Методическая статья

Определение допустимого жирные кислоты и концентрации токсина холеры с использованием человеческих клеток эпителия кишечника и BALB / C макрофаги мыши

9.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50491

⸱

30 мая 2013 г.

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Kingsborough Community College, 2Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 3New Jersey Center for Science, Technology and Mathematics, Kean University

В этой статье

Краткое содержание

Мы решили определить допустимые концентрации трех жирных кислот (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты) и холерного токсина, который не значительно и отрицательно повлиять на выживаемость клеток путем растворения жирных кислот и токсинов и их использование в анализе выживаемости клеток.

Аннотация

Положительная роль жирных кислот в профилактике и борьбе не-человека и болезни человека были и продолжают быть документированы. Эти роли включают в себя воздействие на инфекционные и неинфекционные заболевания, включая профилактику воспаления, а также слизистой оболочки иммунитет к инфекционным заболеваниям. Холера является острой кишечной болезни, вызванной бактерией холерный вибрион. Это происходит в развивающихся странах, и если его не лечить, может привести к смерти. В то время как вакцины холеры существуют, они не всегда эффективны и другие профилактические методы необходимы. Мы решили определить допустимые концентрации трех жирных кислот (олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты) и холерного токсина с помощью мыши BALB / C макрофагов и человеческих эпителиальных клетках кишечника, соответственно. Мы солюбилизированного выше жирных кислот и использовали анализ пролиферации клеток для определения концентрации интервалов и конкретных значений концентрации жирных кислот, которые неT вредны для человеческого кишечного эпителия жизнеспособности клеток. Мы солюбилизированного холерного токсина и использовали его в анализе для определения концентрации интервалов и конкретных значений концентрации холерного токсина, которые не статистически снижение жизнеспособности клеток в линии BALB / C макрофагов.

Мы нашли оптимальную концентрацию жирных кислот составляет от 1-5 нг / мкл, и холерного энтеротоксина быть <30 нг на лечение. Эти данные могут помочь дальнейших исследований, направленных найти защитную слизистую роль жирных кислот в предотвращени или облегчени инфекции холеры.

Введение

Польза для здоровья жирных кислот, таких как олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты были и продолжают быть документированы. Так, например, олеиновая кислота помогает облегчить проникновение липофильных лекарственных средств в организме 1,2, уменьшает ишемической болезни сердца на 24% при замене насыщенных жирных кислот 3, и используется для лечения метаболических заболеваний, таких как Адренолейкодистрофия 4, который Х-хромосомой генетических нарушений метаболизма жирных кислот. . Хотя необходимо предшественником арахидоновой кислоты у млекопитающих, линолевая кислота (в отличие от олеиновая кислота) не синтезируется организмом и должны быть получены с помощью внешних источников, например, потребление семян льна 5 Исследования показывают несколько полезных последствий для здоровья линолевой кислоты, такие как: омолаживающие свойства для кожи, 6 противовоспалительными свойствами; 7 сократил распространение толстой кишки и предстательной железы клетки карциномы; 8 и способность бороться с ожирением и продвижение Oе сердечно-сосудистых заболеваний. 9 линоленовая кислота играет важную роль в снижении воспаления пародонта, 10 и модуляции тромбоксана и простациклина биосинтез 11.

