Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные белки, которые кодируют как GTPase и киназные домены и которые фосфорилируется в клетках. Здесь мы приводим протокол маркировать LRRK1 и LRRK2 в клетках с ³² P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения их общий уровень сотовой phophorylation.

Abstract

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются паралоги, которые разделяют подобную организацию домена, в том числе серин-треонин домена киназы, в Ras из комплексной области белков (РПЦ), С-терминала РПЦ домена (COR), и лейцин-богатый и анкириновых, как повторяется на N-конце. Точные сотовой роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации ^1,2, в то время как LRRK2 вовлечен в патогенез болезни Паркинсона ^3,4. В этом отчете мы приводим протокол маркировать белки LRRK1 и LRRK2 в клетках с ³² P ортофосфата, тем самым предоставляя средства для измерения общего уровня фосфорилирования этих 2 белков в клетках. Короче говоря, близость отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей ³² P-ортофосфат. ³² Р-ортофосфат усваивается клетками после лишь немногиеч инкубации и все молекулы в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Через аффинной метки (3xflag) в LRRK белки изолированы от других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией ⁽³² P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс. Протокол может быть легко адаптированы дл контрол фосфорилирование любой другой белок, который может быть выражено в клетках и изолированных с помощью иммунопреципитации.

Introduction

Лейцин богатых повторные киназы 1 и 2 (LRRK1 и LRRK2) являются многодоменные паралоги, которые разделяют подобную организацию домена. Оба белка кодирования последовательность GTPase сродни семьи Рас из GTPases (Ras сложных белков, или РПЦ), а также С-концу РПЦ домена (COR), эффективно классификации оба белка в семье ^5,6 ROCO белка. N-терминал доменного тандеме РПЦ-COR, оба белка кодировать лейцин-богатый повтор домен, а также в анкириновых-подобный домен, в то время как только LRRK2 кодирует дополнительный броненосца Domein ^6-8. С-конец РПЦ-COR, оба белка поделиться домен киназы серин-треонин в то время как только LRRK2 кодирует домен WD40 в С-концевой области ^8. Точные сотовые роли LRRK1 и LRRK2 до сих пор не выяснены, однако LRRK1 был вовлечен в тирозинкиназы рецептора сигнализации ^1,2, в то время как генетическая данные указывают на роли LRRK2 в патогенезе болезни Паркинсона ^3,4.

<pкласс = "jove_content"> фосфорилирования белков является общей механизм регулирования в клетках. Например, фосфорилирование может быть существенным для активации ферментов или для набора белков в комплексе сигнализации. Клеточный фосфорилирование LRRK2 широко характеризуется и отображение phosphosite показал большинство сотовой сайтов фосфорилирования произойти в кластере между повторения анкириновых и богатых лейцином повторных областей ^9-11. Хотя LRRK1 сотовой сайты фосфорилирования до сих пор не отображается, данные исследований с использованием фосфопротеин окрашивание блотов иммунопреципитации белка LRRK1 от COS7 клеток показывает, что LRRK1 белок фосфорилируется в клетках ^12.

Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с ³² P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK PROTEмодули выражены в HEK293T клеток, которые подвергаются среде, содержащей ³² P-ортофосфат. ³² Р-ортофосфат усваивается клетками только после нескольких часов инкубации и всех молекул в ячейке, содержащей фосфаты тем самым радиоактивно метили. Аффинная метка (3xflag) используется для изоляции LRRK белки из других клеточных компонентов путем иммунопреципитации. Иммунопреципитаты затем разделяют с помощью SDS-PAGE, переносили на мембраны ПВДФ и анализа объединенных фосфатов производится авторадиографией ⁽³² P сигнала) и западной обнаружения (сигнал белок) белков на клякс.

Protocol

Настоящий протокол использует радиоактивный 32 P-меченых ортофосфат следовать сотовой фосфорилирования LRRK2. Важно иметь в виду, что все операции с радиоактивными реагентами должны быть выполнены с использованием соответствующих защитных мер для минимизации воздействия радиоактивного излучения на оператора и окружающей среды. Соединения, содержащие изотопы, излучающие ионизирующее излучение может быть вредным для здоровья человека и строгой лицензирования и правил в институциональной и национального контроля над уровнем их использования. Эксперименты в этом протоколе были проведены после обучения в использовании с открытым исходным кодом излучения на Католического университета Левена (КУ Левен) и следуя хорошие руководящие принципы лабораторной практике, предоставляемые отделом здоровья, безопасности и окружающей среды в университете. Несколько шагов в нашем протоколе широко используются, например, клеточных культур, SDS-PAGE, вестерн-блоттинга и с учетом вот детали протокола как это применяется в нашей лаборатории. Он сhould отметить, что точные экспериментальные условия различаются в зависимости от лаборатории к лаборатории, поэтому конкретные меры по обеспечению надлежащего обращения радиоактивных материалов должны быть адаптированы к каждой новой лабораторных условиях. Использование с открытым исходным кодом излучения подлежит предварительному утверждению регламента и регулирующий орган отвечает за открытым исходным кодом излучения в лабораторных исследованиях варьируется от страны к стране. Пользователи должны проконсультироваться со своим институциональной офицера радиационной безопасности для того, чтобы гарантировать, что процедура соответствовать местным правилам и положениям. Информация о регулирующих органов можно найти: в Бельгии, Федерального агентства по ядерному контролю ( http://www.fanc.fgov.be , сайт на французском или голландском), в Соединенном Королевстве, здравоохранения и безопасности ( HTTP: / / www.hse.gov.uk / излучение / ионизирующего / index.htm ), в Соединенных Штатах NucКомиссия Лир регулированию ( http://www.nrc.gov/materials/miau/regs-guides-comm.html ), в Канаде Канадская комиссия по ядерной безопасности ( http://nuclearsafety.gc.ca/eng/ ), и в Германии Das Ведомства für Strahlenschutz ( http://www.bfs.de/de/bfs ). Меры предосторожности, относящиеся к этому протоколу были отмечены в тексте, выделены радиоактивных символ трилистника ( ). 1. Метаболический Маркировка клеток Подготовка клетки для маркировки. Линии Культура HEK293T клеток в соответствии со стандартными условиями культивирования (37 ° С, 5% СО 2) в DMEM с 8% эмбриональной телячьей сыворотки и гентамицина. Развернуть клетки достаточно, чтобыполучения по меньшей мере 1 × 10 6 клеток на образец для тестирования. Trypsinize клетки и пластины из в 6-луночные планшеты (диаметр 35 мм) на 10 6 клеток / лунку. 24 часа в сутки после посева из клетки, выразить 3xflag-LRRK2 белок через трансфекции или лентивирусный вектора опосредованной трансдукции. Для трансфекции смешивать в образце 4 мкг ДНК (pCHMWS-3xflag-LRRK2 плазмида 13-15 или pCHMWS-3xflag-LRRK1 плазмида 15) и 8 мкл линейного полиэтиленимина (PEI линейный, 1 мг / мл) в 80 мкл DMEM (без добавок ). Позвольте комплекса в течение 15-30 мин, затем добавить комплекс в клетки путем смешивания хорошо в средней настоящее время. Для лентивирусным вектора опосредованной трансдукции, развести лентивирусов вектор, кодирующий 3xflag-LRRK1 или -2 (LV-3xflag-LRRK1, LV-3xflag-LRRK2, как правило, преобразовывать в два раза больше единиц преобразующих, т.е. число функциональных векторных частиц, из lentivector как есть клетки) в культуральную среду. Описание продукта ион LV-3xflag-LRRK1 / 2, была описана ранее 15. Когда клетки 80-100% сливной (около 48 ч после трансфекции или трансдукции), промыть клетки с предварительно нагретого (37 ° C) DMEM без фосфатов. Этикетка клетки с 32 P-орто-фосфата. Имейте в виду общие принципы безопасности при работе с излучением. Все операции с 32 P в назначенный район излучения. Подходит индивидуальной защиты следует носить – под стандартной процедурой в нашей лаборатории они включают халат, двойные перчатки и защитные очки. г "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Вся работа с 32 Р должны быть защищены от пользователей на 6 экранах мм Perspex сведения к минимуму воздействия. Средства личной мониторинга должны всегда использоваться – в Куала Лумпур сертифицированы пользователь с открытым исходным кодом излучение носит фильм значок, прикрепленный к нагрудном кармане халата для контроля радиационного облучения в ходе экспериментов. Все экспериментальные поверхности должны быть осмотрены на предмет радиоактивности до и после использования с счетчиком Гейгера. Все потенциально зараженные расходные следует утилизировать в строгом соответствии с ведомственным руководящим принципам для РАdioactive утилизации отходов. Под ламинарного потока, подготовить трубки сокола с 2,1 мл DMEM без фосфатов (нагретого до 37 ° С) в 6-луночный планшет клеток к этикетке. Например, для обозначения клеток в каждую лунку 6-луночного планшета, готовят 12,6 мл среды (= 6 х 2,1). Это необходимо для обеспечения 2 мл среды для использования в 6-луночный планшет скважины клеток с 5% избытком объема. Подготовьте скамейку, на которой будет выполняться эксперименты с ионизирующим излучением. Рабочее пространство покрыта разлива мата, на котором защитный вкладыш из впитывающего материала помещают. В случае, если вы используете лайнер с одним водонепроницаемой поверхности, поместите его с поглощающей стороной вверх. Также предусматриваетсябаночка плексигласа на рабочее место и место трубку фосфатного среде без в нем. Возьмите картонных контейнерах ведущую с флакона 32 P с надписью ортофосфатом из холодильника и довести его до радиоактивности скамейке. Монитор контейнер для внешнего радиоактивного загрязнения, используя счетчик Гейгера. Развести 32 P помечены ортофосфат в трубку DMEM без фосфатов в концентрации 24 мкКи / мл. Примечание: в 2 мл в 6-луночный планшет хорошо клеток, что соответствует 5 мкКи 32 P с надписью ортофосфатной / см 2 культивируемых клеток. Держатьтрубка в банке плексигласа. Закройте контейнер с оставшейся части 32 P помечены ортофосфатом и заменить в холодильнике. Удалить 6-луночных с клетками, которые будут помечены из инкубатора и место на радиоактивности скамейке. Удалить среднего супернатант и выбросьте. Добавить 2 мл фосфатного среде без содержащие 32 Р помечены ортофосфат / хорошо. Поместите культуру, живущую в коробку из плексигласа затем отслеживать контейнер FOг внешний радиоактивное загрязнение с помощью счетчика Гейгера. Перевести коробку Perspex с клетками в эукариотической инкубаторе клетки, посвященной изотопного обмена веществ маркировки. Инкубировать в течение 1-20 ч при 37 ° С в 5% CO 2. В общем, время включение 3 часов или более рекомендуется. Оптимальное время инкубации могут быть оценены через время курса экспериментов для каждого конкретного белка как хотелось бы. Дополнительно: лечить клетки с соединением. В экспериментах с обработки соединением (например, ингибитора киназы), шаг соединение лечение входит в систему послеitial время инкубации без соединения, чтобы позволить для маркировки. По истечении заданного времени инкубации, коробка Perspex содержащий культуральные планшеты удаляются из инкубатора и доведены до радиоактивности скамье. Маркировка среду удаляют и заменяют нагретого фосфатов среды в котором соединение разбавляют в нужной концентрации. Откажитесь среду в 50 мл трубки для сбора отходов, которая помещается в банку плексигласа. Клетки заменен в поле Perspex и помещают в клетки инкубаторе в течение требуемого времени контакта. Сбор лизаты Лабыво главе клетки. Удалите среду от клеток и выбросить в сбора отходов трубку, которая помещается в банку плексигласа. Промыть клетки 2x ледяной TBS (трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, рН 7,4, 2 мл / полоскания), отбрасывая промывочный раствор в сбора отходов трубки, помещенной в банке Perspex. Добавить 0,5 мл охлажденного льдом иммунопреципитации (IP) лизирующего буфера в каждую лунку и собирать лизата с помощью пипетки лизата вверх и вниз для того, чтобы ослабить все лизированных клеток. Подготовьте необходимый объем IP буфера для лизиса (0,5 мл / образца плюс 5% избыток) загодя, добавив коктейль ингибиторов протеаз и фосфатазыингибитор коктейль свежей непосредственно перед использованием. Состав буфера для лизиса является 20 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% Тритон, глицерин 10%, коктейль ингибиторов протеаз и ингибиторы фосфатазы коктейль. Передача лизата в микроцентрифужных трубки и инкубировать на льду в течение по крайней мере 10 мин. Центрифуга лизатов в микроцентрифуге при> 5000 мкг в течение 10 мин. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. 2. Анализ маркировки интерес белков Изолировать интерес белок по иммуноочистки (IP). Передача микроцентрифужных пробирок с центрифугированных лизатов обратно в лед и супернатант пипеткой в ​​микроцентрифужных трубки, содержащей 10 мкл объем слоя равновесного флаг-M2 агарозных гранулах. Подготовьте трубы с уравновешенной флаг-М2 агарозы загодя. Для этого, пипетки объем флаг-M2 агарозном суспензии, соответствующей 10 мкл объем слоя в образце плюс 5% избытком. Как правило, объем слоя 10 мкл из бисера соответствует 20 мкл суспензии. Обратитесь к спецификации продукта для более подробной информации. Равновесие бусинки промывкой 3 раза в 10 томах (по отношению к объему слоя) от IP буфере для лизиса. Распределить уравновешенные бусы равномерно в 10 мкл объем слоя / трубки на столько труб, есть образцы. Пометьте пробирки с идентификатором для каждого образца. Перенесите микроцентрифужных пробирок 50 мл пробирки (около 6 микроцентрифуги tubes/50 мл трубки), меченных радиоактивным символом трилистника и держать на льду. Образцы Переезд в поворотным устройством за щитом Perspex в назначенный район холодном помещении для конца над конце смешивания при температуре 4 ° С в течение 1-20 часов. Перенесите образцы по указанному рабочего пространства на льду. 50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Спин вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Вымойте белок связан флаг-M2 агарозном бисером ресуспендированием в 1 мл IP промывочного буфера. Состав IP промывочного буфера: Трис 25 мМ, рН 7,5, NaCl 400 мМ, Тритон 1%. Рекомендуется также включают протеазы и ингибиторы фосфатазы в буфере для стирки белков, чувствительных к деградации путем совместного очистки протеазы или дефосфорилирования путем совместной очистки фосфатаз. Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в коллективных отходовТион трубки. Повторите мыть шаг 3 раза. После промывок, ресуспендируют бисером в 1 мл IP полоскания буфера (Трис 25 мМ рН 7,5, MgCl 2 10 мм, дитиотреитол (DTT) 2 мм, Тритон 0,02%, бета-глицерофосфат 5 мМ, Na 3 VO 4 0,1 мм). Спином вниз белок связан флаг-M2 агарозном бисером в микроцентрифуге (1000 XG, 1 мин) и отбросить супернатант в сбора отходов трубки. Удалите все излишки буфера. Ресуспендируют бусины в 40 и ми; л IP образец SDS загрузочного буфера (Трис-HCl 160 мМ рН 6,8, 2% SDS, 0,2 М DTT, 40% глицерин, бромфеноловый синий 2 мг / мл). Образцы могут быть проанализированы немедленно или хранить в -20 ° C морозильнике в течение скрытых анализа. Для хранения образцов при -20 образцов ° С, место в держателей труб или коробки в коробке Perspex в радиоактивных символ трилистника с надписью морозильник, выделенной для хранения радиоактивных образцов. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. Решить образцы IP через SDS-PAGE и Блот до PVDF мембраны. Образцы тепла в загрузочном буфере до 95 ° С в течение 2 мин и центрифуги в течение 1 мин при> 1000 мкг для осаждения бусы. Подготовьте гель модуль электрофореза белка на радиоактивности скамейке позади экрана плексигласа. Образцы загружают на 3-8% Трис-ацетат гели через SDS-PAGE. Этот тип гель подходит для решения высокой молекулярной массой (ВММ) белков. Другие типы гель может быть также подходит, например, 4-20% Bis-трицин гель или трис-глицина 4-20% гели. Включить маркер молекулярной массы, который пригоден различить размеры HMW протеинов. <литий> Выполнение электрофореза при 150 V в течение 1 часа. После электрофореза удалить гель из пластиковый корпус и передать гель в контейнер с Западной блоттинга буфера передачи. Состав вестерн-блоттинга буфера передачи: Трис 50 ммоль, Глицин 40 мм, SDS 0,04%, метанол 20%. Отрезанные части геля, которые торчат такие как сепараторов скважины и нижней части геля, который торчит. Подготовка один из поливинилиденфторида (ПВДФ) мембрана в гель путем погружения в метаноле в течение 1 мин, а затем поместить в буфере для переноса. Мембраны сократить к с Ame размера, что и геля плюс маржа в 3 мм. Наведите полусухого модуль блоттинга на радиоактивности скамейке и снимите крышку и верхнюю электродную пластину. Подготовьте промокательной бутерброд на поверхности полусухого блоттинга модуля. Влажный дополнительный толстый (2,5 мм толщиной, 7,5 х 10 см большой) блоттинга фильтр в буфере передачи и место на нижней пластине модуля блоттинга. Поместите предварительно мокрой PVDF мембрану на блоттинга фильтра. Осторожно поместите гель на PVDF мембрану и удалить пузырьки воздуха. 523/50523rad1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Завершить бутерброд блот путем смачивания дополнительный толстый блоттинга фильтр в буфере для переноса и место на нижней пластине промокательной модуля. Удалить весь воздух пузырьки в конечном итоге, присутствующие в промокательной бутерброд. Пожалуйста, обратите внимание, что описание дано здесь совместим с транс-блот системы SD BioRad где электроды таким образом, что белки мигрировать вниз на мембрану. Другие промокательной системы также совместимы с этих шагов с незначительными изменениями, такими как те, в конце концов нужно учитывать еще один промокательной направление или, в случае бака блоттинга, дополнительной жидких отходов, которые будут утилизировать таким же образом, как буфер для электрофореза выше. Удалите все излишки буфера с фильтровальной бумагой, и поместить верхнюю пластину и крышку полу-д ры промокательной модуль. Трансфер белки при 15 V в течение 1-2 часов. В течение этого времени очистки модуль электрофореза. Утилизация радиоактивных отходов в специальных мусорных баков, которые хранятся за Perspex щитов. Промойте модуль электрофореза с дистиллированной водой (AD) и меняйте воду для промывания в радиоактивной жидкости контейнер для отходов. 0523/50523rad1.jpg "/> После передачи, снимите PVDF мембрану с BLOTTED белков из модуля блоттинга. Дополнительно: выполнить Ponceau S окрашивание BLOTTED белков для визуализации белков. Перенести кляксу на мелкой блот инкубации сосуд, содержащий решение Ponceau S и выдержать в течение 5 мин. Промойте 2 раза быстрее в нашей эры. Сушат мембрану. / Files/ftp_upload/50523/50523rad1.jpg "/> Выполнить авторадиографии. Expose мембрану к фосфоресценции пластины в течение 1-5 дней. Читайте Р32 прочь открытой фосфоресценции пластины с помощью Шторм 840 фосфоресценции сканер или эквивалент и сохранить изображение в качестве высокого разрешения TIFF. Обнаружение уровни белка с помощью иммунологического. Увлажняет мембран, опуская их кратко в метанол, а затем перенести в неглубокой блот инкубационного судна с PBS. </li> Блок мембран в PBS-T (PBS с 0,1% Triton), содержащего 5% молока. Инкубируйте пятна с анти-LRRK2 антител 13,16 или анти флаг антитела и процесс дальнейшего с соответствующими промывания и инкубации вторичного антитела. Выполните обнаружения хемилюминесценции для подтверждения относительные уровни белка из LRRK2. Количественная включение 32 P в LRRK2. Выполните денситометрическую анализ по полосам на клякс авторадиограмм и иммунореактивности с использованием соответствующего программного обеспечения, таких как программное обеспечение ImageJ, бесплатная программа, доступной на Национальной InstitУтес из веб-сайта здравоохранения ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ). Рассчитать уровни фосфата включения как отношение авторадиографического сигнала над уровнем иммунореактивности.

Representative Results

Для того чтобы сравнить общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клетках, 3xflag отмеченных LRRK1 и LRRK2 были выражены в HEK293T клеток 15. Клетки культивировали в 6-луночные планшеты и метили 32 Р и анализировали, как описано выше в тексте протокола. Рисунок 1 показывает репрезен…

Discussion

Эта статья обеспечивает базовый протокол для опробования общий уровень фосфорилирования LRRK1 и LRRK2 в клеточных линиях с использованием метаболического маркировку с ³² P-ортофосфатом. Общая стратегия очень проста. Affinity отмеченных LRRK белки экспрессируются в HEK293T клеток, которые подв…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Phosphorus-32 Radionuclide, 1 mCi, buffer disodiumphosphate in 1 ml water	Perkin Elmer	NEX011001MC
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) (1X), liquid (high glucose)	Invitrogen	11971-025	This medium contains no phosphates
Anti Flag M2 affiinty gel	Sigma	A2220	For an equivalent product with red colored gel (useful to more easily visualize the beads), use cat. No. F2426.
Extra thick blotting filter	Bio-Rad	1703965
Ponceau S solution	Sigma	P7170