В последние годы образовании половых клеток с использованием методов культурах клеток было продемонстрировано с использованием нескольких различных типов клеток соматических стволовых клеток. В этой статье мы представим дифференциации новорожденных мышей стволовые клетки для ранней ооцитов-подобных клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Дифференциация новорожденных кожи мышей стволовые клетки в зародышевые-подобных клеток
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Изучение ЗАРОДЫШЕОБРАЗОВАНИЕ и дифференцировки клеток традиционно было очень трудно из-за низкого количества клеток и их расположение глубоко внутри развивающихся эмбрионов. Наличие «закрытых» в пробирке система может оказаться бесценным для нашего понимания гаметогенеза. Формирование яйцеклетки-подобных клеток (ЭПУ) из соматических стволовых клеток, выделенных из кожи новорожденных мышей, была продемонстрирована и могут быть визуализированы в этом видео протокола. Полученные ЭПУ выражать различные маркеры соответствуют ооцитов, таких как Oct4, Vasa, Bmp15 и SCP3. Тем не менее, они по-прежнему не в состоянии пройти созревания или оплодотворения из-за неспособности завершить мейоза. Этот протокол будет создать систему, которая будет полезна для изучения ранней стадии формирования и дифференциации зародышевых клеток в более зрелых гамет. Во время ранней дифференциации количество клеток, экспрессирующих Oct4 (потенциальный зародыш-подобные клетки) достигает ~ 5%, однако в настоящее время FРеформации из ЭПУ остается относительно неэффективны. Протокол относительно прямой, хотя особое внимание следует уделять обеспечению исходной клеточной популяции здоровых и на ранней проход.
Введение
Во время раннего эмбриогенеза, гаметогенеза происходит через ряд этапов, включая изначальную зародышевых клеток (PGC) образование, миграция, и, наконец, колонизации половых хребтов. За это время PGCs пройти пролиферации и дифференцировке во все более и более зрелые гаметы 1. Тот факт, что PGCs мигрировать из базы аллантоис в эмбрион кишке и, наконец, вдоль дорсальной стенки в конечном счете колонизации половых гребни делает их чрезвычайно трудным для изучения 2. Несмотря на успехи в области исследования пытаются понять PGC формирования и дифференциации препятствовали их ограниченное количество, расположение и миграционного характера 3,4.
В последние годы эмбриональные стволовые клетки, как было показано, имеют потенциал для формирования половых клеток в пробирке 5,6. Кроме того, несколько стволовых соматические клетки, также было показано, что потенциал для формирования половых клеток Follблагодаря в пробирке культивирования 7-11. Последнее стволовые клетки, выделенные из кожи новорожденных мышей были дифференцированы в пробирке в зародышевые-подобные клетки и ооциты ранней стадии 12. Во время дифференцировки подмножество стволовых клеток, экспрессирующих Oct4 увеличена и структуры, напоминающие кумулюсных-ооцита комплексы были сформированы. Ооцитов-подобных клеток (ЭПУ) могут быть выбраны из культур и по сравнению с природным ооцитов. С помощью этого метода культуры ЭПУ измерения 40-45 мкм получаются, которое выражает подобные маркеры, такие как ооциты Gdf9b, Vasa, и DAZL. На сегодняшний день в результате ЭПУ-прежнему не созреть или быть оплодотворены 12.
Хотя ПУЭ остаются не в состоянии функционировать протокол, используемый для формирования этих ЭПУ могут по-прежнему находят применение в качестве анализа для изучения формирования и развития половых клеток ранних стадия в рамках закрытой системы в пробирке. Оригинальная публикация обсуждают формирование ЭПУ из такхор стволовых клеток использовали плода свиной кожи в качестве источника стволовых клеток 8. Развивая это исследование PGC-подобные клетки формируются в раннем возрасте во время индуцирует дифференциацию было показано, что предшественники ПУЭ и ускоренная такие маркеры как PGC OCT4, Vasa, Стелла, C-KIT и DAZL 13. Эти данные подтверждают потенциал использовании этой системы для изучения образование зародышей и дифференцировки клеток в пробирке. Протокол, используемый для формирования ЭПУ из кожи новорожденных мышей будет показано в этом видео статье. Этот протокол предлагает в пробирке модель для изучения развития зародышевых клеток, которые могут обеспечить средства для выяснения факторов, важных для их пролиферации и дифференцировки.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Приготовление среды
- Подготовьте СМИ 2-3 часов до начала использования и место с ослабил крышку в инкубаторе для клеточных культур, где эксперимент будет проходить. Медиа, используемые в настоящем протоколе:
- Подготовка стволовых клеток среду, состоящую из DMEM/F12, дополненной 1 х В27, 40 нг / мл BFGF и 20 нг / мл EGF.
