Методическая статья

Сотовые смерти, связанной с аномальными митоза Наблюдаемые конфокальной микроскопии в живых клетках рака

14.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50568

⸱

21 августа 2013 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 2The Neufeld Cardiac Research Institute, Tel-Aviv University, 3Department of Physiology and Pharmacology, Tel-Aviv University, 4Imaging Unit, Sackler Faculty of Medicine, Tel-Aviv University, 5Biotechnology and Cell Signaling, Ecole Superieure de Biotechnologie Strasbourg, 6Department of Human Molecular Genetics and Biochemistry, Tel-Aviv University

В этой статье

Краткое содержание

Цитотоксической активности фенантридин PJ-34 в раковых клетках митоз было зафиксировано в реальном времени с помощью конфокальной микроскопии живых. PJ-34 искоренили рака молочной железы человека MDA-MB-231 клетки укрывательство особо центросомам в митоза. В отличие от обычных бифокальные митоза, экстра-центросомам не были сосредоточены в двух полюсах веретена в присутствии PJ-34.

Аннотация

Фенантрен производные действуют как мощные ингибиторы PARP1 помешало бифокальные кластеризации нештатных центросомам в мульти-центросомной человеческих раковых клеток в митозе. Фенантридин PJ-34 был самым мощным молекулы. Декластеризация экстра-центросомам вызывает отказ митотических и гибель клеток в многоквартирных центросомной клеток. Большинство твердых опухолей человека имеют высокую возникновения экстра-центросомам. Деятельность PJ-34 было зафиксировано в реальном времени с помощью конфокальной микроскопии живых рака молочной железы человека MDA-MB-231 клеток, трансфицированных векторов, кодирующих для люминесцентных γ-тубулина, который очень распространен в центросомам и для люминесцентных гистонов в настоящее H2b хромосом. Аномальные механизмы хромосом и де-кластерной γ-тубулина очагов представляющих declustered центросомам были обнаружены в Трансфицированные MDA-MB-231 клеток после лечения с PJ-34. Un-кластерной экстра-центросомам в два полюса шпинделя предшествовало их гибели клеток. Эти результаты связаны FOR впервые недавно обнаружены эксклюзивные цитотоксической активности PJ-34 в раковых клетках человека с очень центросомам де-кластеризации в митоза и митотического недостаточности приводит к гибели клеток. В соответствии с предыдущими выводами наблюдали конфокальной микроскопии фиксированных клетках, PJ-34 исключительно искоренить раковые клетки с несколькими центросомам не повреждая нормальные клетки митоз с двумя центросомам и бифокальные шпинделей. Это цитотоксической активности PJ-34 не разделяют другие мощные ингибиторы PARP1, и наблюдался в PARP1 дефицитный MEF укрывательстве extracentrosomes, предлагая свою независимость PARP1 торможения. Живите конфокальной микроскопии предложили полезным инструментом для выявления новых молекул искоренения клетки во время митоза.

Введение

Фенантрен полученных PARP1 ингибиторов, в том числе PJ-34, предназначены для защиты покоящихся клеток от апоптоза индуцированных энергоемкие PARP1 опосредованной репарации ДНК в условиях стресса (инсульт или инфаркт миокарда) 1. Однако в последнее время мы обнаружили, что PJ-34, в два раза большей концентрации, чем вызывающие PARP1 торможения, может только вызвать гибель клеток в раковые клетки человека 2,3. Чем быстрее пролиферацию клетки было, тем более эффективным искоренением клетки было. Цитотоксической активности PJ-34 был приписан к дополнительным центросомам-де-кластеризации в митозе 2. Многие человеческие раковые клетки гавани multicentrosomes 4,5. Инкубация человека клеток рака молочной железы MDA-MB-231, который питает сверхштатный центросомы, с 20 мкМ PJ-34 эффективно искоренить эти клетки в течение 72-96 часов без ухудшения покоящихся клеток или некоторые доброкачественные пролиферативные клетки несущий две центросомы в митозе 2,3. Доброкачественные клетки включены человеческие эпителиальные клетки молочной железы MCF-10, эндотелиальные клетки человека (HUVEC) и первичные мезенхимальные клетки, полученные из тимуса человека. Эти клетки были устойчивы к цитотоксической активности PJ-34. PJ-34 не вмешиваться в их клеточного цикла в течение 96 ч инкубации или влиять на их центросомам и бифокальные шпинделя образование 2,3.