Arpita 12 изучено влияние желчных жирных кислот и холестерина на V. вибрион Выражение лица факторов вирулентности и подвижность. Ямасаки 13 указано, что метанол выписку из красного перца чили, и другие естественно извлекаются соединения, потенциально может уменьшить холерного токсина производства. Вполне возможно, рассмотреть вопрос об использовании пищевых продуктов, которые богаты жирными кислотами выше (например, семена льна) в профилактике и борьбе с инфекционными заболеваниями, как холера путем предоставления иммунитета слизистых оболочек. Мы провели исследования для солюбилизации жирных кислот и определить, используя пролиферации клеток анализы, максимальная концентрация жирных кислот, что человеческие эпителиальные клетки кишечника может допустить без вредного воздействия на сеLL жизнеспособность. Мы предположили, что олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты обеспечивают благоприятное воздействие на жизнеспособность клеток при более низких концентрациях, но при более высоких концентрациях они будут токсичны для клеток. Мы также солюбилизированного холерного токсина и определяли максимальную концентрацию холерного токсина, что линии BALB / C макрофагов мыши могут переносить без существенного снижения жизнеспособности клеток. Мы предполагаем, токсическое действие холерного токсина на жизнеспособность клеток даже при очень низком уровне. Метод солюбилизации холерного токсина и его использование для определения максимального количества токсина, что клетки могут переносить без существенного снижения жизнеспособности обеспечивает преимущество для дальнейших исследований. Например, сочетание указанных выше методик можно использовать для определения того, жирные кислоты обеспечивают клетки слизистой иммунитет против инфекции холеры. Насколько нам известно, это рациональное и методология не была исследована.

Мы диscuss как наши предварительные данные могут быть использованы в более поздних исследованиях, чтобы определить, олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты обеспечивают клетки слизистой иммунитет против инфекции холеры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Культура ткани

  1. Используйте Mus мышцы макрофагов (BALB / с мышами) для определения холерного токсина. Изначально все культуры М. мышцы клетки в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Размножение BALB / с мышей клетками в среду Игла, модифицированную по Дульбекко с L-глутамином, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% антибиотик / противогрибковым или RPMI 1640, основание, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки, 5% L-глутамина и 1 % антибиотик / противогрибковым реагентом.
  3. Рост клеток в 75 см 2 колбы Corning с вентилируемыми колпачками при 37 ° C, 95% воздуха и 5% CO 2.
  4. Вызовите человека эпителиальные клетки кишечника в течение 24 часов поставки в соответствии с инструкциями изготовителя для определения жирных кислот определений.
  5. Распространить кишечника человека клетки эпителия в 75 см 2 колбы Corning с вентилируемыми колпачками HybriCare в средствах массовой информации, дополненной 10% FBS и 30 нг / мл человеческого EGF при 37 ° С. Не используйте антибиотикам/ Противогрибковым реагентов в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Разделение всех клеток (1:3) при примерно 70% слияния.
  7. Заморозить и воспитывать всех клетках на протяжении всего исследования с использованием стандартных протоколов замораживания.
  8. Примечание: для больших масштабах определение концентрации жирных кислот, используют более быстрый рост, легче поддерживать, макрофагах мыши на начальном этапе. Для мелкого масштаба определения концентрации жирных кислот, используйте эпителиальные клетки человека. Использовать мышь, макрофаги для всех холерного токсина лечения (см. обсуждение).