- Подготовка зародышевых клеток дифференциации среды, состоящей из M199 с добавлением 0,05 международных единиц ФСГ, 0,03 МЕ ЛГ, 3 мг / мл BSA, 5 мкл / мл ЕЕ, 0,23 мМ пирувата натрия, 1 мг / мл фетуином и 1 нг / мл ЭФР. Основную среду, состоящую из всех добавок но без ФСГ, ЛГ и EGF могут быть подготовлены и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
2. Подготовка Стволовые клеточные культуры
- Изолировать стволовые клетки новорожденных щенков мыши, как описано выше 12. Использование стволовых клеток при прохождении 2-4 для экстракорпорального дифференцировки клеток зародыша. ЭффективностьOLC образование напрямую связана с качеством исходных стволовых клеток. Лучше всего, чтобы начать дифференциации, как только население оказывается чистой и здоровой которая обычно составляет около прохода 2. Дальнейшее культивирование стволовых клеток прошлые 2 Прохождение негативно влияет на эффективность формирования КЮ (неопубликованные результаты).
- 48 часов до начала дифференциации субкультуре стволовых клеток. Удалите все приостановленные сферические агрегаты клеток и истощенные среды от культуры блюдо, используя серологические пипетки, и поместить в 15 мл трубки. Важно только собирают взвешенных сферических агрегатов клеток, а не клетки, прикрепленные к нижней части блюда, которые спонтанно дифференциации.
- Осаждения клеток при 500 мкг в течение 5 мин., Отбросить супернатант, и ресуспендируют в 500 мкл свежей среды стволовых клеток нагревают до 37 ° С. Аккуратно пипетки агрегатов частично диссоциируют клеток. Не агрессивно пипетки клеткис, как это приведет к снижению жизнеспособности клеток. Промыть частично диссоциированных клеток в 9,5 мл свежей предварительно нагретой стволовых клеток среднего на низкий крепление 10 см чашку культуре клеток.
- Возврат клетки 37 ° С, 5% СО 2 инкубаторе для клеточных культур в течение 48 ч до начала дифференциации.
3. Дифференциация КЮ
- Использование серологические пипетки удалить стволовые клетки из культуры блюдо и поместить в 15 мл трубки, оставить позади все подключенные к нему клеток. Осаждения клеток при 500g и ресуспендируют в 500 мкл стерильной PBS. Энергичное пипетки клеток с использованием широкого отверстие 1000 мкл наконечник в сгустки не более 10-20 клеток. Периодически удаления небольшого количества клеток, во время диссоциации и проверить под микроскопом белый свет, чтобы подтвердить агрегированные клетки находятся в сгустки 10-20 отдельных клеток. За диссоциации приведет к снижению жизнеспособности клеток.
- Добавить 9,5 мл PBS в диссоциированных клеток и добавить 15 мкл этой клеточной суспензии в гемоцитометре для подсчета клеток. Гранул клетки при 500 х г в течение 5 мин.
- Повторное приостановить клеток в концентрации 1.32X10 6 клеток / мл в дифференциации среды.
- Пластина клеток путем добавления 500 мкл на лунку в плоское дно 24-луночный планшет подвески.
- Поместите 24 хорошо блюдо в инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С в 5% СО 2 в течение 48 часов. Удалить 250 мкл среды из каждой лунки и место в помечены соответственно 1,5 мл трубки. Добавить 250 мкл свежей среды, дифференциацию в каждую лунку. Центрифуга истощенной среды при 500 х г в течение 5 мин. и отбросить супернатант. Ресуспендируйте любой осажденные клетки в 50 мкл свежей среды дифференциации и вернуться к соответствующей культуре также на дифференциацию пластины.
