Методическая статья

Экспертиза синаптических пузырьков переработка Использование FM Красители Во вызвали, спонтанный, и миниатюрных Synaptic деятельности

20.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50557

⸱

31 марта 2014 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Biology & Biochemistry, University of Bath

В этой статье

Краткое содержание

Мы описали использование стирил FM красителей к фотографиям синаптической переработки пузырьков в функциональных нервных окончаний. Этот протокол может быть применен не только к вызвала, но и спонтанным и миниатюрные синаптические деятельности. Протокол расширяет множество синаптических событий, которые могут быть эффективно оценены.

Аннотация

Синаптические пузырьки в функциональных нервных окончаний пройти экзоцитоза и эндоцитоза. Это синаптической переработки пузырьков может быть эффективно проанализированы с использованием стирил FM красители, которые показывают оборот мембраны. Обычные протоколы для использования FM красителей были разработаны для анализа нейроны следующее стимулированного (вызывали) синаптической активности. В последнее время протоколы стали доступны для анализа FM сигналы, которые сопровождают более слабые синаптические мероприятия, такие как спонтанных или декоративные синаптических событий. Анализ этих небольших изменений в ЧМ-сигналов требует, чтобы система визуализации достаточно чувствительным, чтобы обнаружить небольшие изменения в интенсивности, пока что артефактом изменения большой амплитуды подавлены. Здесь мы опишем протокол, который может быть применен к вызывали, спонтанный, и миниатюрные синаптические деятельности, и использовать культивированный нейронов гиппокампа в качестве примера. Этот протокол также включает в себя средство оценки темпов фотообесцвечивания FM красителей, так как это является важнымисточником артефактов при визуализации небольшие изменения в интенсивности.

Введение

Функциональность синаптических пузырьков является важным фактором, определяющим синаптической передачи. Эти пузырьки выпустить нейротрансмиттеров, когда они сливаются с пресинаптической мембраны плазмы (экзоцитоза), и они становятся готовы к следующему циклу выпуска после возрождается из плазматической мембраны (эндоцитоза) и перезагружается нейромедиатора. Исследование динамики и механизмов, лежащих в основе синаптической переработки пузырьков была значительно ускорен путем введения стирил FM красителей 1. Эти амфипатические молекулы, которые положительно заряженные гидрофильные группы головы и гидрофобные хвосты (несколько красителей на фиг.1А, stereoview из FM1-43 в рисунке 1b), может обратимо входить и выходить из липидные мембраны без проникая их. Группы FM красителей имеют сходные черты, которые влияют на выбор света, который они излучают. Например, FM2-10, FM1-43, и FM1-84 имеют одну двойную связь между двумя циклических соединений и шож зеленый выбросов. Различие между ними есть длина гидрофобной хвоста, который определяет его гидрофобности и поэтому скорость выхода из мембраны (departitioning). В случаях FM5-95 и FM4-64, три двойные связи связать циклические соединения, и они показывают красного излучения. Эти красители отличаются в отношении их гидрофильных частей. Во всех FM красителей, интенсивность флуоресценции возрастает, когда они вставляются в биологические мембраны, в связи с увеличением квантового выхода в гидрофобной среде по отношению к гидрофильной среде. Таким образом, изменения в интенсивности FM представляют изменения в обороте мембраны. Различные цвета (спектры излучения) и гидрофобностей сделать FM красители универсальный исследовательский инструмент в синаптической переработки пузырьков.

Исходя из этих особенностей, то FM красители в основном используются в соответствии со следующей схемой при анализе синаптической переработки везикул (рис. 2). Нейронс купаются в внеклеточного раствора, содержащего FM красителя, что позволяет ему быть взят на синаптических пузырьков (SVS), поскольку они формируют с помощью эндоцитоза (окрашивание). Краситель затем вымываются нанесением раствора внеклеточный красителей; это показывает, функциональные нервные окончания, т.е. только тех, кто активно проходит эндоцитоз будет содержать кластер синаптических пузырьков, которые загружаются с красителем (рис. 2 внизу). После экзоцитоз приводит к потере красителя FM во внеклеточное пространство и сопутствующей потерей флуоресценции (обесцвечивани; как за счет departitioning к гидрофильной среде и диффузии вдали от места экзоцитоза). Поэтому изменения в интенсивности флуоресценции FM являются индикаторами синаптических пузырьков экзо-и эндоцитоза.

FM красители были использованы для окрашивания и destain синаптические везикулы в различных организмов и препаратов 2,3. Примеры включают Neur млекопитающихрных культуры 4-9, млекопитающих ломтики мозга 10,11, нервно-мышечных синапсах 12,13, сетчатки биполярные нейроны 14,15 и волосковые клетки улитки 16.