2. Жирная кислота и холеры Лечение токсинного

  1. Передача олеиновой, линолевой и линоленовой кислот из предоставленных компанией стеклянных ампул в стерилизованные стеклянные флаконы.
  2. Передача каждого жирных кислот в отдельную пробирку Эппендорфа стерилизованы и растворить ее первого в 100% этаноле в разведении 1:6, а затем в среде RPMI 1640 неполной среды до конечной концентрации 10 мкг / мкл.
  3. Vortex каждого решения и TransfER его стеклянная тара для хранения в морозильной камере (-20 ° C).
  4. Пластина клеток при 2500 клеток / лунку в 96-луночные планшеты для культуры ткани.
  5. Добавьте соответствующие полной среде, чтобы довести общее хорошо объема до 200 мкл для обработки клеток жирных кислот в подготовке к МТТ анализа.
  6. После 24-часового периода распространения ч, вынуть, и заменить его на свежую среду.
  7. Добавьте соответствующие концентрации каждого жирных кислот для тестирования в лунки (см. результаты). Добавить полную среду, чтобы довести общее хорошо объемы до 200 мкл.
  8. Инкубируйте обработанных пластин в течение 24 ч перед началом МТТ.
  9. Растворить холерного токсина в PBS при концентрации 1 мг / мл и аликвоты раствора в криопробирки и хранить криопробирок при 2-8 ° C.
  10. Для клеток лечение, разбавленной 1:100 в токсин или стерилизованный PBS (рН 7,4) или неполного DMEM до конечной рабочей концентрации 1 нг / мкл.
  11. Для лечения клеток холерного токсина вподготовки к МТТ анализа, пластиной клетками, как описано выше.
  12. После 24 часов период распространения, добавьте соответствующий концентрации холерного токсина (для нашего концентрации, см. результаты) для тестирования в лунки после процедур, используемых в приложениях жирные кислоты (выше).
  13. Инкубируйте обработанных пластин в течение 24 ч перед началом МТТ.
  14. В качестве положительного (положительная в течение бумага) и отрицательный контроль (отрицательный в), как жирные кислоты и токсин холеры лечения, клетки инкубируют с полной среде и 70% этанолом, соответственно.
  15. Для всех образцов и лечения используют не менее трех повторениях (п = 3), с большим количеством повторений для положительного контроля (п = 6 в данном исследовании).

3. МТТ

  1. Сделать МТТ раствора до концентрации 2,5 мг / мл.
  2. Удалить раствора в каждую лунку 96-луночного планшета для тестирования и заменить его на 200 мкл свежей полное решение сред.
  3. Объявлениед 10 мкл раствора МТТ в каждую лунку.
  4. Инкубировать при 37 ° С в течение 3-4 час.
  5. Отменить решение СМИ и добавить 100 мкл 0,04 М HCl в изопропаноле в каждую лунку.
  6. Инкубировать при комнатной температуре в течение пяти минут.
  7. Передача раствора из каждой лунки в новую пробирку центрифуги.
  8. Не центрифугируют при 20000 х г при комнатной температуре, в течение 1 мин или пока осадок образуется.
  9. Передача между 20-40 мкл каждого образца для микропланшет-ридера.
  10. Считать абсорбцию при 570 нм с использованием спектрофотометра.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Определение оптимальной концентрации жирных кислот

Оптимальная концентрация жирных кислот определяется как максимальная концентрация, при которой рост клеток сравнима или превышает контрольные клетки с относительно низкой изменчивости результатов. Для определения оптимальной концентрации олеиновой, линолевой и линоленовой кислот клетки изначально получавших различные концентрации каждого жирная кислота в больших приращений, а затем с меньшим шагом. Рисунок 1 показывает выживани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Предложению концентрация жирных кислот и холерного токсина

Хотя точный механизм того, как жирные кислоты повышения иммунитета слизистой неизвестна, несколько исследований предпринимались попытки исследовать их положительный эффект. В нашем исследовании направлен на обеспечение методологии для определения максимальной концентрации жирных кислот, что клетки могут переносить а также максимальную концентрацию холерного токсина, что клетки могут переносить без существенного влияния на выживание клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы этого исследования не имеют финансовой заинтересованности от результатов этого исследования. Финансирование данного исследования была предоставлена ​​футов на Кин университета, однако в настоящее время FT сотрудник Kingsborough Community College.

Благодарности

Мы благодарим Паула Кобос и доктор Эвроса Василиу лаборатории за помощь и предоставление макрофагах мыши соответственно. Мы также благодарим нашего менеджера лаборатории Ричарда Criasia для руководства и помочь с материалами. Наконец, авторы благодарят Ramanpreet Каур за помощь в видео-продукции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Cells/Reagent
>Mus musculus макрофагиATCC ATCCRAW 264.7
Модифицированная среда Dulbecco's Eagle's MediumATCC30-2002
L-глутаминATCC30-2115
Фетальная бычья сыворотка Bio-westS0250
Антибиотик/ антимикотический гиклонSV3007901
эпителиальных клеток кишечника человека ATCCATTC CCL-241
HybriCare media ATCC46-X
Олеиновая кислотаSigma-AldrichO1008
Линолевая кислотаSigma-AldrichL-1376
Линоленовая кислотаSigma-AldrichL-2376
Холерный токсинSigma-AldrichC8052
Equipment
BD Falcon 96-Well Cell Culture PlatesBD Biosciences351172
Спектрофотометр с программным обеспечением Dynex Revelations 4.22Dynex91000101

Ссылки

  1. Franceur, M. L., Golden, G. M., Potts, R. O. Oleic Acid: Its effects on stratum corneum in relation to (trans) dermal drug delivery. Pharm Res. 7 (6), 621-627 (1990).
  2. Tandon, P., et al. X-ray diffraction and spectroscopic studies of oleic acid-sodium acetate. Chem. Phys. Lipids. 109 (1), 37-45 (1990).
  3. Kris-Etherton, P. M. The debate about n-6 polyunsaturated fatty acid recommendations for cardiovascular health. Journal of the American Diabetic Association. 110 (2), 201-204 (2010).
  4. Rizzo, W. B., Phillips, M. W., et al. Adrenoleukodystrophy: dietary oleic acid lowers hexacosanoate levels. Annals of Neurology. 21 (3), 232-239 (1987).
  5. Bozan, B., Temelli, F. Chemical composition and oxidative stability of flax, safflower and poppy seed and seed oil. Bioresource Tech. 99, 6354-6359 (2005).
  6. Krein, S., Meldurm, H., Hawkins, S., Foy, V. Clinical benefits of conjugated linoleic acid to 3-dimensional wrinkle morphology. J. American Academy of Dermatology. 60 (3), AB30(2009).
  7. Yu, Y., Correll, P. H., Heuvel, P. J. Conjugated linoleic acid decreases production of pro-inflammatory products in macrophages: Evidence for a PPARy dependent mechanism. Biochimica et Biophysica Acta. 1581 (3), 89-99 (2002).
  8. Palombo, J., Ganguly, A., Bistrian, B., Menard, M. The anti-proliferative effects of biologically active isomers of conjugated linoleic acid on human colorectal and prostatic cancer cells. Cancer Letters. 177, 163-172 (2002).
  9. Granda, M., Sinclair, A. J. Fatty acids and obesity. Current Pharm. Design. 15 (36), 4117-4125 (2009).
  10. Rosenstein, E., Kushner, L., Kramer, N., Kazandjian, G. Pilot study of dietary fatty acid supplementation in the treatment of adult periodontitis. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential F.A. 68 (3), 213-218 (2003).
  11. Ferretti, A., Flanagan, V. Antithromboxane activity of dietary alpha-linolenic acid: a pilot study. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids. 54 (6), 451-455 (1995).
  12. Arpita, C., Pradeep, K. D., Chowdhury, R. Effect of Fatty Acids and Cholesterol Present in Bile on Expression of Virulence Factors and Motility of Vibrio cholera. Infection and Immunity. 75 (4), 1946-1953 (2007).
  13. Yamasaki, S., Asakura, M., Neogi, S. B., Hinenoya, A., Iwaoka, E., Aoki, S. Inhibition of virulence potential of Vibrio cholerae by natural compounds. Indian J. Med. Res. 133 (2), 232-239 (2011).
  14. WHO | Efforts must be intensified to control Zimbabwe cholera outbreak [WHO PRESS RELEASE] [Internet]. , World Health Organization. Available from: http://www.who.int/csr/don/2009_01_30/en/ (2010).
  15. Hendriksen, R. S., Price, L. B., et al. Population Genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: Evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2 (4), 1-6 (2011).
  16. Schaeffler, A., Gross, P., et al. Fatty acid-induced induction of Toll-like receptor-4/nuclear factor-kappa B pathway in adipocytes links nutritional signaling with innate immunity. Immunology. 126 (2), 233-245 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи