Методическая статья

Использование изображения Цитометрии для количественного определения патогенных грибов в связи с клетки-хозяева

DOI:

10.3791/50599

⸱

19 июня 2013 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Merrimack College, 2Center for Biotechnology and Biomedical Sciences, Merrimack College, 3Department of Technology R&D, Nexcelom Bioscience LLC

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь показано, как изображение цитометрии может использоваться для количественного определения патогенных грибов в связи с хост клеток в культуре. Этот метод может быть использован в качестве альтернативы перечисление КОЕ.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования клеточных механизмов патогенеза патогенные дрожжи, такие как Candida Albicans, Histoplasma capsulatum и Cryptococcus neoformans обычно используют заражение хозяев-млекопитающих или клетки-хозяева (т.е. макрофаги) с последующим использованием дрожжей количественного анализа колониеобразующих единицы или проточной цитометрии. В то время как колониеобразующие единицы перечисление была наиболее широко используемый метод в данной области, этот метод имеет недостатки и ограничения, в том числе медленный рост некоторых видов грибов на твердой среде и низкой и / или переменной эффективности покрытие, которое представляет особый интерес при сравнении роста дикого типа и мутантных штаммов. Проточная цитометрия может обеспечить быстрое количественной информации о дрожжи жизнеспособности, однако, применение проточной цитометрии обнаружения патогенных дрожжей было ограничено по ряду практических причин, включая его высокой стоимости и биологической соображений. Здесь мы демонстрируем на основе образацитометрические методологии с использованием Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience ООО) для количественного определения жизнеспособных патогенных дрожжей в совместной культуре с макрофагами. Наши исследования направлены на выявление двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum колонизирует альвеолярных макрофагов путем репликации в макрофагах фагосома, и здесь, мы количественно оценить рост H. capsulatum дрожжей в RAW 264.7 макрофагами использованием акридиноранжа / пропидий йодида окрашивания в сочетании с изображения цитометрии. Наш метод точно повторяет тенденции роста как измеряется традиционными колониеобразующая единица перечисления, но со значительно более высокой чувствительностью. Кроме того, мы непосредственно оценить инфекции живых макрофагов с GFP-экспрессирующих штамм C. Albicans. Наша методика предлагает быстрое, точное и экономичное средство для обнаружения и количественного определения важных человеческих патогенных грибов в остроумии ассоциациич клетки хозяина.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования патогенных грибов в связи с их хозяев и / или клетки-хозяева, часто требуют количественного жизнеспособных клеток грибов за время курса или в других условиях инфекции. Перечень колониеобразующих единиц (КОЕ) представляет собой стандартный метод, посредством которого количество жизнеспособных клеток грибов были измерены, однако, этот метод имеет ряд недостатков и ограничений. Во-первых, многие виды грибов растут медленно. Рост видимые колонии на твердой среде может занять 1-2 недели, что значительно замедляет темпы научных исследований. Во-вторых, манипуляции образцов в процессе покрытия КОЕ это трудоемкий процесс, так как несколько разведения должны быть покрыты для обеспечения счетного числа колоний. В-третьих, количество КОЕ, как правило, ниже, чем количество жизнеспособных организмов покрытием, так как покрытие эффективность значительно ниже 100%. Например, покрытие для эффективности диморфными грибкового патогена Histoplasma capsulatum может быть выше, чем 90%, но обычно по цене от30% и даже ниже (10%) для соответствующих грибковых диморф Paracoccidioides Brasiliensis 1, 2. Покрытие эффективности Candida Albicans также подвержен изменчивости 3. Наконец, анализ КОЕ составляет только живых и активно делящиеся клетки, способные устанавливать роста на твердой среде, в то время как во многих ситуациях, было бы полезно, чтобы определить наличие и концентрацию мертвыми и / или метаболически неактивные клетки.

Ранее методов проточной цитометрии для количественного определения нескольких патогенных видов грибов были описаны 4-6. Однако из-за биобезопасности сдерживания проблемы при использовании уровня биобезопасности 2 (BSL2) или BSL3 уровня патогенов на общих цитометрах потока, принятие эта техника была ограничена. Как проточной цитометрии, изображения цитометрии является чувствительным и быстрый метод клеточной количественной оценке. Тем не менее, изображение цитометрии могут быть выполнены в часть стоимости с аналогичными результатами 7 -11. Здесь мы описываем методы для выполнения изображение цитометрии патогенных грибков в сочетании с клетками-хозяевами. Мы демонстрируем наши методы с использованием двух человеческих патогенных грибов: Histoplasma capsulatum и Candida Albicans H.. capsulatum является диморфными грибкового патогена, вызывающих респираторные заболевания, а в людях, он растет как начинающим дрожжей и повторяет в альвеолярных макрофагах Candida Albicans является человеком синантропных видов, которые иногда вызывает кандидоз.. Мы покажем, что изображения цитометрии позволяет быстрое количественное эти дрожжи, вместе с визуализацией возможности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Инфицирование макрофагов H. capsulatum, C. Albicans