Как правило, в таких экспериментах, как окрашивание и обесцвечивани вызваны широко стимулируя нейроны (вызывали активности). Однако в последнее время синаптической переработки пузырьков в ответ на слабый стимуляции также были проанализированы, как и утилизации в отсутствие внешнего стимула (спонтанное и миниатюрный синаптической активности) 9,17-19. Спонтанные и миниатюрные синаптические деятельности определяются как те, которые происходят в отсутствие внешних раздражителей, с бывшим участием спонтанное стрельбу из потенциалов действия (рис. 3). Эти слабые синаптические действия, связанные с небольших изменений в ЧМ-сигналов, чем те, вызваны обширной стимуляции. Измерение требует, чтобы изменения в FM fluorescИнтенсивность ENCE точно отражают синаптических пузырьков экзоцитоза или эндоцитоз, но не артефактом изменения в интенсивности. Одной из причин артефакта является наличие неспецифическое окрашивание плазматической мембраны ЧМ красителей. Постепенное вымывание этого компонента приведет к постепенному изменению измеряемой интенсивности флуоресценции, который будет ошибочно приписывают синаптических деятельности. Этот фактор может быть уменьшена с помощью соответствующих методов (см. протокол). Наиболее заметным причиной артефакта является фотообесцвечивания FM красителя сохраняется в синаптических пузырьков. Изменения Фотообесцвечивания связанных в FM интенсивности должно быть мало по сравнению с биологическими (синаптических) изменений, которые оцениваются. Недавнее развитие чувствительных камер, например, электрон-умножения прибор с зарядовой связью (EMCCD) камеры, позволяет свести к минимуму фотообесцвечивания за счет сокращения времени экспозиции и ослабление интенсивности света, используемого для возбуждения флуорофора. Еще одной причиной артефакта является дрейф ян фокусировки уровень светового микроскопа. В центре дрейф во время сеанса изображения может быть вызвано механическими или термическими эффектами, и будет ошибочно привести к изменению интенсивности флуоресценции, измеренной.

Здесь мы описываем протоколы и оборудование, которые делают возможным использование FM красителей для анализа синаптической переработки везикул даже в контексте слабой или вообще без стимуляции, в частности, миниатюрные синаптической активности. Мы показываем примеры окрашивания и обесцвечивани пузырьков во время вызвала и спонтанных синаптических событий, используя культивируемых нейронов гиппокампа грызунов, и отображения фазы обесцвечивани. Мы также продемонстрируем, как оценить степень фотообесцвечивания красителя FM, в отсутствие каких-либо потерь FM красителя из-за синаптических деятельности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Первичная культура нейронов от млекопитающих мозг

Все животные процедуры, выполняемые в данном исследовании утверждаются Институциональная уходу и использованию животных комитета в Университете штата Айова по.

  1. Подготовьте диссоциированную клеточную культуру регионов СА3-СА1 гиппокампа мышей и крыс на послеродовых дней 0-1 19,20. Пластина клеток гиппокампа на 12-мм покровные (толщина номер 0) автоматизированы с фидерного слоя крысы глиальных, в 24-луночные планшеты, и при плотности 12000 клеток / лунку.
  2. Культура как нейроны гиппокампа, по крайней мере 8 дней для функциональных нервных окончаний развивать 21. Мы используем нейроны на 11-14 дней в пробирке, когда отдельные нервные терминалы относительно изолированными без особого кластеризации. Нейроны могут быть использованы для экспериментов до приблизительно 21-28 дней в пробирке например Willig соавт. 22 и Носырева и Kavalali 23.
  3. Дляфункциональные исследования, оценить покровные (до окрашивания) для показателей здоровых нейронов использованием проходящего света микроскопии (например, контрастная оптика фазы при увеличении 10-20X). Показатели здоровья относятся: равномерное глиальных слой клеток, четкое сотовой поля вокруг нейронов, расширенные дендриты без бисером структур, отсутствие кластерной somata, и отсутствие в комплекте невриты.

2. Загрузка синаптических пузырьков с FM Dye (окрашивание)

