Живая съемка Пробирной для оценки роли Са<sup&gt; 2 +</sup&gt; И сфингомиелиназы в Ремонт порообразующих токсинного ран

Краткое содержание

Живая съемка клеток, подвергнутых воздействию липофильном красителя FM1-43 позволяет точно определить кинетики с помощью которого порообразующие токсины удаляются из плазматической мембраны. Это чувствительным анализом, который может быть использован для оценки требований к Ca ^{2 +,} сфингомиелиназы и других факторов на плазменной ремонта мембраны.

Аннотация

Мембрана травмы плазменным является частым событием, и раны должны быть быстро восстановлены для обеспечения выживания клеток. Приток Ca ^{2 +} является ключевым событием сигнализации, который вызывает ремонт механических ран на плазматической мембране в пределах ~ 30 сек. Недавние исследования показали, что клетки млекопитающих также запечатать их плазматическую мембрану после пермеабилизации с пор формирования токсины в Ca ^{2 +-зависимой} процесс, который включает экзоцитоз в сфингомиелиназы лизосомальный фермент кислоты с последующим пор эндоцитоза. Здесь мы описываем методологию, используемую для демонстрации того, что Пересчет ячеек пермеабилизированных по токсин стрептолизином O также быстрое и зависит от Ca ^{2 +} притока. Конструкция анализ позволяет синхронизировать случае травмы и точное кинетическое измерение способности клеток для восстановления целостности мембраны плазмы путем визуализации и количественного определения степени, в какой liphophilic краситель FM1-43 достигает внутриклеточных мембран. Этот живой лов анализовO позволяет чувствительным оценка способности экзогенно добавленные растворимых факторов, таких как сфингомиелиназы ингибировать FM1-43 притока, отражающий способность клеток восстанавливать их плазматической мембране. Этот анализ позволил нам показывают впервые, что сфингомиелиназы действует ниже Ca ^{2 +-зависимого} экзоцитоза, поскольку внеклеточный добавление фермента способствует восковые колпачки с точными клеток проницаемыми в отсутствие Ca ^{2 +.}

Введение

Она была известна в течение нескольких десятилетий, что плазматическая мембрана ремонт после механических повреждений является Са ^{2 +-зависимый} процесс ^1,2. Более поздние исследования показали, что Са ^{2 +} приток через рану вызывает энергичную процесс экзоцитоза внутриклеточных везикул на месте травмы, которая необходима для опечатывания ^3,4. Скорость потери флуоресцентным красителем, загруженного в цитоплазме клеток использовали для оценки скорости ремонта, и пришли к выводу, что опечатывания был завершен в течение <30 сек после травмы ^5. Две модели были изначально предложены для объяснения требование экзоцитоза в плазмалеммы ремонта: 1) модель "патч", который предположил, что Са ^{2 +} приток через поражения вызывает первоначально гомотипическую слияние внутриклеточных везикул, образуя большой "патч", что бы затем применяться к плазменной мембране, чтобы запечатать рану ⁶ и 2) модель уменьшения напряженности, в котором предлагается, что мембраны Addeд по Ca ^{2 +-зависимой} экзоцитоза в непосредственной близости от раны приведет к сокращению ПЛАЗМАЛЕММЫ напряжение, облегчая восковые колпачки с точными бислоя ^7. Роль Ca ^{2 +} вызвало экзоцитоза в плазме ремонта мембраны получила дальнейшее развитие в исследованиях, показывающих, что лизосомы содержат молекулу Са ^{2 +} датчик, Synaptotagmin VII, что облегчает их экзоцитоза и плазменный ремонт мембранной в поврежденных клетках ^8,9,10,11 .