Биполярное центросоме Ассамблеи имеет решающее значение для формирования биполярного веретена в митозе 4,5. Таким образом, клетки, имеющие более двух центросомы разработали едва понимать молекулярные механизмы, кластеризации их дополнительное центросомы на два полюса 4-9. Отказ биполярной сборки их центросомам может вызвать искаженное многополярного шпинделей и сегрегации хромосом аберрантными что аресты клеточного цикла в G2 / M ареста, и приводит к гибели клеток связано с недостаточностью митотического 4,5. Молекулярные механизмы, лежащие в основе экстра-де-центросомам кластеризации интенсивно исследуются <вир> 10. Понимание этого механизма смерти позволит эксклюзивные искоренение раковые клетки, щадя здоровые ткани 5,10.

Таким образом, соединения, которые активируют митотической катастрофы гибель клеток предложить новый способ селективной терапии рака, который может быть эффективным в широком диапазоне человеческого твердых cancers.Our результаты показывают, что конфокальной микроскопии может быть использован для идентификации молекул, влияющие экстра-центросомы кластеризации митоза 2,3, оказания этих соединений рака таргетинга лекарств-кандидатов.

Мы документировали цитотоксической активности фенантридин PJ-34 при сканировании фиксированных и живых раковых клеток человека (с высокими возникновения экстра-центросомы в митоз) по сравнению с нормальными клетками. Шаг за шагом, описание процедуры отображения используются для определения цитотоксической активности PJ-34 в человеческих раковых клеток приведен ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка клеточной культуры

MDA-MB-231 клетки были получены от АТСС (Американской коллекции типовых культур) и хранили в жидком азоте.

  1. Семенной 10 6 MDA-MB-231 клеток в 92 мм чашки Петри в 10 мл полной среды, содержащей Dulbeco изменения среду Игла (DMEM), 10% лошадиной сыворотки, 1% L-глутамина и 1% Penstrep-Amphotericine B. Разрешить клетки разрастаться до 80-100% слияния.
  2. Удалить из культуральной среды блюдо и отказаться.
  3. Промыть слой клеток вкратце с 0,25% (вес / объем) Трипсин-ЭДТА, чтобы удалить все следы сыворотки.
  4. Добавить 2,0 мл трипсина-EDTA решение блюдо и наблюдать клетки инвертированного микроскопа, пока слой клеток не разгоняется (обычно в пределах от 5 до 15 мин).
  5. Добавить 18 мл полной среды роста и осторожно аспирации клеток с помощью пипетки. Трансфер в трубке.
  6. Центрифуга клеточной суспензии при 1200 оборотах в минуту.
  7. Повторное приостановить осадок клеток в 24 мл Culture среды.
  8. Добавить 2 мл клеточной суспензии до 35 мм со стеклянным дном блюда (около 25% слияния) и место в инкубаторе (5% CO 2, 37 ° C).
  9. Решения:
    1. Полной среде в течение пролиферацию клеток: DMEM с 10% FBS, 1% антибиотиков (100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, Pen-Strep-Ampho раствор) и 2 мМ L-глутамина.
    2. Трипсин-ЭДТА, содержащем 0,25% трипсин-ЭДТА.
  10. Блюда:
    Диаметром 92 мм чашки Петри.
    Диаметром 35 мм поли-D-лизин покрытием блюд со стеклянным дном культуры.

