Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Трансплантация Обонятельная оболочечная клеток для оценки функционального восстановления после периферической нервной травмы

11.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50590

⸱

23 февраля 2014 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1UPRES EA3830, Institute for Research and Innovation in Biomedicine, University of Rouen, 2Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Rouen University Hospital, 4Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery Department, Amiens University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Обонятельная оболочечная клетки (ОИК) являются клетки нервного гребня, которые позволяют рост первичных обонятельных нейронов. Это специфическое свойство можно использовать для клеточной трансплантации. Мы представляем здесь модель клеточной трансплантации, основанный на использовании ОИК в гортани модели нерва травмы.

Аннотация

Обонятельная оболочечная клетки (ОИК) являются клетки нервного гребня, которые позволяют рост и возобновление роста основных обонятельных нейронов. Действительно, основная обонятельная система характеризуется своей способности давать начало новым нейронам даже у взрослых животных. Данный способность Отчасти это связано с наличием ОИК, которые создают благоприятную микросреду для нейрогенеза. Это свойство ОИК был использован для клеточной трансплантации, например, в спинальных моделей травмой. Хотя периферическая нервная система имеет большую емкость, чтобы восстановить после повреждения нерва, чем центральной нервной системы, заполняют разделы вызвать misrouting во аксонов отрастания, в частности после лица гортани нерва перерезки. В частности, полный секционирование возвратного гортанного нерва (РЛУ) индуцирует аберрантное аксонов отрастания в результате синкинезий голосовых связок. В этом конкретной модели, мы показали, что трансплантация ОИК эффективно увеличивает аксонов отрастания. ve_content "> ОИК состоят из нескольких субпопуляций, присутствующих в обоих обонятельной выстилки (ОМ-ОИК) и обонятельных луковиц (OB-ОВКГ). Здесь мы приведем модель клеточной трансплантации, основанный на использовании этих различных субпопуляций ОИК в RLN модель травмы. Используя эту парадигму, первичные культуры OB-ОИК и ОМ-ОИК были пересажены в Матригель после раздела и анастомоза РЛН. Через два месяца после операции, мы оценили пересаженных животных путем дополнительных анализов на основе videolaryngoscopy, электромиографии (ЭМГ) и гистологические исследования. Во-первых, videolaryngoscopy позволило нам оценить функции гортани, в частности мышечные cocontractions явления. Тогда, ЭМГ анализ показал, богатство и синхронизацию мышечных деятельности. Наконец, гистологические исследования, основанные на толуидиновым синего окрашивания позволило количественная оценка числа и профиля миелинизированных волокон.

Все вместе, мы описываем здесь, как изолировать, культура, IDEntify и пересадка ОИК от ОВ и ОВ после РЛУ разделе-анастомоза и как оценить и проанализировать эффективность этих трансплантированных клеток на аксонов отрастания и гортани функций.

Введение

Основная обонятельная система состоит из двух отдельных частей; обонятельной выстилки (OM) в периферической нервной системы и обонятельной луковице (OB) в центральной нервной системе. Основная обонятельная система характеризуется мощностью первичных обонятельных нейронов (PON) на самообновлению на протяжении всей жизни в млекопитающих. Эта способность становится возможным благодаря наличию нервных стволовых клеток в ОМ. Рост PON и отрастания от ОМ к OB облегчается специализированных глиальных клеток, называемых Обонятельная оболочечная клетки (ОВКГ). ОИК являются клетки нервного гребня, которые создают благоприятную микросреду для нейрогенеза в PON от ОМ в OB 1. Таким образом, ОИК можно найти в ОМ и в OB, составляющих разные субпопуляции клеток 2,3. Различные свойства ОИК имеют свинца ученым использовать их для сотовых трансплантаций в нескольких нервной системы поражения парадигм 4. Действительно, ОИК факторы роста продукции, снизить глиальных пугать, пр.омотэ аксонов отрастания, и может свободно смешиваются с астроцитов 5,6. Тем не менее, подавляющее большинство из этих исследований основаны на травмы спинного мозга (SCI); некоторые из них использовали ОИК после травмы периферических нервов (PNI) 7,8.

