Настоящий протокол использует радиоактивный 32 P-меченых ортофосфат следовать сотовой фосфорилирования LRRK2. Важно иметь в виду, что все операции с радиоактивными реагентами должны быть выполнены с использованием соответствующих защитных мер для минимизации воздействия радиоактивного излучения на оператора и окружающей среды. Соединения, содержащие изотопы, излучающие ионизирующее излучение может быть вредным для здоровья человека и строгой лицензирования и правил в институциональной и национального контроля над уровнем их использования. Эксперименты в этом протоколе были проведены после обучения в использовании с открытым исходным кодом излучения на Католического университета Левена (КУ Левен) и следуя хорошие руководящие принципы лабораторной практике, предоставляемые отделом здоровья, безопасности и окружающей среды в университете. Несколько шагов в нашем протоколе широко используются, например, клеточных культур, SDS-PAGE, вестерн-блоттинга и с учетом вот детали протокола как это применяется в нашей лаборатории. Он сhould отметить, что точные экспериментальные условия различаются в зависимости от лаборатории к лаборатории, поэтому конкретные меры по обеспечению надлежащего обращения радиоактивных материалов должны быть адаптированы к каждой новой лабораторных условиях. Использование с открытым исходным кодом излучения подлежит предварительному утверждению регламента и регулирующий орган отвечает за открытым исходным кодом излучения в лабораторных исследованиях варьируется от страны к стране. Пользователи должны проконсультироваться со своим институциональной офицера радиационной безопасности для того, чтобы гарантировать, что процедура соответствовать местным правилам и положениям. Информация о регулирующих органов можно найти: в Бельгии, Федерального агентства по ядерному контролю ( http://www.fanc.fgov.be , сайт на французском или голландском), в Соединенном Королевстве, здравоохранения и безопасности ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / излучение / ионизирующего / index.htm ), в Соединенных Штатах NucКомиссия Лир регулированию ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), в Канаде Канадская комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), и в Германии Das Ведомства für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Меры предосторожности, относящиеся к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивных символ трилистника ( ). 1. Метаболический Маркировка клеток Подготовка клетки для маркировки. Линии Культура HEK293T клеток в соответствии со стандартными условиями культивирования (37 ° С, 5% СО 2) в DMEM с 8% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина. Развернуть клетки достаточно, чтобыполучения по меньшей мере 1 × 10 6 клеток на образец для тестирования. Trypsinize клетки и пластины из в 6-луночные планшеты (диаметр 35 мм) на 10 6 клеток / лунку. 24 часа в сутки после посева из клетки, выразить 3xflag-LRRK2 белок через трансфекции или лентивирусный вектора опосредованной трансдукции. Для трансфекции смешивать в образце 4 мкг ДНК (pCHMWS-3xflag-LRRK2 плазмида 13-15 или pCHMWS-3xflag-LRRK1 плазмида 15) и 8 мкл линейного полиэтиленимина (PEI линейный, 1 мг / мл) в 80 мкл DMEM (без добавок ). Позвольте комплекса в течение 15-30 мин, затем добавить комплекс в клетки путем смешивания хорошо в средней настоящее время. Для лентивирусным вектора опосредованной трансдукции, развести лентивирусов вектор, кодирующий 3xflag-LRRK1 или -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, как правило, преобразовывать в два раза больше единиц преобразующих, т.е. число функциональных векторных частиц, из lentivector как есть клетки) в культуральную среду. Описание продукта ион LV-3xflag-LRRK1 / 2, была описана ранее 15. Когда клетки 80-100% сливной (около 48 ч после трансфекции или трансдукции), промыть клетки с предварительно нагретого (37 ° C) DMEM без фосфатов. Этикетка клетки с 32 P-орто-фосфата. Имейте в виду общие принципы безопасности при работе с излучением. Все операции с 32 P в назначенный район излучения. Подходит индивидуальной защиты следует носить – под стандартной процедурой в нашей лаборатории они включают халат, двойные перчатки и защитные очки. г "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Вся работа с 32 Р должны быть защищены от пользователей на 6 экранах мм Perspex сведения к минимуму воздействия. Средства личной мониторинга должны всегда использоваться – в Куала Лумпур сертифицированы пользователь с открытым исходным кодом излучение носит фильм значок, прикрепленный к нагрудном кармане халата для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов. Все экспериментальные поверхности должны быть осмотрены на предмет радиоактивности до и после использования с счетчиком Гейгера. Все потенциально зараженные расходные следует утилизировать в строгом соответствии с ведомственным руководящим принципам для РАdioactive утилизации отходов. Под ламинарного потока, подготовить трубки сокола с 2,1 мл DMEM без фосфатов (нагретого до 37 ° С) в 6-луночный планшет клеток к этикетке. Например, для обозначения клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, готовят 12,6 мл среды (= 6 х 2,1). Это необходимо для обеспечения 2 мл среды для использования в 6-луночный планшет скважины клеток с 5% избытком объема. Подготовьте скамейку, на которой будет выполняться эксперименты с ионизирующим излучением. Рабочее пространство покрыта разлива мата, на котором защитный вкладыш из впитывающего материала помещают. В случае, если вы используете лайнер с одним водонепроницаемой поверхности, поместите его с поглощающей стороной вверх. Также предусматриваетсябаночка плексигласа на рабочее место и место трубку фосфатного среде без в нем. Возьмите картонных контейнерах ведущую с флакона 32 P с надписью ортофосфатом из холодильника и довести его до радиоактивности скамейке. Монитор контейнер для внешнего радиоактивного загрязнения, используя счетчик Гейгера. Развести 32 P помечены ортофосфат в трубку DMEM без фосфатов в концентрации 24 мкКи / мл. Примечание: в 2 мл в 6-луночный планшет хорошо клеток, что соответствует 5 мкКи 32 P с надписью ортофосфатной / см 2 культивируемых клеток. Держатьтрубка в банке плексигласа. Закройте контейнер с оставшейся части 32 P помечены ортофосфатом и заменить в холодильнике. Удалить 6-луночных с клетками, которые будут помечены из инкубатора и место на радиоактивности скамейке. Удалить среднего супернатант и выбросьте. Добавить 2 мл фосфатного среде без содержащие 32 Р помечены ортофосфат / хорошо. Поместите культуру, живущую в коробку из плексигласа затем отслеживать контейнер FOг внешний радиоактивное загрязнение с помощью счетчика Гейгера. Перевести коробку Perspex с клетками в эукариотической инкубаторе клетки, посвященной изотопного обмена веществ маркировки. Инкубировать в течение 1-20 ч при 37 ° С в 5% CO 2. В общем, время включение 3 часов или более рекомендуется. Оптимальное время инкубации могут быть оценены через время курса экспериментов для каждого конкретного белка как хотелось бы. Дополнительно: лечить клетки с соединением. В экспериментах с обработки соединением (например, ингибитора киназы), шаг соединение лечение входит в систему послеitial время инкубации без соединения, чтобы позволить для маркировки. По истечении заданного времени инкубации, коробка Perspex содержащий культуральные планшеты удаляются из инкубатора и доведены до радиоактивности скамье. Маркировка среду удаляют и заменяют нагретого фосфатов среды в котором соединение разбавляют в нужной концентрации. Откажитесь среду в 50 мл трубки для сбора отходов, которая помещается в банку плексигласа. Клетки заменен в поле Perspex и помещают в клетки инкубаторе в течение требуемого времени контакта. Сбор лизаты Лабыво главе клетки. Удалите среду от клеток и выбросить в сбора отходов трубку, которая помещается в банку плексигласа. Промыть клетки 2x ледяной TBS (трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН 7,4, 2 мл / полоскания), отбрасывая промывочный раствор в сбора отходов трубки, помещенной