2. Подготовка Клетки для живых конфокальной микроскопии

  1. Семенной 2 х 10 5 MDA-MB-231 клеток в культуре со стеклянным дном блюда в 2 мл полной среды, как указано в разделе 1. Когда культура клеток достигает слияния 60-70% (около 3-4 х 10 5 клеток на чашку), переходите к трансфекции.
  2. Трансфекции клеток с двух плазмид ENCODING слитых белков γ-тубулина-GFP (для флуоресцентной детекции центросом) и гистонов-RED (H2b-красные, для флуоресцентной детекции хромосом) с помощью липосомальной трансфекции реагента Jet-PI, после изготовления протокола. Вкратце, смешать с 2 мкг каждой плазмиды в пробирке с помощью 100 мкл NaCl (150 мМ). Смешать реагента для трансфекции (100 мкл) с помощью 100 мкл NaCl (150 мМ) в вторую трубку, и инкубируют 5 мин при комнатной температуре (RT). Затем объединить два решения, смеси (с использованием мягкого вихря) и спин-вниз. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. При инкубации трансфекции смесь, промыть клетки один раз ЗФР и заменить клеточной среде с 2 мл теплой DMEM без каких-либо добавок (37 ° C).
  4. Аккуратно добавить трансфекции смесь клеток в DMEM, а затем вернуть клеткам в инкубатор (37 ° C, 5% СО 2) в течение 8 часов.
  5. Через 8 часов инкубации заменить DMEM с 2 мл полной среды и инкубируют клетки в инкубаторе в течение 24HR.
  6. Через 24 часа после трансфекции, замените среда клеток с 2 мл полной среды, содержащей 20 мкМ PJ-34.
  7. Инкубируйте клетки еще 18 ч (37 ° C, 5% СО 2).
  8. Тема клетки жить конфокальной микроскопии в течение не менее 16 часов в камере изображений поддержания клеток на 5% СО 2 и 37 ° C.
  9. Параллельно, изучить эффективность трансфекции 36 ч после трансфекции с использованием флуоресцентной микроскопии следующим образом:
    1. Семенной 2 х 10 5 MDA-MB-231 клеток в 6-луночный планшет, содержащий 1 покровное на лунку в 2 мл полной среды.
    2. Трансфекции клеток, как указано в разделах 2.2-2.5.
    3. 36 ч после трансфекции зафиксировать трансфицированных клеток установлен на покровное инкубацией в холодный метанол: ацетон (1:1), 7 мин, -20 ° С.
    4. Аспирируйте фиксирующем растворе и пусть покровное с установленными клетки для просушки в химической капотом.
    5. Применить продлить реагента золото Antifade с DAPI и пусть йэлектронной покровного сушить в темноте в течение 6 часов.
    6. Изучите скользят под флуоресцентным микроскопом и вычислить процент трансфекции клеток (красный и зеленый сигналы) от общей популяции клеток (ДНК окрашивания DAPI). Желаемый трансфекции процент составляет около 20-40% при 100-200 клетки подсчитывают.

3. Технические параметры жить конфокальной настройки сканеров

  1. XYZT режиме сканирования; Пинхол [воздушный] 1,00; Увеличить 3,5; разрешение 8 бит; Лазерная DPSS 561 нм; Аргон, видимый лазер 488 нм; лазерная / Ne видимой длине волны 633 нм; Цель HCX PL APO CS 63X 1,40 УФ маслом; числовая апертура 1,4; Скорость сканирования 700 Гц, показатель преломления 1,52.
  2. Изображение 3-D презентация были подготовлены Imaris обработки изображений 7.0.

4. Конфокальной микроскопии митоза в фиксированных клетках

  1. Семенной 2 х 10 5 MDA-MB-231 клеток рака молочной железы (АТСС), нормальные мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) или PARP1 дефицитный MEF (PARP - / -, подготовленной д-ром Франсуаза Dantzer) на покровных стеклах в 6-луночный планшет в 2 мл полной среды. Покровные слои промывают 96% этанолом, после стирки путем стерильной водой DD, сушат в течение 2 ч и помещали в каждую лунку 6-луночный планшет.
  2. Добавить PJ-34 (10-30 мкм) в среду и инкубировать клетки в течение требуемого периода (обычно до 96 ч).
  3. Промыть покровные один раз ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор) и зафиксировать клетки с использованием инкубации в охлажденном льдом метанол: ацетон (1:1), 7 мин, -20 ° С.
  4. Аспирируйте фиксирующем растворе и пусть покровные высохнуть в капот химическая (на данном этапе, покровные может храниться в -20 ° С в течение нескольких недель).
  5. Промыть покровные один раз PBST (PBS, дополненную 0,1% Твин-20), чтобы проницаемость клеточной мембраны и блокировать клетки с 10% NDS (нормальный осел сыворотка) в PBST ('блокирующий раствор) в течение 1 часа при комнатной температуре.
  6. Выдержите проницаемыми фиксированные клетки с первичными Antibodiы в течение 2 ч при комнатной температуре (для окрашивания шпинделей и центросомы). Антител разводят в блокировании решения следующим образом: анти-α тубулина (1:250 разведение) и анти-γ тубулина (разведение 1:200). Первичные антитела применяются следующим образом: применяют 100 мкл (по капле) смеси из антител в блокирующем растворе для каждого покровное на 6-луночный планшет крышки (крышки вверх дном). Осторожно положите покровное на каплю антитела, отобранные клетки, стоящие перед падением. Инкубируйте покровные сталкивается с антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
  7. Поместите покровные обратно в скважины и промыть клетки 3 раза PBST. Затем с помощью той же процедуры, описанной в 4,6 мечения клеток на покровных стеклах с флуоресцентным вторичных антител. Инкубируйте клетки на покровных стеклах с вторичными антителами в течение 1 часа, РТ, в темноте. Антитела разводили в блокирующем растворе следующим образом: Alexa Fluor 488 (разведении 1:1000; зеленый) и Alexa Fluor 568 (разведении 1:1000;красный).
  8. Установите покровные использованием реагента продлить Золото Antifade с DAPI (для окрашивания хромосом) и инкубировать в течение ночи при комнатной температуре в темном, чтобы высохнуть.
  9. Изучите покровные стекла с помощью конфокальной микроскопии.