Хотя периферическая нервная система имеет большой потенциал к регенерации после повреждения нерва, заполняют разделы вызвать аномальное аксонов отрастания. Действительно, после полных transections лицевого или возвратного гортанного нервов (RLN) ошибочно доставленными аксоны вызвать мышечные cocontractions называемые синкинезия. Поэтому первостепенное значение для предложить модель PNI не только количественно аксонов отрастания но и оценить эффективность работы мышечных сокращений. В литературе наиболее распространенным модель, описанная основана на лицевой нерв поражения 9,10. В этой модели, функциональные оценки основаны на восстановлении нитевидных движений 10. Однако это сложно, чтобы продемонстрировать эффективность MOVВЫРАЖЕНИЕ и различать мышечные cocontractions явления. Мы предлагаем здесь модель, основанную на поражения РЛУ. Эта модель позволяет оценить не только аксонов отрастания и движений голосовых связок, но и эффективности и функциональности этих движений после клеточных трансплантаций 11,12. Этот протокол обеспечивает шаг за шагом процедуры до культурных и трансплантации ОИК от ОВ и ОВ в модели RLN раздел / анастомоза и оценить животных после операции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Первичные культуры обонятельной выстилки и обонятельных луковиц

  1. До вскрытия
    1. Сделать среде, 50 мл, добавляя 44 мл бескальциевой Игла в модификации Игла / среды F12 Хэма (DMEM/F12) с добавлением 5 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1 мл пенициллина / стрептомицина.
    2. Coat 75 см 2 колбы с поли-L-лизина (50 мкг / мл, 1,5 мкг / см 2), 1 ч при комнатной температуре.
    3. Промыть колб с PBS 1x.
    4. Храните покрытием колбы в холодильнике до 1 недели.
  2. Рассечение
    1. Любой метод эвтаназии должны быть заранее одобрены уходу и использованию животных комитета учреждения и осуществляется квалифицированным персоналом.
    2. Выберите инбредных крыс, такие как крыс Фишера.
    3. После того, как крыса была подтверждена вступившим глубокую анестезию пентобарбиталом натрия или других инъекционных форм, таких как анестезией кетамином / ксилазином, обезглавить его и Rалить кожу.
    4. Откройте череп от переднего до заднего части.
    5. Снимите уход О.Б. брать, чтобы избежать мозговых оболочек.
    6. В то же крысы, откройте носовой полости sagittaly.
    7. Удалить О.М. стараясь избежать слизистой дыхательных путей. Обратите внимание, что эпителий ОМ можно легко определить по его желтоватого цвета.
    8. Далее подробные протоколы о вскрытии ОМ можно найти в одном из предыдущих J. Видимый Опыт . Издание 13.
  3. Культура
    1. Поместите OB в забуференном солевом растворе Хэнкса (HBSS), содержащий 0,1% трипсина в течение 45 мин при 37 ° С
    2. Наведите ОМ в HBSS, содержащим 0,05% коллагеназы А в течение 45 мин при 37 ° С
    3. Стоп ферментативного расщепления путем добавления 2 мл теплой среды.
    4. Вымойте клетки со средой и отцентрифугированы при 300 мкг в течение 3 мин.
    5. Растирают образцы 2мл среды с использованием пипетки P1000, пока не будет получена однородная суспензия клеток.
    6. Пластина клеток в Precoated колбы (5-10 х 10 6 клеток / колбу) с 25 мл теплой среды.
    7. Выдержите и культура клетки при 37 ° C с 5% CO 2.
    8. Изменение половины среды каждые 2 дня.
    9. Через 6-8 дней в пробирке, проверьте пропорцию р75-позитивных клеток на образцах малых клеток, предполагается, что ОИК у грызунов, с помощью проточной цитометрии или иммуноцитохимии. Для этих анализов, другие маркеры могут быть изучены такие как GFAP и S100β.
  4. Проточной цитометрии анализа
    1. Сбор клеток, как описано в "клеточной трансплантации" (раздел 2.2 ниже).
    2. Инкубировать их с p75 первичного антитела (1:100) в течение 15 мин при 4 ° С.
    3. Вымойте клетки с 2 мл PBS-EDTA и отцентрифугированы при 300 мкг в течение 3 мин.
    4. Инкубируйте клетки с PE сопряженного антимышиным вторичным антителом во 15мин при 4 ° С в темноте (1:200).
    5. Вымойте клетки с 2 мл PBS-EDTA и отцентрифугированы при 300 мкг в течение 3 мин.
    6. Ресуспендируют клеток в 500 мкл PBS-EDTA.
    7. Анализ 10-30 х 10 3 клеток с потока-цитометром.
  5. Анализ Иммуноцитохимия
    1. Пластина клеток в 6-луночные планшеты, предварительно покрытых в течение 48 ч, как описано в "культуры" (раздел 1.1.2 ниже).
    2. Вымойте клетки с PBS.
    3. Фиксации клеток с 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
    4. Вымойте клетки с PBS.
    5. Инкубируйте клетки с PBS / Triton X100 (0,1%) в течение 15 мин при комнатной температуре.
    6. Вымойте клетки с PBS.
    7. Инкубируйте клетки с первичными антителами (1:200): p75, S100β и GFAP в течение ночи при 4 ° С.
    8. Вымойте клетки с PBS.
    9. Инкубируйте клетки с вторичными антителами (1:500) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    10. Вымойте клетки с PBS.
    11. Инкубируйте клетки с Hoechst 10 мин при RТ в темноте.
    12. Вымойте клетки с PBS.
    13. Анализ клеток с помощью флуоресцентного микроскопа.
  6. GFP маркировки клеток
    1. За пять дней до трансплантации, заразить OB и OM культур ночь лентивирусным вектора, несущего повышенную GFP (множественность инфекции: 20).
    2. Перед проверкой трансплантации на малых выборках размере GFP-положительных клеток с помощью проточной цитометрии, как описано ранее в «культура» (раздел 1.1).