Тем не менее, дополнительные доказательства показали, что в одиночку экзоцитоза не было достаточно, чтобы способствовать плазменный ремонт мембраны. В дополнение к механическим слезы на плазматической мембране, частая форма повреждения клеток является пермеабилизации по порообразующих токсинов, продуцируемых бактериями ^12,13 или ^14,15 иммунных клеток. В отличие от механических слез, порообразующие белки включить себя на плазматической мембране формирования стабильного белка, вдоль поры, которые не могут быть опечатана просто путем применения мембраны "заплату" или сокращеING мембраны напряжение. Интересно, что исследования показали, что клетки млекопитающих имеют эффективный механизм для восстановления их плазматическую мембрану после пермеабилизации с порообразующих белков, и этот процесс также требует присутствия внеклеточного Ca ^{2 + 12.} Это открытие поднял вопрос о том, был также удаление трансмембранного пор от поверхности клетки быстрый процесс, как это наблюдается с механическими ран ^5. Удивительно, но наши последние исследования показали, что Пересчет ячеек пермеабилизированных с порообразующих токсинов имеет очень похожие свойства ремонта механических ран: процесс требует внеклеточного Са ^{2 +,} и завершается в течение ~ 30 сек. Исследуя этот процесс более подробно, мы недавно узнали, что в дополнение к Ca ^{2 +-регулируемого} экзоцитоза лизосом, плазматическая мембрана ремонт включает в себя быстрое форму эндоцитоза, который срабатывает при выпуске лизосомальных ферментов кислоты сфингомиелиназу (ASM) и имеет важное значение не только для гое удаление трансмембранных пор, но и для ремонта механических ран ^16.

Для определения кинетики клеток опечатывания после пермеабилизации с порообразующих белков, в нашей лаборатории мы адаптировали живой методологию формирования изображения, которая использовалась ранее для оценки восковые колпачки с точными лазерных повредил изолированных мышечных волокон ^17. Этот анализ основан на использовании свойств липофильного красителя FM1-43, который стабильно встраивается в наружном листке липидных бислоев увеличением интенсивности флуоресценции. Когда плазма мембраны двухслойная нарушается прибыль внеклеточных краситель доступ к внутриклеточным мембран, обеспечивая чувствительного анализа для обнаружения плазменный травмы мембраны и ремонт ^18,16,19,20. Чтобы адаптировать этот анализ для оценки клеточной проницаемости после повторной герметизации с порообразующих протеинов, мы предварительно инкубировали клетки при 4 ° С с бактериальным токсином стрептолизином O (SLO), который связывается с мембраной холестерина ^21. Синхронный клетокпермеабилизации затем может быть легко достигнуто путем перемещения клетки от льда, чтобы нагреть среду в отапливаемом столике микроскопа, который активизирует олигомеризации и изменение конформации, что приводит к образованию трансмембранные пор. Преимущество этого подхода, более ранее опубликованных анализов с помощью лазерного ранения, в том, что большее число клеток могут анализироваться одновременно в микроскопической области, обеспечивая лучшую выборки клеточной популяции. Учитывая механистические сходство между процессом клеток опечатывания видел после механической травмы и проницаемости с порообразующих токсинов, анализ мы описываем здесь обеспечивает очень универсальный и мощный метод для рассечения факторы, влияющие на фундаментального процесса плазменной ремонта мембраны. В качестве примера, мы показываем, что можно использовать этот анализ для выявления Са ^{2 +} зависимые и независимые этапы процесса ремонта.

Протокол

1. Транскрипции Подавление АНМ

1. Семя 1,5 х 10 ⁵ клеток HeLa в 2 мл питательной среды DMEM (DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, 1% Penn-Strep) на 35 мм со стеклянным дном посуды (Маттек) и Выдержите в течение ночи при 37 ° С в 5% СО ₂ инкубатора.
2. На следующий день, аспирации от питательной среде и заменить его 2 мл DMEM снижение сывороточного среде (DMEM с 4% FBS), по крайней мере, 1 ч перед добавлением трансфекции смесь миРНК.
3. Подготовьте 4 трубы для миРНК олиго трансфекции смеси. В трубы А и С, добавить 250 мкл OptiMEM снижение сыворотки и 4 мкл Липофектамин RNAiMax, за 35 мм блюдо будет трансфицированной. В трубке B, добавить 250 мкл Optimem уменьшается сыворотки и 8 мкл (160 пмоль) управления средним содержанием GC олиго (управления миРНК), за 35 мм блюдо будет трансфицированной. В трубы D, добавить 250 мкл Optimem уменьшается сыворотки и 8 мкл (160 пмоль) SMPD1 олиго (siASM), за 35 мм блюдо то трансфицировать. Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 5 мин.
4. Комбинат труб А и В, чтобы сформировать трансфекции комплекс для управления миРНК и трубки В и Г для АНМ миРНК. Инкубируйте реакции при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Добавьте управления миРНК и ASM миРНК реакции трансфекции смеси медленно, по каплям, в соответствующие 35-мм со стеклянным дном блюда и инкубировать при температуре 37 ° C / 5% CO _2. В 24 ч после трансфекции, мягко аспирации от средств массовой информации и заменить свежей питательной среды DMEM. Для эффективного ASM нокдаун, блюда следует дополнительно инкубировали при 37 ° C / 5% CO ₂ в течение примерно 31 ч (всего 55 ч) до живого изображения.