  1. Окрашивание в связи с синаптической активности вызванной электрической стимуляцией поля (включает потенциалы действия)
    1. Подготовка окрашивания раствор 1, добавив FM красителя в раствор красителя без ГЭПЭС основе, решение например Тирода (см. РЕШЕНИЯ для деталей). Концентрация FM красителя 10 мкмоль FM1-43 и 2,5 мкМ FM4-64. Типичные диапазоны концентраций являются: 2-15 мкМ FM1-43, или 2,5-20 мкМ FM4-64 3,6. Для проведения экспериментов, требующих подавления периодическихглутаматергической синаптической активности и индукция синаптической пластичности, далее добавить антагонисты ионотропных рецепторов глутамата: АМРА-рецепторы (например, 10 мкМ CNQX) и рецепторов NMDA (например, 50 мкМ AP5).
    2. Передача покровное с клеток от культуральной среды в камеру обработки изображений предварительно заполненный раствором простушек Тирода. Мы используем изображения камеры со стимуляцией электродов, прикрепленных к боковым стенкам (платиновые проволоки, разделенные 6,3 мм, RC-21BRFS). Эта камера выполнена в виде закрытой камере обработки изображений, но использовать его в качестве открытой камере (т.е. без верхней покровное), с объемом ванны ~ 200 мкл. Во время передачи, не подвергайте культивируемых клеток к воздуху, и избежать защемления культивируемых клеток с помощью пинцета (выбрать покровное вверх с периметра, а не рядом с центром).
    3. Заливать изображения камеры раствором простушек Тирода при комнатной температуре (23-25 ​​° C).
    4. Применить окрашивания раствор 1 по сотрудничествуnstant перфузии.
    5. Вызывание синаптической активности, применяя электрические импульсы. Для максимального окрашивания общего пула переработки синаптических пузырьков в нейронах гиппокампа, стимулировать культур при 10 Гц для 60-120 с 24. При попытке достичь максимальной эффективности поля стимуляции, держать несколько функций в виду. 1) Высота ванны решение должно быть настолько низким, насколько это возможно, сохраняя при этом нейроны и стимулирующие электроды полностью погружены в тонком слое раствора Тирода (в того, чтобы сохранить нейронов живыми и получения однородной электрическое поле). 2) Сила тока и длительность должна быть оптимизирована с использованием индикатора возбудимости нейронов, например, флуоресцентного Са 2 + изображений, в нашем случае, постоянный ток интенсивности 30 мА и 1 мсек дает надежные результаты. 3) Раствор ванны следует применять при постоянной скорости потока во время стимуляции; электростимуляция приводит к электролизу, в результате чего протоны (H +), чтобы накопить на положительно заряженному аноду и рН вблизи анода быстро уменьшаться в статическом ванной. Проверьте подкисления в отдельном эксперименте путем пропускания более несколько сотен импульсов через раствор, который содержит рН-индикатор (например, Хэнкса сбалансированный солевой раствор с фенола красного).
    6. Оставьте нейроны в окрашивающим раствором 1 в течение 60 сек после поле стимуляция прекращается, так что после стимул эндоцитоз будет завершено 25.
    7. Вымойте красящего раствора из камеры формирования изображений путем перфузии ее полоскания раствора 1, раствор красителя свободной Тирода плюс антагонистов рецепторов АМРА и рецепторов NMDA (см. раздел 2.1.1), и блокатора потенциал-зависимых Na + каналов ( например 0,5-1 мкм тетродотоксин, ТТХ). Сочетание блокаторов будет подавлять потерю FM красителя через спонтанного синаптической активности. Чтобы максимизировать эффективность стирки, увеличить скорость перфузии ( например, до 5-6 мл / мин) в течение 1-2 мин, и добавить болюс (например, 1 мл) полоскания раствор 1 непосредственно к открытой камерой изображения вручную, с помощью пипетки. Контролировать силу и направление ручного вливания, чтобы не беспокоить культивируемых нейронов.
  2. Окрашивание в связи с синаптической активности вызванной решения высокого К + (не включает потенциалы действия).
    1. Подготовка окрашивания раствор 2, добавив FM краситель в раствор с высокой K + Тирода. В частности, подготовить модифицированный раствор Тирода с 45 мм KCl, по эквимолярному замещения KCl для NaCl. При необходимости добавить антагонистов АМРА и NMDA-рецепторов. Это решение высокого K + будет деполяризовать нейроны непрерывно, включите Ca 2 + приток в нервных окончаниях, и инициировать синаптических пузырьков экзоцитоза к максимальной степени 26. Более высокие концентрации (70-90 мм) были также использованы в других отчетах например Klingauf др.. 27д Ричардс и др.. 28
    2. Передача покровное с культивируемых нейронах из культуральной среды в камеру обработки изображений предварительно заполненный раствором простушек Тирода.
    3. Пятно нейронов при комнатной температуре в течение 1-2 мин с применением красящего раствора 2 при постоянной перфузии или с помощью пипетки 26,28. В последнем случае, конечная концентрация красителя следует регулировать добавлением известного объема окрашивающим раствором 2 к известному объему раствора красителя свободной.
    4. Вымойте красящего раствора из камеры формирования изображений, как описано в разделе 2.1.7.
  3. Окрашивание из-за спонтанного и миниатюрной синаптической активности.
    1. Prewarm основе бикарбоната решение (например, минимальную поддерживающую среду, MEM) до 37 ° С, помещая в культуральной инкубаторе в течение более 60 мин.
    2. Для окрашивания на основе спонтанной синаптической активности, подготовить красящего раствора 3, добавив FM красителя MEM. Для окрашивания на основе мiniature синаптической активности, подготовить красящего раствора 4, добавив ТТХ к красящим раствором 3.
    3. Пятно нейроны путем передачи покровное с культивируемых нейронов из культуральной среды для окрашивания раствор 3 или 4, и оставляя их в том же окрашивающего раствора при 37 ° С в течение 10 мин.
    4. Промойте покровное кратко в ополаскивания решение 1.
    5. Трансфер покровное к полоскания раствор 1 в камере изображений. Имейте в виду следующее. 1) Клетки не должны подвергаться воздействию воздуха, при необходимости, передавать покровное непосредственно в камеру изображения без промывки. 2) Нейроны могут быть окрашены при комнатной температуре путем замены красящего раствора 3 или 4 с раствором HEPES основе. 3) Нейроны могут быть окрашены для вызванной синаптической активности в контексте решения высокого К + с помощью этого метода, путем замены красящего раствора 3 или 4 с красящим раствором 2 и проведение оставшиеся шаги при комнатной температуре.
    6. Вымойте красящего раствора из изображенийКамера, как описано в разделе 2.1.7.