5. Жизнеспособность клеток Измеряется продукции АТФ

АТФ измеряется с помощью люминесцентного обнаружения набора для анализа АТФ.

  1. Семенной клеток в 96-луночный планшет, приблизительно 20000 клеток в 800 мкл среды в каждую лунку. Три контрольных лунок следует использовать для определения фонового свечения среды.
  2. Подготовка АТФ стандартной серии разведений от приблизительно 10 мкм до 100 мкм и держать на льду.
  3. Добавить 50 мкл моющего средства в каждую лунку и встряхните пластине в течение 5 мин в орбитальный шейкер, 700 оборотов в минуту.
  4. Разведите каждый флакон 'Субстрат лиофилизированного' с 5 мл 'субстратный буфер "в наборе.
  5. Добавить 50 мкл восстановленного раствора субстрата в лунки и встряхиваютпластине в течение 5 мин на орбитальном шейкере, 700 оборотов в минуту.
  6. Храните в темном пластину в течение 10 мин.
  7. Измерение люминесценции каждой лунки на микропланшет-ридера ELISA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

PJ-34 является стабильным водорастворимые фенантридин 1 (рис. 1). Наши предыдущие результаты показали гибель клеток и де-кластерной экстра-центросомам в нескольких видов основных несколькими центросомной раковые клетки, которые лечились PJ-34. В отличие от нормальных пролиферирующих клеток не нарушается 2,3. Центросомы были определены двойной маркировки с антителами, направленными против centrine1 и γ-тубулина в фиксированном экстра-центросомной клетки 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Живой конфокальной микроскопии при условии реального времени документацию цитотоксический эффект PJ-34 в живом мульти-центросомной клеток при митозе (фиг. 3 и дополнительную информацию). Это было первое живое документации приписывая цитотоксичность PJ-34 в человеческих раковых клеток к дополнительным центросомам де-кластеризации и гибели клеток, предполагая, индукция отмирания клетки катастрофу PJ-34 5-9. В противоположность этому, бифокальные кластеризации супер-нумерарий центросомам наблюда...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Источники финансирования этого исследования: совместный фонд технологий Тель-Авивского университета трансфертной компании, RAMOT и Шеба-медицинский центр (М. СА и СИ.), ICRF - израильские железы исследовательский фонд (М. CA.) И Израиль научного фонда ( СИ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
DMEMInvitrogen (GIBCO)41965 
FBS (Фетальная бычья сыворотка)Invitrogen (GIBCO)12657 
Pen-Strep-Ampho solutionBiological Industries, Израиль03-033-1B 
L-глютаминInvitrogen (GIBCO)25030-024 
0,25% Трипсин-ЭДТАИнвитроген (GIBCO)25200 
Чашки Петри 92 ммNunc,Thermo scientific150350 
35 мм посуда для культуры со стеклянным дном с поли-D-лизиновым покрытиемMatTek Corporation, СШАP35GC-0-14-C 
Набор для обнаружения люминесцентной АТФAbcamab13849 
NDS (нормальная ослиная сыворотка)Jackson ImmunoResearch017-000-121 
Антитело к α-тубулинуSigmaT9026разведение 1:250 (IF)
Антитело к γ-тубулинуSigmaT5192разведение 1:200 (IF)
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgGInvitrogenA-11017разведение 1:1,000 (IF)
Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgGInvitrogenA-10042разведение 1:1,000 (IF)
Реагент ProLong Gold antifade с DAPI (крепление)InvitrogenP36935 
JetPEI (липосомальный реагент для трансфекции)Polyplus101-10 
EQUIPMENT
Конфокальный микроскопLeica (Мангейм, Германия)TCS SP5II 

Ссылки

  1. Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
  2. Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412(2011).
  3. Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78(2009).
  4. Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
  5. Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
  6. Doxsey, S. Re-evaluating centrosome function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2, 688-698 (2001).
  7. Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
  8. Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
  9. Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
  10. Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
  11. Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
  12. Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
  13. Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
  14. Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
  15. Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
  16. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

PJ 34H2bPARP1MDA MB 231

Похожие статьи