- Каждые 48 часа изменить половину среды до 12-й день дифференциации.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Изначально клетки прикрепляются к нижней блюдо культуры и распространиться. В 42-72 часов в дифференциации взвешенных мелких OCT4 позитивные клетки размножаются и образуют (рис. 1А). Вскоре после визуализации этих клеток большинство исчезнет, и прикрепленные клетки образовывают плотные агрегаты колонии на нижней культуры. После нескольких дней эти агрегаты будут отделяться от поверхности культуры. В некоторых из этих агрегатов большой камере можно наблюдать (1b и 1с рисунок).<...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
На сегодняшний день функциональные ЭПУ не были разработаны с использованием полностью в пробирке анализа. В последнее время исследования Хаяши и соавт. Был в состоянии произвести потомство от PGC-подобные клетки формируются в пробирке и в естественных условиях передается для дальнейшего развития 14. Начиная с ЭС клетки или индуцированных плюрипотентных клеток они были способны образовывать PGC как клетки, которые, когда они извлечены после трансплантации в естественных ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
PWD при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения общение (CIHR) и CIHR грант Джеральд М. Киддер в Западном университете. Автор хотел бы также признать Julang Ли в университете гвельфов за помощь в разработке протокола, представленные здесь.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F12 | Invitrogen | 12500 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| EGF | Invitrogen | PHG0311 | |
| bFGF | Invitrogen | PHG0266 | |
| ITS | Invitrogen | 41400-045 | |
| BSA | Sigma | A-6003 | |
| Пируват натрия | Invitrogen | 11360-070 | |
| Fetuin | Sigma | F3385 | |
| FSH | Sioux Biochemicals | 915 | |
| LH | Sioux Biochemicals | 925 | |
| M199 | Invitrogen | 31100-035 | |
| 24 луночные пластины | Nunc | 144530 | |
| 10 см посуда | VWR | 25384-088 | |
| 15 мл трубки | BD | 352095 |
Ссылки
- van den Hurk, R., Zhao, J. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology. 63, 1717-1751 (2005).
- Molyneaux, K. A., Stallock, J., Schaible, K., Wylie, C. Time-lapse analysis of living mouse germ cell migration. Dev. Biol. 240, 488-498 (2001).
- Lawson, K. A., Hage, W. J. Clonal analysis of the origin of primordial germ cells in the mouse. Ciba Found Symp. 182, 68-91 (1994).
- Ginsburg, M., Snow, M. H., McLaren, A. Primordial germ cells in the mouse embryo during gastrulation. Development. 110, 521-528 (1990).
- Hubner, K., Fuhrmann, G., et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science. 300, 1251-1256 (2003).
- Toyooka, Y., Tsunekawa, N., Akasu, R., Noce, T. Embryonic stem cells can form germ cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11457-11462 (2003).
- Wang, L., Cao, J., et al. Oocyte-like Cells Induced from Mouse Spermatogonial Stem Cells. Cell Biosci. 2, 27(2012).
- Dyce, P. W., Wen, L., Li, J. In vitro germline potential of stem cells derived from fetal porcine skin. Nat. Cell Biol. 8, 384-390 (2006).
- Danner, S., Kajahn, J., Geismann, C., Klink, E., Kruse, C. Derivation of oocyte-like cells from a clonal pancreatic stem cell line. Mol. Hum. Reprod. 13, 11-20 (2007).
- Cheng, X., Chen, S., Yu, X., Zheng, P., Wang, H. BMP15 gene is activated during human amniotic fluid stem cell differentiation into oocyte-like cells. DNA Cell Biol. 31, 1198-1204 (2012).
- Song, S. H., Kumar, B. M., et al. Characterization of porcine multipotent stem/stromal cells derived from skin, adipose, and ovarian tissues and their differentiation in vitro into putative oocyte-like cells. Stem Cells Dev. 20, 1359-1370 (2011).
- Dyce, P. W., Liu, J., et al. In vitro and in vivo germ line potential of stem cells derived from newborn mouse skin. PLoS One. 6, e20339(2011).
- Linher, K., Dyce, P., Li, J. Primordial germ cell-like cells differentiated in vitro from skin-derived stem cells. PLoS One. 4, e8263(2009).
- Hayashi, K., Ogushi, S., et al. Offspring from Oocytes Derived from in Vitro Primordial Germ Cell-Like Cells in Mice. Science. , (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