  1. 16 часа до инфицирования, семена макрофагов при желаемой плотности в 24-луночных планшетах. В этом протоколе, плотность 3,0 х 10 5 клеток / лунка была использована.
  2. Добавить грибковые клетки в логарифмической фазе роста в желаемом множественности инфекции (MOI). Этот протокол может вместить ряд МВД (0,2 - 5,0). Для заражения RAW264.7 макрофагов с H. capsulatum, мы использовали МВД 0.2.
  3. После 1,5 часов, чтобы обеспечить фагоцитоза, макрофаги мыть три раза PBS для удаления внеклеточных грибы.
  4. Инкубируют в течение желаемого количества часов до анализа проб. При низких МВД (0,2 в наших экспериментах), инфицированные клетки макрофаги оставаться жизнеспособными в течение нескольких дней, и образцы могут быть проанализированы примерно каждые 12-24 часа.

2. Макрофагов Лизиса

  1. Чтобы освободить грибов из макрофагов, не извлекайте носитель, промыть 3 раза PBS идобавить 0,5 мл стерильной воды. В этих условиях, макрофаги и будет лизировать клетки грибов будет оставаться неизменным.
  2. Инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Передача лизата стерильную пробирку, держать на льду.
  4. Передача 20 мкл лизата в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии"

3. КОЕ Покрытие

  1. Выполните десятикратном разведении лизатов (с шагом 2,3) в средствах массовой информации.
  2. Плита 100 мкл каждого разведения, в двух экземплярах, на ХМ агарозном пластин. Планшеты инкубируют в увлажненной камере при 37 ° С с 5% СО 2 в течение 7-8 дней.
  3. Вручную подсчет колоний на чашках отображения не менее 100 и не более 1000 отдельных колоний.

4. Визуализация грибов в Онлайн-макрофагов

  1. Для сбора живых макрофаги, мыть клетки 3 раза с PBS. Добавить 0,5 мл PBS и инкубировать в течение 30 мин при 4 ° C.
  2. Для удаления макрофагов из колодцев культуре тканей, мягко пипетку вверх и вниз несколько раз. Передача жидкости стерильную пробирку, держать на льду.
  3. Передача 20 мкл образца в отдельную пробирку, затем добавляют 20 мкл AO / PI раствора. Перейдите к шагу 5: «Подготовка образцов для изображения цитометрии".

5. Подготовка образцов для изображения цитометрии

  1. Внесите целевой выборки тщательно, а затем передать 20 мкл образца в ячейку одноразовые Счетную палату.
  2. Разрешить клетки оседают в камере в течение 30 сек.
  3. Вставьте счетной камеры в образ цитометром.

6. Cellometer настроек прибора

  1. Вставьте флуоресценции Модули Оптика: VB-535-402 и VB-660-502 в систему и убедиться, что они встали на место.
    1. VB-535-402 (возбуждение при 475 нм, эмиссия при 535 нм) используется для акридиноранжа и GFP обнаружения.
    2. VB-660-502 (excitatiна при 540 нм, эмиссия при 660 нм) используется для обнаружения пропидий йодида.
  2. Включите изображения цитометром и открыть соответствующее программное обеспечение.

7. Cellometer по установке программного обеспечения

  1. Выберите пресет "типа анализа" и "Тип клетки" в анализе выпадающего меню.
    1. Для жизнеспособности, анализ оптимизирован для акридинового оранжевого и пропидия иодида обнаружения.
    2. Для обнаружения инфекции Candida Albicans, анализ оптимизирован для GFP обнаружения.
  2. Выберите "Настройки" в верхнем и нажмите "Take фонового изображения", и позволяют завершения операции.
  3. Нажмите на кнопку "Предварительный просмотр светлого поля изображения".

8. Процедура Image Acquisition

  1. Введите подготовленный образец камеры в образ цитометром.
  2. Используйте ручку фокусировки и регулировки фокуса.
  3. После того как в фокусе, нажмите на кнопку "Count" и позволить операцию захвата изображения, чтобы закончить.
  4. Ремове одноразовых счетной камере и утилизировать надлежащим образом.

9. Анализ данных изображений

  1. Концентрация и жизнеспособности измерения
    1. После подсчета завершена, концентрации и жизнеспособности клетки-мишени, выводятся в странице результатов.
    2. Нажмите на кнопку "Экспорт" для экспорта данных в ФТС Express 4 для сотовых популяционный анализ GFP в эксперименте инфекции Candida Albicans.
  2. FCS Экспресс-анализ Candida Albicans-инфицированные клетки
    1. Импорт ". NXDAT" файл в ФТС Express 4 и сюжет приводит к флуоресценции гистограммы.
    2. