Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

MR молекулярной визуализации рака простаты с небольшой молекулярной CLT1 пептида целевых Агента Contrast

11K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50565

⸱

3 сентября 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Translational Hematology & Oncology Research, Cleveland Clinic, Case Western Reserve University , 3Department of Molecular Biology & Microbiology, Case Western Reserve University

В этой статье

Краткое содержание

Чтобы продемонстрировать молекулярной визуализации рака MR с небольшим пептидом целевой MRI контрастный агент, специфичную для сгустками белками плазмы в строме опухоли в мышиной модели рака простаты.

Аннотация

Опухоль внеклеточный матрикс имеет множество связанных с раком белков, которые могут быть использованы в качестве маркеров для молекулярной визуализации рака. В этой работе мы продемонстрировали эффективное рака MR молекулярное воображение с небольшой молекулярной пептида целевой моноамид комплекс Б-г-DOTA как целевой МРТ контрастного вещества, характерные для сгустками плазмы белков в опухоли стромы. Мы провели эксперимент оценки эффективности агента для неинвазивного обнаружения опухоли простаты с МРТ в мышиной ортотопического ПК-3 модели рака простаты. Целевое контрастное вещество было эффективным для получения значительное повышение контрастности опухоли при низкой дозе 0,03 ммоль Gd / кг. Пептид целевой МРТ контрастное вещество является перспективным для MR молекулярной визуализации опухоли предстательной железы.

Введение

Эффективная визуализация, связанных с раком молекулярных мишеней имеет большое значение для повышения точности ранней диагностики рака и диагностики. Магнитно-резонансная томография (МРТ) является мощным клиническим методом визуализации с высоким пространственным разрешением и без ионизирующего излучения 1. Тем не менее, не нацелено контрастное вещество не доступен для молекулярной визуализации клиническая рака MR. Инновационный дизайн и разработка целевых контрастных агентов способствовала бы дальнейшему развитию применения молекулярной визуализации рака MR. Значительные усилия были предприняты для разработки целевых контрастных агентов для МР томографии биомаркеров, выраженных на поверхности раковых клеток. Из-за относительно низкой чувствительности МРТ и низкой концентрации этих биомаркеров, это вызов для генерации достаточного повышение контрастности для эффективного MR молекулярной визуализации с использованием небольших молекулярных целевых контрастные вещества 2,3. Для того чтобы получить достаточное усиление, различные системы доставки успеч как липосомы, наночастицы и полимерных конъюгатов с высокой полезной нагрузкой парамагнитных Gd (III) хелатов были подготовлены для увеличения локальной концентрации контрастных агентов на целевых сайтах 4,5. Хотя эти системы доставки были способны генерировать значительное улучшение опухоли на животных моделях, их большие размеры привело к медленной и неполной выведения из организма, что приводит к длительной накопления токсичных Gd (III) ионов, которые могут вызвать серьезные проблемы безопасности 6. В последнее время некоторые исследования показали, что ограничения МРТ для молекулярной визуализации можно преодолеть, выбрав соответствующие молекулярные биомаркеры с высокой локальной выражения в очагах поражения и с помощью небольших молекул вещества, которые могут быть легко выводятся из организма 7,8. Ключевой особенностью этих агентов в том, что они ориентированы на молекулярных маркеров обильно присутствующие в больные ткани с небольшим присутствием в нормальных тканях. Высокая концентрация контрастных агентов может связываться с этих целей, в результате чего достаточно больдостаточные повышение контрастности для эффективного MR молекулярной визуализации. С их размер меньше, чем порог почечной фильтрации, несвязанные контрастные вещества могут быть легко выводится из организма с уменьшенной фонового шума. Мы выбрали универсальную связанную с раком биомаркеров, со сгустками белки плазмы, которые в изобилии существуют в опухолевой стромы, и редко присутствуют в нормальных тканях 9. Мы синтезировали целевой контрастное вещество, содержащее небольшое ориентации пептид CGLIIQKNEC (CLT1), который показал сильное специфическое связывание с PC3 простаты модели опухоли 10 и четыре Б-г-DOTA моноамид хелаты. Здесь мы предоставляем методологию рака MR молекулярной визуализации для выявления опухолей у мышей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол взято из предыдущего исследования 11.