2. Хирургии и трансплантации

  1. Возвратный нерв анастомоза
    1. Все эксперименты с животными должны быть предварительно одобрены уходу и использованию животных комитета учреждения и осуществляется квалифицированным персоналом.
    2. До автоклаве хирургии все инструменты и поддержания стерильности в течение хирургических процедур.
    3. Обезболить крысу путем внутрибрюшинной инъекции кетамина гидрохлорид (12,5 мг / кг) и гидрохлорид хлорпромазина (0,625 мг / кг). Оценка адекватности анестезии пальца щепоткой до операции.
    4. Поместите крысу в положении лежа на спине.
    5. Выполните 2 см по вертикали среднего шейки кожный разрез скальпелем.
    6. Выполните вертикальный разрез из подъязычный мышцы после медиальной белой линии.
    7. Expose гортань с помощью автостатический втягивающим между подъязычный мышц.
    8. Вынести RLN.
    9. При микроскопическом контроля, перерезать нерв полностью с microscissors на уровне седьмого кольца трахеи.
    10. Выполните анастомоз с использованием одной точки 11,0 шва под микроскопическим контролем. Эта операция приводит к определенной двигательной денервации гортани.
  2. Сотовый трансплантации
    1. Просто перед трансплантацией, удаления клеток из блюд с использованием 0,05% трипсин ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С
    2. Стоп ферментативного расщепления путем добавления 2 мл теплой среды.
    3. Центрифуга при 300 мкг в течение 3 мин.
    4. Под микроскопом подсчитать клетки с помощью гемоцитометра и регулировать клеточную концентрацию в соответствии с определенным протоколом. В этой модели, требуемые концентрации были между 1.2-6 х 10 6 клеток в 30 мкл DMEM/F12.
    5. Сделать сотовой подготовку с 1:02 смеси (30 и 60 мкл в этом эксперименте) от DMEM/F12-Matrige л в 1,5 мл трубки до прививки и поместить его на льду. Чтобы избежать неспецифических эффектов, используйте фактор роста снижается Матригель.
    6. Просто перед трансплантацией провести трубку в вашей руке в течение нескольких секунд, чтобы разогреть матригелем среднего микс.
    7. Свергнуть смесь на анастомоза с помощью пипетки и ждать, пока смесь не самосборки для потерпевшего нерва.
    8. Закройте мышцы и кожу с 4,0 швом.
    9. Дом крысы индивидуально и держать под нагревательным лампы в течение 24 часов.