2. Подготовка реагентов для живых микроскопии

1. Готовят раствор рекомбинантного порообразующий токсина стрептолизином O (SLO) в концентрации 100 нг / мкл в холодной 1x PBS без Са ^{2 +} и Mg ^{2 +.} СЛО используется в этих анализах является constitutivelу активным цистеин мутант, который не требует восстановителей для деятельности, любезно предоставлены доктором Родом Tweten, Университет Оклахомы. Было высказано токсин в E. палочка BL21 DE3 и очищали при нативных условиях, как описано выше ^16.
2. Подготовьте исходный раствор FM1-43: Ресуспендируйте FM1-43 лиофилизированный порошок в ДМСО, чтобы создать решение 25 мм.
3. Подготовка Раствор А: Развести FM1-43 маточного раствора в холодную DMEM с Са ^{2 +} в конечной концентрации 4 мкМ (1,5 мл необходимых в Маттек блюдо) и хранить на льду до использования.
4. Получают раствор B: Развести FM1-43 маточного раствора в холодную DMEM без Ca ^{2 +} и 10 мМ EGTA (Са ^{2 +-свободный} DMEM) до конечной концентрации 4 мкМ (1,5 мл, необходимые в Маттек блюдо) и хранить на льду до необходимости.
5. Предварительно теплой (37 ° С) 1 мл аликвоты раствора А и раствора В в пробирки Эппендорфа.
6. Держите на льду решений DMEM с Ca ^{2 +,} и C^{2 +} без DMEM.

3. Живых изображений сотовый из FM1-43 приток в SLO обработанных и необработанных клеток

1. Заполните размер среднего мелкий металлический контейнер с колотым льдом, инвертировать его в большой стеклянной таре со льдом и добавить дополнительный лед оставив только нижнюю поверхность металлического контейнера подвергается. Наведите влажное бумажное полотенце на открытой металлической нижней части, чтобы позволить даже термотрансферной.
2. Возьмите одну Контроль миРНК обработанной Маттек блюдо (образец 1) и поместите его на холодном мокром бумажном полотенце. Осторожно аспирации от всех средств массовой информации и промыть 3 раза с холодной Ca ^{2 +} свободного DMEM. После последней промывки, аспирация от всех средств массовой информации в блюдо.
3. Чтобы изображение клеток связано FM1-43 в клетках, не имеющих SLO ранения (образец 1) в присутствии ^{Са2 +,} добавьте 180 мкл холодного раствора B в центр покровным стеклом 35-мм со стеклянным дном тарелки и инкубировать в течение 5 мин на льду (табл. 1).
4. Наведите Маттек блюдо на сцене конфокальной микроскопии, нагретой до 37 ° С и оснащены камере искусственного климата (который поддерживает температуру, влажность и со ₂ уровня). Найдите поле ячеек, которые будут отображаемого глядя через 40X NA 1.3 объектива (Nikon). Если возможно, включать PerfectFocus или аналогичного устройства для коррекции температурного дрейфа.
5. Добавить 1 мл предварительно нагретого раствора А осторожно в сторону 35-мм чашку и заменить крышку климатическую камеру (табл. 1).
6. Получение изображений для 4 мин со скоростью 1 кадр каждые 3 секунды с помощью соответствующего программного обеспечения обработки изображений (Volocity в UltraView Vox Perkin Elmer вращающийся диск конфокальной микроскопии системы). Возбуждение FM1-43 осуществляется с 488 нм лазерной линии с помощью дихроичный фильтр с перевала в 488 нм полосы, и дискриминация выбросов достигается за счет использования фильтра с 527 (W55) излучения. Уровни мощности лазера и чувствительность камеры установлены для достижения воздействия Изображение 100 мс.
7. Повторите этапы от 3,2 до 3,6, чтобы обнаружить FM1-43 в контрольной миРНК-обработанных клеток, не SLO ранения (образец 2) в отсутствие ^{Са2 +,} за исключением того, что на шаге 3.5 Раствор B должны быть добавлены (табл. 1).
8. Для измерения FM1-43 приток в управления миРНК-обработанных клеток раненых с SLO либо в присутствии (образец 3) или в отсутствие ^{Са2 +} (образец 4), добавьте 180 мкл холодного раствора B, содержащих SLO в центр покровным стеклом из 35-мм со стеклянным дном блюдо и выдержать в течение 5 мин на льду, как в шаге 3.3. Повторите шаги 3,2 через 3,6; настроить добавления или решения А или Устранение B на шаге 3.5 (табл. 1).
9. Для определения роли АНМ в плазме ремонта мембраны, повторите шаги 3.2-3.6 используя ASM миРНК обработанных клеток для всех условий (образцы 5-8) (табл. 1).
10. Для определения роли внеклеточной рекомбинантного сфингомиелиназы (SM) наКинетика плазмы ремонта мембраны (отраженные от торможения в FM1-43 притока) (образцы 9-10), SM добавляется (0-50 мкЕд) либо раствор или раствор B на шаге 3.5 и затем добавляли к клеткам в течение живой клетке изображений в общем объеме 1 мл (табл. 1).

4. Количественная оценка FM1-43 приток в клетках

1. После фильмов были приобретены, измерения внутриклеточной интенсивности флуоресценции FM1-43 с помощью анализа изображений программное обеспечение (Volocity Люкс, PerkinElmer). Нарисуйте область интереса в цитозольной области каждой ячейки в области и применять программные средства для определения среднего FM1-43 интенсивность флуоресценции всей всех кадрах видео.
2. Для регулировки вариации в начальной FM1-43 окрашивания, данные для каждого видео выражается как кратное увеличение интенсивности флуоресценции с течением времени, и нанесены для каждого отдельного состоянии. Кратное увеличение флуоресценции каждой отдельной временной точке вклеток рассчитывается как F _T / F _0, где F _T является среднее флуоресценции в конкретной временной точке, и F ₀ является средним флуоресценции при Т = 0 (рисунки 1-2).

Результаты

Низкие концентрации бактериальной сфингомиелиназы (SM) спасательные плазмы мембраны ремонта в клетках обедненных сфингомиелиназы лизосомальных кислоты.

Использование FM1-43 формирования изображения анализа, ранее мы показали, что клетки с дефицитом для лизосомальных ферментов АНМ и воздействию SLO ранение в присутствии Ca ^{2 +} у плазматической мембраны дефект спасает внеклеточного добавлением рекомбинантного человеческого фермента ^19. Так как человеческий лизосомальный ASM ...

Обсуждение

Более ранние исследования на механической травмы и плазмалеммы ремонта полагались на различных механизмов, вредящих клеток, начиная от падения стеклянные бусы, micropipetting, отрезные, царапин или выскабливание. Показания всех этих анализов была качественной, а не количественной, а не дать точную информацию о кинетики механизма восстановления. Способность клеток запечатать их плазматическую мембрану после этих форм травмы измерялась наличия или отсутствия индикаторов, добавленных к внеклеточной жидкости в цитоплазме, п...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Reagent
HeLa 229 клеточная линия	ATCC	CCL2-1
DMEM High Glucose	Invitrogen	11965
DMEM High Glucose No Calcium	Invitrogen	20168
FM1-43	Invitrogen	T3163
Optimem Сниженный уровень сыворотки	Invitrogen	31985
Липофектамин РНКиМакс	Инвитроген	13778
Контрольная среда Содержание GC РНКи олиго	Инвитроген	12935300
SMPD1 РНКи олиго	Инвитроген	HSS143988
Фетальная бычья сыворотка Термоинактивированные	Gemini-Bioproducts	100-106
Сфингомиелиназы из Bacillus cereus	Sigma	S7651
Стеклянная нижняя посуда 35 мм	MatTek	P35G-0-14
Material
Инвертированный микроскоп	Nikon	Eclipse Ti
Camera	Hamamatsu Photonics	C9100-50
Вращающийся диск конфокальный микроскоп	PerkinElmer	UltraViewVoX
Программный анализ программное обеспечение	PerkinElmer	Volocity Suite
Камера окружающей среды	Патологоанатомические устройства	Система LiveCell Камера