1. Сопряжение Gd-DOTA для CLT1 пептида

  1. Использование стандартного твердофазного пептидного синтеза, синтезировать пептид CLT1 (CGLIIQKNEC) из Fmoc-защищенных аминокислот на смоле хлорида 2-хлортритил (1,0 ммоль).
  2. После добавления окончательное аминокислоту, циклизации линейного пептида на смоле с таллий (III) трифторацетата (1,09 г, 2,0 ммоль, 2 экв) в ДМФ (20 мл) при 0 ° С в течение 2 часов.
  3. Далее, конъюгат ПЭГ и лизин последовательно с N-конца пептида CLT1 (1,0 ммоль) на смоле путем реакции последовательно с Fmoc-NH-ПЭГ-COOH (3,0 ммоль), ФМОК-Lys (Fmoc)-OH (3,0 ммоль), и вторая партия: ФМОК-Lys (Fmoc)-OH (6 ммоль).
  4. Удалить Fmoc с пиперидина. Добавить DOTA-трис (трет-Bu) (4,58 г, 8,0 ммоль, 2 эквивалента по отношению к каждой аминогруппы) в реакцию с четырех свободных аминов из лизина дендримера на смоле в течение 2 часов.
  5. Наконец, расщеплять и снятия защиты с продуктаиз смолы путем обработки с коктейлем трифторуксусной кислоты, воды и triisobutylsilane (ТИС) (20 мл, 95/2.5/2.5) в течение 8 ч при комнатной температуре. Удаление смолы фильтрованием с последующим промыванием трифторуксусной кислотой (ТФУ). Добавить объединенные фильтраты по каплям к холодному этиловым эфиром (200 мл), центрифуге и промывают 4х этиловым эфиром. Сушат в вакууме с получением бесцветного твердого вещества (1,99 г, выход 61%).
  6. Сырой продукт очищают препаративной ВЭЖХ с использованием градиента 0-40% растворитель В (0,1% ТФУ в ацетонитриле) в растворитель А (0,1% водный раствор TFA) в течение 20 мин и 40-90% растворител В в растворителе А в течение 10 мин .
  7. Растворить CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 мг, 0,077 ммоль) в деионизированной воде (15 мл) и довести рН до 6 с помощью 1 М NaOH. Добавить Б-га (OAc) 3 0,4 H 2 O (472 мг, 0,462 ммоль, 1,5 эквивалента в DOTA моноамида) в частях к решению, при поддержании рН в 6, используя 1М NaOH. Перемешать реакционного раствора при комнатной температуре в течение 48 часов.
  8. Комплекс остаточная Б-г (III) с еthylenediaminetetraacetic кислота (EDTA) (90 мг, 0,31 ммоль) и очищают сырой продукт на колонке гель для получением конечного продукта CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 (169 мг, 57%).

2. Характеристика контрастных веществ

  1. Измерьте Б-г (III) контент с индуктивно связанной плазмой оптического эмиссионной спектроскопии.
  2. Получить матричный-лазерной десорбцией / ионизации времени пролета (MALDI-TOF) масс-спектры в линейном режиме с 2,5-дигидроксибензойной кислоты (2,5-DHB) в качестве матрицы.
  3. Измерение времен релаксации водного раствора контрастных агентов CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 и nontargeted управления агента sCLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 с различными концентрациями при 60 МГц (1,5 Т) с релаксометра при 37 ° С Используйте последовательность инверсии-восстановления пульса для измерения T 1 и последовательность Карра-Перселла-Meiboom-Gill 500 эхо для измерения T 2. Рассчитать Т 1 и Т 2 релаксивности йе агенты от склонов земельных 1 / T 1 и 1 / Т 2 по сравнению с концентрациями Б-га.

3. Культура клеток и развитие животной модели с Ортотопическая PC3 опухоли простаты

  1. Культура PC3 предстательной железы раковые клетки с конститутивной экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в RPMI среде, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин / стрептомицин / Fungizone, сбора обработкой трипсином и ресуспендируют при плотности 2,5 × 10 4 клеток / мкл PBS.
  2. Поддерживать мужчин NIH бестимусных голых мышей (4-5 недель) в Бестимусным животных Основной фонд, Case Western Reserve University (CWRU) согласно протоколу животных утвержденной институционального комитета CWRU уходу и использованию животных в.
  3. Хирургические поверхности опрыскивают 2%-ным раствором хлоргексидина и затем покрыта абсорбирующими шторы. Стерильные хирургические перчатки носили во время процедуры. Перед животных хирургии, IP придать Avertin (250 мг / кг), чтобы anesthetizе мышей. Кроме того, кетамин / ксилазин / ацепромазин может быть использован в концентрации 50/5/1 мг / кг. Глазные мази наносили на мыши, чтобы поддерживать адекватную влажность во время анестезии.
  4. Начало операции путем разрезания небольшой надрез через кожу брюшины и вдоль нижней средней линии при длине около 1 см с помощью стерильным скальпелем. Хирургический стерильный драпировка была покрыта вокруг разреза во время операции выживания.
  5. Аккуратно экстериоризоваться и стабилизировать простаты спинной доли выставить простату. Введите суспензии PC3-GFP клеток в PBS (20 мкл) в простату с 30 иглы. Наконец закрыть разрез с раны AutoClip 12.
  6. Для мониторинга после процедуры, следить животных дважды в день в течение 1 недели. Признаки болезни включают в себя отсутствие еды, темно сбора мочи вокруг уретры и неустойчивость походки, которые могли бы указать инфекции или закупорку мочевого пузыря в скоб.
  7. Через 10 дней, удалить тон скобы с использованием удаления скрепок. Монитор животных ежедневно для оценки размеров опухоли и никаких доказательств боли, таких как потеря веса, поведенческих отклонений, и моторных дефектов. Усыпить животных, которые показали, размер опухоли, превышающей этически допустимый предел или доказательства боли во время роста опухоли.

4. Подтверждение опухоли специфичность связывания пептидов с флуоресцентной визуализации и гистологии

  1. После инокуляции опухолевых клеток, позволяют приблизительно 4 недель роста опухоли до начала с изображениями. До введения пептидных зондов, приобрести GFP флуоресцентные изображения с живыми мышами на флуоресценции томографа для проверки на наличие опухоли.
  2. Iv вводить Texas Red меченых пептидов в опухоль мышам в дозе 10 нмоль / мышь.
  3. Жертвоприношение мышей 2 час спустя смещением шейных позвонков, собирать опухоль и основные органы, и сразу же изображение на флуоресценции тепловизор. Используйте зеленые светофильтры для GFP (возбуждения: 444-490 нм; эмиссия: 515 нм долгосрочной фильтр; настройки сбора: 500-720 в 10 нм шагов) и красный светофильтры для Texas Red (возбуждение: 576-621 нм; выбросов: 635 нм долгосрочной фильтр; приобретение Настройки: 630-800 в 10 нм шагов). 10 мс время экспозиции для GFP и 150 мсек для Texas Red.
  4. Сразу же после измерения флуоресценции всей ткани, собирать опухолевые ткани, исправить формалином, и cryosection в 5 мкм ломтиками.
  5. После промывки PBS, крепление с 1 каплей монтажа среде, содержащей 4 ',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), изображение сразу на конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

5. Магнитно-резонансная томография (МРТ)

  1. Приблизительно через 4 недели после инокуляции опухолевых клеток, позволяют опухоли расти до 0,3-0,6 см в диаметре. Используйте сканер 7 Т МРТ с объемной частоты (RF) катушки для исследования МРТ радио.
  2. Обезболить мышь с 2%-ным раствором изофлюран-кислород в изофлурана индукции камеры. Офелияthalmic мазь наносили на мыши, чтобы поддерживать адекватную влажность во время анестезии.
  3. Вставьте 30 иглы в 1,0 м в длину трубки, заполненной гепаринизированным физиологическим раствором. Поместите самодельную катетер в хвостовой вену мыши.
  4. Место мыши в магнит и держать под ингаляционной анестезии с 1,5% изофлуран-кислород через носовой конус.
  5. Поставьте дыхания датчика, подключаемого к системе мониторинга на животе, чтобы контролировать частоту и глубину дыхания. Поддержание температуры тела при 37 ° С продувкой горячего воздуха во магнита через систему управления с обратной связью.
  6. Начните с сагиттальной разделе изображений, используя последовательность локализующий определить местоположение опухоли (TR / TE = 200/3.7 мс, FOV = 3,0 см, толщина среза = 2,2 мм, ломтик число = 16, средний = 2, флип угол = 45 °, матрица = 128 х 128).
  7. Используйте 2D Т1-градиента последовательность жира подавления приобрести 2D осевые изображения для CE-МРТ (TR / TE = 151.2/1.9 мс, FOV = 3,0 см х 3,0 см, сТолщина вши = 1,2 мм, количество ломтик = 12, средний = 1, флип угол = 80 °, матрица = 128 х 128).
  8. После предварительного впрыска приобретения базовой МР изображении, начинают вводить целевого агента или агента управления в дозе 0,03 ммоль Gd / кг путем промывки 200 мкл физиологического раствора.
  9. Продолжайте получать изображения CE-МРТ в различные моменты времени до 30 мин.

6. Обработка изображений и анализ

  1. Используйте для обработки изображений для анализа изображений.
  2. Нарисуйте регионах, представляющих интерес (Rois) по всей опухоли и почки в двумерной плоскости изображения и измерить среднюю интенсивность сигнала.
  3. Для количественной оценки данных CE-МРТ, измерить опухоль или почек повышение контрастности (ΔSNR) на расчете увеличением после контрастного SNR над предварительно контрастного SNR, используя следующее уравнение: ΔSNR = (S т / σ т) - (S 0 / σ 0), где S 0 и S т обозначим сигнал в свою очередьили или почки до и после контрастность и σ 0 и σ т являются стандартное отклонение шума измеряется от фонового воздуха до и после контраста.
  4. Рассчитать значения р, используя двустороннюю т-тест студента, предполагая статистическую значимость при р <0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 показана синтез целевого контрастного агента CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 и общей схеме эксперимента. CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 показывает намного выше, чем релаксация клинической Gd-DOTA (табл. 1). В 1,5 Т, T 1 релаксация за гадолиния из CLT1-DL-(GD-DOTA) 4 в PBS (рН 7,4) примерно в 3 раза выше, чем у Gd-DOTA 10. Изображений Maestro подтверждает сильное специфическое связывание Техаса Красная помечены CLT1 (CLT1-TR), чтобы опухоли с немного связывани...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Критические шаги