в банке Perspex. Добавить 0,5 мл охлажденного льдом иммунопреципитации (IP) лизирующего буфера в каждую лунку и собирать лизата с помощью пипетки лизата вверх и вниз для того, чтобы ослабить все лизированных клеток. Подготовьте необходимый объем IP буфера для лизиса (0,5 мл / образца плюс 5% избыток) загодя, добавив коктейль ингибиторов протеаз и фосфатазыингибитор коктейль свежей непосредственно перед использованием. Состав буфера для лизиса является 20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон, глицерин 10%, коктейль ингибиторов протеаз и ингибиторы фосфатазы коктейль. Передача лизата в микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение по крайней мере 10 мин. Центрифуга лизатов в микроцентрифуге при> 5000 мкг в течение 10 мин. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. 2. Анализ маркировки интерес белков Изолировать интерес белок по иммуноочистки (IP). Передача микроцентрифужных пробирок с центрифугированных лизатов обратно в лед и супернатант пипеткой в микроцентрифужных трубки, содержащей 10 мкл объем слоя равновесного флаг-M2 агарозных гранулах. Подготовьте трубы с уравновешенной флаг-М2 агарозы загодя. Для этого, пипетки объем флаг-M2 агарозном суспензии, соответствующей 10 мкл объем слоя в образце плюс 5% избытком. Как правило, объем слоя 10 мкл из бисера соответствует 20 мкл суспензии. Обратитесь к спецификации продукта для более подробной информации. Равновесие бусинки промывкой 3 раза в 10 томах (по отношению к объему слоя) от IP буфере для лизиса. Распределить уравновешенные бусы равномерно в 10 мкл объем слоя / трубки на столько труб, есть образцы. Пометьте пробирки с идентификатором для каждого образца. Перенесите микроцентрифужных пробирок 50 мл пробирки (около 6 микроцентрифуги tubes/50 мл трубки), меченных радиоактивным символом трилистника и держать на льду. Образцы Переезд в поворотным устройством за щитом Perspex в назначенный район холодном помещении для конца над конце смешивания при температуре 4 ° С в течение 1-20 часов. Перенесите образцы по указанному рабочего пространства на льду. 50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Спин вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Вымойте белок связан флаг-M2 агарозном бисером ресуспендированием в 1 мл IP промывочного буфера. Состав IP промывочного буфера: Трис 25 мМ, рН 7,5, NaCl 400 мМ, Тритон 1%. Рекомендуется также включают протеазы и ингибиторы фосфатазы в буфере для стирки белков, чувствительных к деградации путем совместного очистки протеазы или дефосфорилирования путем совместной очистки фосфатаз. Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в коллективных отходовТион трубки. Повторите мыть шаг 3 раза. После промывок, ресуспендируют бисером в 1 мл IP полоскания буфера (Трис 25 мМ рН 7,5, MgCl 2 10 мм, дитиотреитол (DTT) 2 мм, Тритон 0,02%, бета-глицерофосфат 5 мМ, Na 3 VO 4 0,1 мм). Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Удалите все излишки буфера. Ресуспендируют бусины в 40 и ми; л IP образец SDS загрузочного буфера (Трис-HCl 160 мМ рН 6,8, 2% SDS, 0,2 М DTT, 40% глицерин, бромфеноловый синий 2 мг / мл). Образцы могут быть проанализированы немедленно или хранить в -20 ° C морозильнике в течение скрытых анализа. Для хранения образцов при -20 образцов ° С, место в держателей труб или коробки в коробке Perspex в радиоактивных символ трилистника с надписью морозильник, выделенной для хранения радиоактивных образцов. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. Решить образцы IP через SDS-PAGE и Блот до PVDF мембраны. Образцы тепла в загрузочном буфере до 95 ° С в течение 2 мин и центрифуги в течение 1 мин при> 1000 мкг для осаждения бусы. Подготовьте гель модуль электрофореза белка на радиоактивности скамейке позади экрана плексигласа. Образцы загружают на 3-8% Трис-ацетат гели через SDS-PAGE. Этот тип гель подходит для решения высокой молекулярной массой (ВММ) белков. Другие типы гель может быть также подходит, например, 4-20% Bis-трицин гель или трис-глицина 4-20% гели. Включить маркер молекулярной массы, который пригоден различить размеры HMW протеинов. <литий> Выполнение электрофореза при 150 V в течение 1 часа. После электрофореза удалить гель из пластиковый корпус и передать гель в контейнер с Западной блоттинга буфера передачи. Состав вестерн-блоттинга буфера передачи: Трис 50 ммоль, Глицин 40 мм, SDS 0,04%, метанол 20%. Отрезанные части геля, которые торчат такие как сепараторов скважины и нижней части геля, который торчит. Подготовка один из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембрана в гель путем погружения в метаноле в течение 1 мин, а затем поместить в буфере для переноса. Мембраны сократить к с Ame размера, что и геля плюс маржа в 3 мм. Наведите полусухого модуль блоттинга на радиоактивности скамейке и снимите крышку и верхнюю электродную пластину. Подготовьте промокательной бутерброд на поверхности полусухого блоттинга модуля. Влажный дополнительный толстый (2,5 мм толщиной, 7,5 х 10 см большой) блоттинга фильтр в буфере передачи и место на нижней пластине модуля блоттинга. Поместите предварительно мокрой PVDF мембрану на блоттинга фильтра. Осторожно поместите гель на PVDF мембрану и удалить пузырьки воздуха. 523/50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Завершить бутерброд блот путем смачивания дополнительный толстый блоттинга фильтр в буфере для переноса и место на нижней пластине промокательной модуля. Удалить весь воздух пузырьки в конечном итоге, присутствующие в промокательной бутерброд. Пожалуйста, обратите внимание, что описание дано здесь совместим с транс-блот системы SD BioRad где электроды таким образом, что белки мигрировать вниз на мембрану. Другие промокательной системы также совместимы с этих шагов с незначительными изменениями, такими как те, в конце концов нужно учитывать еще один промокательной направление или, в случае бака блоттинга, дополнительной жидких отходов, которые будут утилизировать таким же образом, как буфер для электрофореза выше. Удалите все излишки буфера с фильтровальной бумагой, и поместить верхнюю пластину и крышку полу-д ры промокательной модуль. Трансфер белки при 15 V в течение 1-2 часов. В течение этого времени очистки модуль электрофореза. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. Промойте модуль электрофореза с дистиллированной водой (AD) и меняйте воду для промывания в радиоактивной жидкости контейнер для отходов. 0523/50523rad1.jpg "/> После передачи, снимите PVDF мембрану с BLOTTED белков из модуля блоттинга. Дополнительно: выполнить Ponceau S окрашивание BLOTTED белков для визуализации белков. Перенести кляксу на мелкой блот инкубации сосуд, содержащий решение Ponceau S и выдержать в течение 5 мин. Промойте 2 раза быстрее в нашей эры. Сушат мембрану. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Выполнить авторадиографии. Expose мембрану к фосфоресценции пластины в течение 1-5 дней. Читайте Р32 прочь открытой фосфоресценции пластины с помощью Шторм 840 фосфоресценции сканер или эквивалент и сохранить изображение в качестве высокого разрешения TIFF. Обнаружение уровни белка с помощью иммунологического. Увлажняет мембран, опуская их кратко в метанол, а затем перенести в неглубокой блот инкубационного судна с PBS. </li> Блок мембран в PBS-T (PBS с 0,1% Triton), содержащего 5% молока. Инкубируйте пятна с анти-LRRK2 антител 13,16 или анти флаг антитела и процесс дальнейшего с соответствующими промывания и инкубации вторичного антитела. Выполните обнаружения хемилюминесценции для подтверждения относительные уровни белка из LRRK2. Количественная включение 32 P в LRRK2. Выполните денситометрическую анализ по полосам на клякс авторадиограмм и иммунореактивности с использованием соответствующего программного обеспечения, таких как программное обеспечение ImageJ, бесплатная программа, доступной на Национальной InstitУтес из веб-сайта здравоохранения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). Рассчитать уровни фосфата включения как отношение авторадиографического сигнала над уровнем иммунореактивности.