3. Вымывания FM Dye

  1. После окрашивания нейронов и начальной промывки с помощью любого из вышеописанных методов (раздел 2.1.7), продолжают заливать изображения камеры с промывкой раствора 1 в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Это позволит удалить FM красителя из мембраны плазмы и внеклеточной решение. В случае наш изображений камеры, скорость перфузии ванна 600-1200 мкл / мин. Стиральная также может быть проведена в отсутствие внеклеточного Ca2 +, чтобы подавить потери краски FM из-за синаптических деятельности 17. Промывки может быть повышена путем краткого применения Advasep-7, модифицированного циклодекстрина, который служит в качестве поглотителя ФМ красителей из плазматической мембраны 29-31. Очень важно, чтобы ни Advasep-7 экспозицию короткий (например, 5 сек в случае монослоя культуры), чтобы избежать как снижение интенсивности FM Puncta 31 и ущерба УВОLTH клеток. Флуоресценции от FM1-43 в плазматической мембране также могут быть подавлены с помощью применения гасителя сульфородамина 101 (50-100 мкм), что не входит синаптических везикул 32.

4. Поиск оптимального поля изображения во время стирки

  1. Убедитесь, что клетки в области для включения в образ здоровы, используя передаваемый световой микроскопии с большим увеличением и высокой числовой апертурой объектива (например 40Х). Из этого раздела, мы продолжаем использовать инвертированного микроскопа (Затмение Ti, Nikon), оснащенный фазового контраста или дифференциального интерференционного контраста оптики. Этот микроскоп также оснащен системой идеального фокуса (PFS), который позволяет непрерывно, в реальном времени коррекцию фокусировки, которая преодолевает микроскопа фокуса дрейф. Эта функция имеет важное значение для покадровой обработки изображений во обесцвечивани с той же плоскости фокусировки.
  2. Убедитесь, что окрашивание было эффективным, с помощью флуоресценции оптики. ПроспектOID агрегаты FM Puncta, если они не являются целью исследования, поскольку отдельные бутоны будет трудно различить. Обратите внимание на формы с Puncta FM: если большинство окрашенных бутонов появляются в виде строк круглых бусин, они могут представлять нездоровые нервные окончания. Сведение к минимуму воздействие нейронов в сильном возбуждении флуоресценции во избежание фотообесцвечивания.

5. Разгрузка FM Dye из синаптических пузырьков (обесцвечивани)

  1. Обесцвечивани из-за синаптической активности вызванной электрической стимуляцией поля.
    1. Вымойте ТТХ путем перфузии нейроны широко с полоскания раствора 2 (такой же, как полоскания раствор 1, но без ТТХ). Подтверждение эффективности ТТХ вымывания в отдельных экспериментах, с теми же параметрами стиральные (скорость перфузии и продолжительность), например, путем флуоресцентного Са 2 + томография цитоплазматических Са 2 + переходных индуцированных поля стимуляции, или патч-зажим записи вольтвозрастные Na + токи.
    2. Начните визуализации FM красителей. Для визуализации FM1-43 или FM4-64, используйте 520 нм или 650 нм фильтры выбросов Длинный пас, соответственно и фильтр возбуждения в 490 нм. Получение изображений каждые 1-2 сек, используя короткое время экспозиции (например, 10-20 мс), слабую интенсивность возбуждения (например, 5-10% индикатор питания), а также высокая чувствительность (например, с усилением EM). Свернуть фотообесцвечивания ФМ красителей за счет сокращения времени экспозиции и интенсивность возбуждения флуоресценции. Свернуть микроскопа фокуса дрейф, повернув на фокус системы идеально.
    3. Стимулировать нейроны в ополаскивания решение 2, используя полевой стимуляции (например, при 10 Гц в течение 120 сек) 20.
    4. Применение нескольких раундов стимуляции, с промежуточными периодами отдыха 1-2 мин, чтобы истощить все переработка синаптические везикулы FM красителя. Это важно при оценке размера общего пула переработки синаптических пузырьков, которые были окрашенных FM красителей в гое до состояния 20,33.
  2. Обесцвечивани из-за синаптических деятельности вызывали в отсутствие потенциалов действия.
    1. Начните визуализации FM красителя.
    2. Примените стимулирующие реагентов, растворенных в ополаскивания решение 1 или 2. Такие реагенты включают: KCl (решение высокой K +, например 45 мм) 26 иономицином (в ионофора Са 2 +, что повышает внутриклеточный Ca 2 + концентрации, позволяя Са 2 + приток в клетку из внеклеточного раствора, используется, например, в 5 мкМ) 20,34 и сахароза (гипертонический раствор, который стимулирует высвобождение синаптических пузырьков из готовых к выбросу бассейн, используемой, например, при 500 мм) 35,36. Используйте быстрый, локальную систему перфузии для надежного временного контроля при применении реагентов, например системы SF-77B от компании Warner Instruments 37, или системы Y-трубки 38-40.
  3. Обесцвечивани из-за спонтанной и минiature синаптической активности.
    1. Для обесцвечивани из-за спонтанного синаптической активности, промыть ТТХ, как указано выше (раздел 5.1.1), используя полоскания раствор 2. Начните визуализации FM красителей в то время перфузии нейроны со входом решение 2. Для обесцвечивани из-за миниатюрных синаптических деятельности, начать визуализации FM красители, продолжая заливать нейроны со входом решение 1 (с ТТХ).
    2. После обесцвечивани на основе либо спонтанной или миниатюрной деятельности, определить функциональные нервные окончания на обесцвечивани через вызвала синаптической активности. Активность может быть вызван любой из процедур, описанных выше. Этот процесс идентификации необходимо, потому что окрашенные структуры могут быть те, кроме функциональных нервных окончаний (например медленно утилизации эндосомы или астроцитов везикулы) и большого количества обесцвечивани со стороны вызвала средств деятельности в этом процессе.