Выбор надлежащего Biomarker и с прицелом на небольшие пептид

Для успешной разработки целевой контрастное вещество с небольшой размер, два ключевых момента необходимо учитывать. Во-первых, важно выбрать правильный молекулярные биомаркеры, которые в большом количестве присутствуют в больные ткани с небольшим присутствием в нормальных тканях. Наша выбран связанных с раком биомаркеров, со сгустками белки плазмы, удовлетворяет этому треб...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа частично поддержана Американской ассоциации сердца ГРА Весна 09 докторантуру (09POST2250268) и NIH R01 CA097465. Мы высоко ценим доктора Вэнь Ли и д-р Викас Gulani для испытания протокола МРТ и настройки, и г-жу Yvonne Паркер за ее помощь в имплантации опухоли.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
Fmoc защищенные аминокислотыEMD Chemicals Inc
DOTA-tris(t-Bu)TCI America PyBOP
, HOBt, HBTUNova Biochem
DIPEA, трифторацетат таллия(III), TISSigma-Aldrich Corp.
Texas Red, сукцинимидиловый эфир, один изомерInvitrogenT20175
EQUIPMENTS
Agilent 1100 система ВЭЖХAgilent
ZORBAX 300SB-C18 PrepHT колонкаAgilent
ICP-– S Optima 3100XLPerkin-Elmer
MALDI-TOF масс-спектрометрBrukerAutoflexTM Speed
Maestro FLEX In vivo Imaging SystemCambridge Research Instrumentation, Inc.
МРТ-сканер Biospec 7TBruker

Ссылки

  1. Brown, M. A., Semelka, R. C. MRI Basic Principles and Applications. , 3rd, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. (2003).
  2. Artemov, D. Molecular magnetic resonance imaging with targeted contrast agents. J. Cell. Biochem. 90, 518-524 (2003).
  3. Kalber, T. L., Kamaly, N., et al. A low molecular weight folate receptor targeted contrast agent for magnetic resonance tumor imaging. Mol. Imaging Biol. 13, 653-662 (2011).
  4. Schmieder, A. H., Winter, P. M., et al. Molecular MR imaging of melanoma angiogenesis with alphanubeta3-targeted paramagnetic nanoparticles. Magn. Reson. Med. 53, 621-627 (2005).
  5. Mulder, W. J., Strijkers, G. J., et al. MR molecular imaging and fluorescence microscopy for identification of activated tumor endothelium using a bimodal lipidic nanoparticle. FASEB J. 19, 2008-2010 (2005).
  6. Wang, S. J., Brechbiel, M., Wiener, E. C. Characteristics of a new MRI contrast agent prepared from polypropyleneimine dendrimers, generation 2. Invest. Radiol. 38, 662-668 (2003).
  7. Amirbekian, V., Aguinaldo, J. G., et al. Atherosclerosis and matrix metalloproteinases: experimental molecular MR imaging in vivo. Radiology. 251, 429-438 (2009).
  8. Overoye-Chan, K., Koerner, S., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J. Am. Chem. Soc. 130, 6025-6039 (2008).
  9. Pilch, J., Brown, D. M., et al. Peptides selected for binding to clotted plasma accumulate in tumor stroma and wounds. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 2800-2804 (2006).
  10. Rohrer, M., Bauer, H., Mintorovitch, J., Requardt, M., Weinmann, H. J. Comparison of magnetic properties of MRI contrast media solutions at different magnetic field strengths. Invest. Radiol. 40, 715-724 (2005).
  11. Wu, X., Burden-Gulley, S. M., et al. Synthesis and evaluation of a peptide targeted small molecular Gd-DOTA monoamide conjugate for MR molecular imaging of prostate cancer. Bioconjugate Chem. 23, 1548-1556 (2012).
  12. Burden-Gulley, S. M., Gates, T. J., et al. A novel molecular diagnostic of glioblastomas: detection of an extracellular fragment of protein tyrosine phosphatase mu. Neoplasia. 12, 305-316 (2010).
  13. McBride, J. D., Birgit, H., Leatherbarrow, R. J. Resin-coupled cyclic peptides as proteinase inhibitors. Protein and Peptide. 3 (3), 193-198 (1996).
  14. Cline, D. J., Thorpe, C., Schneider, J. P. General method for facile intramolecular disulfide formation in synthetic peptides. Anal. Biochem. 335 (1), 168-170 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Gd DOTA
MR молекулярной визуализации рака простаты с небольшой молекулярной CLT1 пептида целевых Агента Contrast
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.