3. Оценка

  1. Ларингоскопия
    1. Обезболить крыс на intraperitOneal инъекции кетамина гидрохлорида (12,5 мг / кг) и гидрохлорид хлорпромазина (0,625 мг / кг). Подтверждение крыс под наркозом с ног крайнем случае до перехода с протокола.
    2. Поместите крысу в положении лежа на спине.
    3. Вставьте в 30 ° videolaryngoscope регулироваться для обеспечения лучший вид на гортани. Определить анатомические ориентиры, чтобы воспроизвести тот же вид для каждой записи.
    4. Запишите вокальные движения мозга с помощью videolaryngoscope (5-10 последовательности / животное). Для каждого животного выбрать три последовательности последовательных максимального приведения и максимальной похищения.
    5. Анализ функции гортани с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Определить абсолютную угловое перемещение путем измерения разницы между движением максимальной похищения и максимальной приведение голосовых связок. Определение динамической оценки путем измерения амплитуды движения. Определите функциональный счет путем измерения синкинезий и парадоксальный движения.
  2. Электромиография (ЭМГ)
      Поместите электрод на подколенного сухожилия мышц крысы для электрической изоляции.
    1. Expose гортани и трахеи, открыв кожу и мышцы, как описано ранее в "возвратного нерва анастомоза" (раздел 2.1).
    2. Вынести перстне хрящ.
    3. Откройте перстне хряща выставить заднюю черпаловидная (СПС) мышц с помощью microscissors.
    4. Представьте монополярную игольчатый электрод (38 х 0,45 мм) в мышцах PCA.
    5. Запишите электрической мышечной активности мышцы PCA, используя систему сбора при спонтанном вентиляции.
    6. Анализ мышечную активность с точки зрения богатства и синхронизации с дыханием. Для анализа EMGS, определения качественного оценку от 0-3, используя следующую шкалу: 0: нерифмованные трассировки, без увеличения во время вдоха, 1: рифмованные трассировки вдоха увеличивается, но плохое отслеживание (Neurogen), 2: рифмованные трассировки богатой деятельности, 3: рифмованные отслеживания, очень богат, составляющих такое гnterference узор, похожий на максимальной преднамеренного деятельности.
    7. Expose блуждающий нерв для измерения задержки и потенциальную продолжительность. Блуждающий нерв выбран в качестве места стимуляции потому RLN могут быть повреждены во время стимуляции из-за его небольшого размера.
    8. Стимулировать блуждающий нерв с электродом.
    9. Запись электрических сигналов в мышце PCA. Измерьте задержку и потенциальную продолжительность. Если возможно использовать модуль получения записывать мышечную активность, задержки и потенциальную продолжительность таких как системы Powerlab.
  3. Гистология
    1. Усыпить животное с помощью передозировки пентобарбитала.
    2. Удалить дистального пень РЛН под микроскопическим контролем. Дистальная часть РЛН определяется как части между анастомоза и гортани. Обратите внимание, что можно найти анастомоза несколько недель после операции, потому что 11,0 шов нерассасывающийся шов.
    3. Поместите дистальную часть РЛН в 2% глутарового альдегида с 0,1 М фосфатным(РН 7,3) в течение 2 часов при 4 ° С.
    4. Тщательно ориентироваться образцы для реализации корональные разделы.
    5. Промыть образцов в фосфатном буфере.
    6. Вырезать в меньшие сегменты (3-4 мм длины) и постфикс в течение 60 мин при комнатной температуре в 1% какодилате буферный OsO 4 и обезвоженной этанолом.
    7. Orient образцы в силиконовые формы и встроенные в смол, состоящих в POLYBED 812, DDSA и MNA, к которому добавляют 2% ускорителя BDMA.
    8. Сделать полу-тонкие поперечные срезы (1 мкм толщиной) с использованием Pyramitome Ultramicrotomy системы.
    9. Пятно с 0,1% толуидинового синего в 1% тетраборат натрия за 75 сек при 70 ° С
    10. Анализ образцов RLN с системой анализа подсчета. Подсчитайте количество волокон и измерять миелинизированные профили нервных волокон путем определения внешнюю и внутреннюю границу миелиновой оболочки.
  4. Трансплантация
    1. Подготовка клеток для трансплантации и трансплантации клеток, как описано ранеев "клеточной трансплантации" (раздел 2.2).
    2. Анализ
    3. Усыпить животное с помощью передозировки пентобарбитала. Следует отметить, что фиксация животных можно выполнить с помощью внутрисердечной инъекции PFA 4%.
    4. Удалить около 2 см РЛН. Используйте проксимального и дистального части РЛН.
    5. Fix образец RLN в жидком азоте.
    6. Храните образцы при -80 ° С.
    7. Образцы разрезаются вдоль используя криостат (10-20 мкм).
    8. Анализ образцов под флуоресцентным микроскопом для обнаружения GFP-положительных клеток. Следует отметить, что анти-GFP антитела могут быть использованы для увеличения флуоресцентное излучение и выполнять costainings.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Иллюстрации с управлением и reinnervated (раздел / анастомозировали) животные были выбраны в качестве результаты могут отличаться в зависимости от клеточных трансплантаций, выполненных (OM, OB или ОМ + ОВ).