6. Оценивая фотообесцвечивания Норма FM красителей

  1. Пятно нервные окончания с альдегида-поправимо FM красителя (например, FM1-43FX, FM4-64FX). Это можно сделать с помощью вызваны, спонтанное или миниатюрный метода окрашивания, описанной выше, и заменой FM краситель с фиксируемой FM красителя.
  2. Промыть поправимо FM красителя, как описано в разделе 2.1.7.
  3. Химически исправить нейроны путем передачи покровное к фиксирующим раствором: 4% параформальдегида и 4% сахарозы в растворе Тирода течение 30 мин при 4 ° С. Интенсивность флуоресценции от фиксируемой FM красителя будут сохранены после химической фиксации.
  4. Промыть фиксатором в течение 10 мин в растворе Тироде, путем передачи покровное в свежий раствор Тирода дважды.
  5. Трансфер покровное в свежий раствор Тирода в камере изображений.
  6. Начать визуализации поправимо FM краситель, используя тот же набор параметров обработки изображений как для живых нейронов. Важно, чтобы промыть изображения камеры очень хорошо после использования каких-либо химически неподвижного образца, таквсе оставшиеся фиксатор может повлиять на последующие эксперименты изображений живых клеток, проведенных в той же камере. В качестве альтернативы изображений фиксированной клетки, окрашенные живые клетки могут быть отображены для оценки скорости фотообесцвечивания. Тем не менее, следует иметь в виду, что трудно блокировать миниатюрный синаптической активности остро, например, частота миниатюрной активности может быть уменьшено до ~ 50%, удалив внеклеточный Са 2 + 23, но это не является полным блокада.
  7. В конце каждой сессии изображений, приобретают фонового изображения для оценки абсолютное значение интенсивности флуоресценции FM. Интенсивность FM Puncta представляет собой не только истинную сигнал от FM красителей в нервных окончаниях, но и фоновый шум из 1) глиальных клеток, лежащих в основе нейронов культуры монослоя, 2) покровное и оптических компонентов (например, линза объектива, фильтры и зеркала), и 3) детектор (EMCCD камера). Фоновый шум ассSSED в nonstained регионах распечатанных области. Когда такие регионы ограничены в пространстве или неоднородны по интенсивности, заменить его изображением с затвор камеры закрыт и приобрести шум от детектора, хотя это и не идеальный метод. Приобретать около 10 фотографий с теми же параметрами визуализации.

7. Анализ изображений

  1. Импорт полученные данные в программу анализа изображений в качестве стека изображений временных рядов. Мы используем ImageJ (WS Расбанд, NIH) и связанные с ним подключаемые модули, например стабилизатор изображения плагин (Кан Ли) для коррекции небольшую степень движения среди FM Puncta и серии Time Analyzer 2.0 (Баладжи Jayaprakash) для анализа временной ряд.
  2. Рассчитать изменения в интенсивности FM в начале и в конце ряда (ΔFM). С этой целью в среднем изображения до начала обесцвечивани и после окончания обесцвечивани (например, 5 кадров изображения в каждом), и генерировать разностного изображения на subtractinг им.
  3. Определение потенциально функциональные нервные окончания путем применения пороговой интенсивности в разностного изображения, и обнаружить пикселей, чьи значения интенсивности выше порога. Один из методов настройки порога, это выбрать стандартное отклонение интенсивности фона, полученной из голой области покровного.
  4. Определить изолированные функциональные нервные окончания, что и смежных пикселей, которые были обнаружены и которые удовлетворяют критерию размера (минимальные и максимальные количества пикселей в смежности). Этот процесс исключает фонового шума и агрегированные нервные окончания от анализа.
  5. Связать регионы-о-процентов (Rois) на обнаруженных кластеров пиксельных (с отдельными кластеры, соответствующие отдельным нервных окончаний). Общее изменение интенсивности во время обесцвечивани (ΔFM) является типичным показателем анализа. Это представляет совокупное количество вызванной, спонтанного или миниатюрной синаптической активности. Исключить трансформирования, если они демонстрируют одно из следующихизменения интенсивности в зависимости от целей экспериментов: увеличение во время записи, внезапное снижение до раздражения, или длинный задержки после стимуляции.
  6. Оцените скорость фотообесцвечивания путем импорта полученных данных временных рядов в программное обеспечение анализа изображений. Нормальное фоновые изображения (например, с закрытым затвором) и вычесть его из отдельных изображений. Связать трансформирования в FM Puncta, что предположительно соответствуют нервных окончаний, и измерить изменения в интенсивности ROI в течение долгого времени.

