentLaser DiodeSpatial Light ModulatorBeam ExpanderDichroic MirrorOptical BenchRefractive ObjectsTrap Manipulation

Похожие статьи