Клеточные культуры
Клетки быстро прилипают к пластиковой поверхности и стали отделены в параллельных валков клеток, которые удлинены или сужающийся, треугольные, многополярный или веретенообразный (фиг. 1A и 1B). Через 8 дней в пробирке<...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Методы, представленные здесь сделать ОИК полезной моделью для изучения клеточных трансплантаций в периферийные устройства повреждение нерва. Протокол для культивирования клеток относительно проста и может быть легко выполнены. С другой стороны, хирургические процедуры, в частности раздел / анастомоза РЛН, требует опыта и должны выполняться квалифицированным персоналом.

Процедуры, описанные в данном протоколе выделить важные факторы, чтобы сосредоточиться на том, чтобы получить лучшие результ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить признательность Adir (Памятная местожительство Окс Insuffisants Respiratoires) и Fondation де l'Avenir за их финансовую поддержку и доктора Fanie Barnabé-Хайдер для редактирования рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEM/F12InvitrogenE3521T
FBSInvitrogenE3387M
Пеницилин/стрептомицинInvitrogen1152-8876
HBSSInvitrogenM3467Y
Trypsin-EDTAInvitrogenM3513P
CacodylateMerck1.03256.0100
DDSABiovalley00563-450
MNABiovalley00886-450
BDMABiovalley00141-100
Polybed 812Biovalley08791-500
PE антимышиныйBD Bioscience550589
Matrigel GFRBD Bioscience356231
Коллагеназа ARoche10103586001
Mouse anti P75ChemiconMAB 365
11.0 WireEthiconFG 2881
Толуидин синий Ral Diagnostics361590-0025
ЦентрифугаSigmaSigma 2-16PK
Инкубатор Thermo Scientific
Ламинарный проточный капотFasterBH-EN 2003 S
Проточный цитометрBD BioscienceFACSКалибур
МикроскопZeiss
ВидеоларингоскопKarl Storz EndoskopeTelecam SL NLSC 20212120
Система сбора данныхAD InstrumentsСистема
Система ультрамикротомии с пирамитомом LeicaUltracut S
Система анализа изображенийExplora NovaMercator
Powerlab

Ссылки

  1. Barraud, P., et al. Neural crest origin of olfactory ensheathing glia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21040-21045 (2010).
  2. Guerout, N., et al. Comparative gene expression profiling of olfactory ensheathing cells from olfactory bulb and olfactory mucosa. Glia. 58, 1570-1580 (1002).
  3. Honore, A., et al. Isolation, characterization, and genetic profiling of subpopulations of olfactory ensheathing cells from the olfactory bulb. Glia. 60, 404-413 (2012).
  4. Franssen, E. H., de Bree, F. M., Verhaagen, J. Olfactory ensheathing glia: their contribution to primary olfactory nervous system regeneration and their regenerative potential following transplantation into the injured spinal cord. Brain Res. Rev. 56, 236-258 (2007).
  5. Lakatos, A., Franklin, R. J., Barnett, S. C. Olfactory ensheathing cells and Schwann cells differ in their in vitro interactions with astrocytes. Glia. 32, 214-225 (2000).
  6. Woodhall, E., West, A. K., Chuah, M. I. Cultured olfactory ensheathing cells express nerve growth factor, brain-derived neurotrophic factor, glia cell line-derived neurotrophic factor and their receptors. Brain Res. Mol. Brain Res. 88, 203-213 (2001).
  7. Dombrowski, M. A., Sasaki, M., Lankford, K. L., Kocsis, J. D., Radtke, C. Myelination and nodal formation of regenerated peripheral nerve fibers following transplantation of acutely prepared olfactory ensheathing cells. Brain Res. 1125, 1-8 (2006).
  8. Guerout, N., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells promotes axonal regeneration and functional recovery of peripheral nerve lesion in rats. Muscle Nerve. 43, 543-551 (2011).
  9. Guntinas-Lichius, O., et al. Transplantation of olfactory ensheathing cells stimulates the collateral sprouting from axotomized adult rat facial motoneurons. Exp. Neurol. 172, 70-80 (2001).
  10. Makoukji, J., et al. Lithium enhances remyelination of peripheral nerves. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 109, 3973-3978 (2012).
  11. Guerout, N., et al. Co-transplantation of olfactory ensheathing cells from mucosa and bulb origin enhances functional recovery after peripheral nerve lesion. PloS one. 6, 22816 (2011).
  12. Paviot, A., et al. Efficiency of laryngeal motor nerve repair is greater with bulbar than with mucosal olfactory ensheathing cells. Neurobiol. Dis. 41, 688-694 (2011).
  13. Girard, S. D., et al. Isolating nasal olfactory stem cells from rodents or humans. J. Vis. Exp. , (2011).
  14. Nash, H. H., Borke, R. C., Anders, J. J. New method of purification for establishing primary cultures of ensheathing cells from the adult olfactory bulb. Glia. 34, 81-87 (2001).
  15. Bianco, J. I., Perry, C., Harkin, D. G., Mackay-Sim, A., Feron, F. Neurotrophin 3 promotes purification and proliferation of olfactory ensheathing cells from human nose. Glia. 45, 111-123 (2004).
  16. Paviot, A., Bon-Mardion, N., Duclos, C., Marie, J. P., Guerout, N. Although olfactory ensheathing cells have remarkable potential to sustain nerve regeneration, they cannot be applied to a severe vagus nerve section/resection model. Muscle Nerve. 43, 919-920 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

MatrigelGFP
Трансплантация Обонятельная оболочечная клеток для оценки функционального восстановления после периферической нервной травмы
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.