Решения

  1. Решение Тирода
    • Состав (в мМ): 125 NaCl, 2 KCl, CaCl 2 2 2 MgCl 2, 30 глюкозы, 25 HEPES, 310 мОсм, рН 7,4.
  2. Окрашивание решение 1
    • Тирода решение плюс краситель FM.
    • Это решение используется для окрашивания на основе вызывали синаптической активности электрической стимуляцией.
    • Добавьте антагонистов рецепторов АМРА и NMDA receptoRS если это необходимо.
  3. Окрашивание решение 2
    • Решение высокого K + Тирода плюс краситель FM.
    • Этот модифицированный раствор Тироде получают путем увеличения концентрации KCl в 45 мм, с эквимолярным замещения KCl для NaCl.
    • Это решение используется для окрашивания на основе вызывали синаптической активности путем непрерывного деполяризации.
    • Добавьте антагонистов рецепторов АМРА и NMDA рецепторов если это необходимо.
  4. Окрашивание решение 3
    • Решение MEM плюс краситель FM.
    • Это решение используется для окрашивания на основе спонтанного синаптической активности.
  5. Окрашивание решение 4
    • Решение MEM плюс краситель FM и ТТХ.
    • Это решение используется для окрашивания на основе миниатюрной синаптической активности.
  6. Промывка решение 1
    • Тирода решение плюс антагонисты рецепторов АМРА и рецепторов NMDA, и ТТХ.
  7. Промывка решение 2
    • Тирода решение плюс антагонисты рецепторов АМРА и рецепторов NMDA, но без ТТХ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В качестве примера, мы покажем репрезентативные результаты для обесцвечивани времени конечно синаптических пузырьков (рис. 4). Культивированный нейронов гиппокампа окрашивали FM4-64 с помощью спонтанного синаптической активности (шаг 2.3) и промывают раствором красителя без (полоскания раствор 2). Томография показывает начальное обесцвечивани время курс с использованием спонтанной активности (шаг 5.3) (начальная часть непрерывной линии, рисунок 4А). За этим следует временного хода обесц...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Мы описали протоколы для окрашивания и обесцвечивани синаптических пузырьков в ответ на вызванные, спонтанное и миниатюрный синаптической активности, и для работы с изображениями на этапе обесцвечивани. В дополнение к существующим протоколам, мы включили новый протокол наблюдения обесцвечивани FM на основе миниатюрной синаптической активности. Используя эти протоколы, мы ранее определили отклонения в культивируемых нейронов от мышиной модели беспорядка движение дистонии. По сравнению с их коллегами в мышей дикого типа, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность членам лаборатории Harata за полезные обсуждения по всему исполнения этой работы. Эта работа финансировалась за счет грантов от Американской ассоциации сердца, Медицинский исследовательский фонд дистония, Эдвард Mallinckrodt, младший Foundation, Национальный научный фонд, а Уайтхолл Foundation в NCH

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Генератор импульсовAMPIMaster-8
Изолирующий стимуляторfigure-materials-1 DigitimerDS3
Инвертированный микроскопNikonEclipse TS100Используется для оценки морфологии клеток при малом увеличении.
Инвертированный микроскопNikonEclipse TiEИспользуется для флуоресцентной визуализации и визуализации в проходящем свете с высоким разрешением и минимальным дрейфом фокуса.
ОбъективNikonРекомендуется объектив с погружением в воду. Объектив с погружением в масло может быть использован, если визуализируемая структура не находится глубоко от поверхности покровного стекла (например, >10 μm).
Фільтр-кубNikon77032509490/20-nm ex, 510-nm dclp, 520-nm-LP em для FM1-43
Фільтр-кубNikon77032809490/420 nm ex, 510 nm dclp, 650 nm LP em для FM4-64. 
EMCCD-камераAndor TechnologyiXon EM+ DU-860Данная EMCCD-камера используется для высокочувствительного детектирования флуоресценции.
Жидкостный рециркуляционный чиллерSolid State Cooling SystemsOasis 160Используется для непрерывного охлаждения камеры водой для поддержания температуры -80°C, что позволяет снизить уровень шума.
Светодиод (LED)CoolLED-Custom Interconnect490 nmЭтот источник света используется для быстрого управления включением/выключением возбуждения флуоресценции.
Программное обеспечение для сбора изображенийAndor TechnologySolis
Визуализационная камераWarner InstrumentsRC-21BRFS
Система быстрой перфузииWarner InstrumentsSF-77B
CNQXTocris Bioscience1045
D,L-AP5Tocris Bioscience0106
ТетродотоксинTocris Bioscience1069Осторожно: токсичный реагент. Обращаться с осторожностью.
FM1-43InvitrogenT35356
FM1-43, фиксируемый альдегидами (FM1-43FX)InvitrogenF35355
FM4-64InvitrogenT13320
FM4-64, фиксируемый альдегидами (FM4-64FX)InvitrogenF34653
ИономицинSigma-AldrichI0634
Сбалансированный солевой раствор Хэнкса’Sigma-AldrichH2387
Минимальная эссенциальная средаInvitrogen51200-038Данный раствор не содержит феноловый красный, который может создавать помехи при флуоресцентной визуализации.
ПараформальдегидElectron Microscopy Sciences15710Осторожно: токсичный реагент. Обращаться с осторожностью.
СахарозаSigma-AldrichS7903

Ссылки

  1. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255, 200-203 (1992).
  2. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nat. Protoc. 1, 2916-2921 (2006).
  3. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle recycling by staining and destaining vesicles with FM dyes. , Cold Spring Harb Protoc. 77-83 (2012).
  4. Newton, J., Murthy, V. Measuring exocytosis in neurons using FM labeling. J. Vis. Exp. , (2006).
  5. Evans, G. J., Cousin, M. A. Simultaneous monitoring of three key neuronal functions in primary neuronal cultures. J. Neurosci. Methods. 160, 197-205 (2007).
  6. Cousin, M. A. Use of FM1-43 and other derivatives to investigate neuronal function. Curr. Protoc. Neurosci. 2, (2008).
  7. Clayton, E. L., Cousin, M. A. Quantitative monitoring of activity-dependent bulk endocytosis of synaptic vesicle membrane by fluorescent dextran imaging. J. Neurosci. Methods. 185, 76-81 (2009).
  8. Cheung, G., Cousin, M. A. Quantitative analysis of synaptic vesicle pool replenishment in cultured cerebellar granule neurons using FM dyes. J. Vis. Exp. , (2011).
  9. Welzel, O., Tischbirek, C. H., Kornhuber, J., Groemer, T. W. Pool-independent labelling of synaptic vesicle exocytosis with single vesicle resolution in rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 205, 258-264 (2012).
  10. Winterer, J., Stanton, P. K., Muller, W. Direct monitoring of vesicular release and uptake in brain slices by multiphoton excitation of the styryl FM 1-43. Biotechniques. 40, 343-351 (2006).
  11. Kay, A. R. Imaging FM dyes in brain slices. Cold Spring Harb. Protoc. , (2007).
  12. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods Mol. Biol. 440, 349-369 (2008).
  13. Amaral, E., Guatimosim, S., Guatimosim, C. Using the fluorescent styryl dye FM1-43 to visualize synaptic vesicles exocytosis and endocytosis in motor nerve terminals. Methods Mol. Biol. 689, 137-148 (2011).
  14. Guatimosim, C., von Gersdorff, H. Optical monitoring of synaptic vesicle trafficking in ribbon synapses. Neurochem. Int. 41, 307-312 (2002).
  15. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J. Vis. Exp. , 1305(2009).
  16. Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
  17. Sara, Y., Virmani, T., Deak, F., Liu, X. An isolated pool of vesicles recycles at rest and drives spontaneous neurotransmission. Neuron. 45, 563-573 (2005).
  18. Wilhelm, B. G., Groemer, T. W., Rizzoli, S. O. The same synaptic vesicles drive active and spontaneous release. Nat. Neurosci. 13, 1454-1456 (2010).
  19. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Miniature release events of glutamate from hippocampal neurons are influenced by the dystonia-associated protein torsinA. Synapse. 66, 807-822 (2012).
  20. Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
  21. Kavalali, E. T., Klingauf, J., Tsien, R. W. Activity-dependent regulation of synaptic clustering in a hippocampal culture system. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 12893-12900 (1999).
  22. Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis. Nature. 440, 935-939 (2006).
  23. Nosyreva, E., Kavalali, E. T. Activity-dependent augmentation of spontaneous neurotransmission during endoplasmic reticulum stress. J. Neurosci. 30, 7358-7368 (2010).
  24. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14, 983-989 (1995).
  25. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5567-5571 (1996).
  26. Harata, N., et al. Limited numbers of recycling vesicles in small CNS nerve terminals: implications for neural signaling and vesicular cycling. Trends Neurosci. 24, 637-643 (2001).
  27. Klingauf, J., Kavalali, E. T., Tsien, R. W. Kinetics and regulation of fast endocytosis at hippocampal synapses. Nature. 394, 581-585 (1998).
  28. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J. Cell Biol. 168, 929-939 (2005).
  29. Kay, A. R., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1-43 in C. elegans, lamprey, and rat. Neuron. 24, 809-817 (1999).
  30. Darcy, K. J., Staras, K., Collinson, L. M., Goda, Y. An ultrastructural readout of fluorescence recovery after photobleaching using correlative light and electron. 1, 988-994 (2006).
  31. Moulder, K. L., Jiang, X., Taylor, A. A., Benz, A. M., Mennerick, S. Presynaptically silent synapses studied with light microscopy. J. Vis. Exp. , (2010).
  32. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of synaptic activity in hippocampal slices with FM1-43 enabled by fluorescence quenching. Neuron. 24, 803-808 (1999).
  33. Harata, N. C., Choi, S., Pyle, J. L., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Frequency-dependent kinetics and prevalence of kiss-and-run and reuse at hippocampal synapses studied with novel quenching methods. Neuron. 49, 243-256 (2006).
  34. Piedras-Renteria, E. S., et al. Presynaptic homeostasis at CNS nerve terminals compensates for lack of a key Ca2+ entry pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 3609-3614 (2004).
  35. Rosenmund, C., Stevens, C. F. Definition of the readily releasable pool of vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 16, 1197-1207 (1996).
  36. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Piedras-Renteria, E. S., Tsien, R. W. Rapid reuse of readily releasable pool vesicles at hippocampal synapses. Neuron. 28, 221-231 (2000).
  37. Kawano, H., et al. Long-term culture of astrocytes attenuates the readily releasable pool of synaptic vesicles. PLoS ONE. 8, (2012).
  38. Harata, N., Katayama, J., Takeshita, Y., Murai, Y., Akaike, N. Two components of metabotropic glutamate responses in acutely dissociated CA3 pyramidal neurons of the rat. Brain Res. 711, 223-233 (1996).
  39. Kira, T., Harata, N., Sakata, T., Akaike, N. Kinetics of sevoflurane action on GABA- and glycine-induced currents in acutely dissociated rat hippocampal neurons. Neuroscience. 85, 383-394 (1998).
  40. Harata, N., Katayama, J., Akaike, N. Excitatory amino acid responses in relay neurons of the rat lateral geniculate nucleus. Neuroscience. 89, 109-125 (1999).
  41. Albeanu, D. F., Soucy, E., Sato, T. F., Meister, M., Murthy, V. N. LED arrays as cost effective and efficient light sources for widefield microscopy. PLoS ONE. 3, e2146(2008).
  42. Neves, G., Lagnado, L. The kinetics of exocytosis and endocytosis in the synaptic terminal of goldfish retinal bipolar cells. J. Physiol. 515, 181-202 (1999).
  43. Mazzone, S. B., et al. Fluorescent styryl dyes FM1-43 and FM2-10 are muscarinic receptor antagonists: intravital visualization of receptor occupancy. J. Physiol. 575, 23-35 (2006).
  44. Gale, J. E., Marcotti, W., Kennedy, H. J., Kros, C. J., Richardson, G. P. FM1-43 dye behaves as a permeant blocker of the hair-cell mechanotransducer channel. J. Neurosci. 21, 7013-7025 (2001).
  45. Li, D., Herault, K., Oheim, M., Ropert, N. FM dyes enter via a store-operated calcium channel and modify calcium signaling of cultured astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21960-21965 (2009).
  46. Crumling, M. A., et al. P2X antagonists inhibit styryl dye entry into hair cells. Neuroscience. 161, 1144-1153 (2009).
  47. Zhu, Y., Stevens, C. F. Probing synaptic vesicle fusion by altering mechanical properties of the neuronal surface membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 18018-18022 (2008).
  48. Thiagarajan, T. C., Lindskog, M., Tsien, R. W. Adaptation to synaptic inactivity in hippocampal neurons. Neuron. 47, 725-737 (2005).
  49. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  50. Li, H., et al. Concurrent imaging of synaptic vesicle recycling and calcium dynamics. Front. Mol. Neurosci. 4, 34(2011).
  51. Raingo, J., et al. VAMP4 directs synaptic vesicles to a pool that selectively maintains asynchronous neurotransmission. Nat. Neurosci. 15, 738-745 (2012).
  52. Martens, H., et al. Unique luminal localization of VGAT-C terminus allows for selective labeling of active cortical GABAergic synapses. J. Neurosci. 28, 13125-13131 (2008).
  53. Hua, Y., Sinha, R., Martineau, M., Kahms, M., Klingauf, J. A common origin of synaptic vesicles undergoing evoked and spontaneous fusion. Nat. Neurosci. 13, 1451-1453 (2010).
  54. Hua, Y., et al. A readily retrievable pool of synaptic vesicles. Nat. Neurosci. 14, 833-839 (2011).
  55. Groemer, T. W., Klingauf, J. Synaptic vesicles recycling spontaneously and during activity belong to the same vesicle. 10, 145-147 (2007).
  56. Moulder, K. L., et al. A specific role for Ca2+-dependent adenylyl cyclases in recovery from adaptive presynaptic silencing. J. Neurosci. 28, 5159-5168 (2008).
  57. Crawford, D. C., Jiang, X., Taylor, A., Moulder, K. L., Mennerick, S. Differential requirement for protein synthesis in presynaptic unmuting and muting in hippocampal glutamate terminals. PLoS ONE. 7, (2012).
  58. Henkel, A. W., Lubke, J., Betz, W. J. FM1-43 dye ultrastructural localization in and release from frog motor nerve terminals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1918-1923 (1996).
  59. Harata, N., Ryan, T. A., Smith, S. J., Buchanan, J., Tsien, R. W. Visualizing recycling synaptic vesicles in hippocampal neurons by FM 1- 43 photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 12748-12753 (2001).
  60. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying synaptic vesicle pools using photoconversion of styryl dyes. J. Vis. Exp. , (2010).
  61. Schikorski, T. Monitoring rapid endocytosis in the electron microscope via photoconversion of vesicles fluorescently labeled with FM1-43. Methods Mol. Biol. 657, 329-346 (2010).
  62. Hoopmann, P., Rizzoli, S. O., Betz, W. J. FM dye photoconversion for visualizing synaptic vesicles by electron microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2012, 84-86 (2012).
  63. Schote, U., Seelig, J. Interaction of the neuronal marker dye FM1-43 with lipid membranes. Thermodynamics and lipid ordering. Biochim. Biophys. Acta. 1415, 135-146 (1998).
  64. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J. Neurochem. 97, 1546-1570 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FMFM

Похожие статьи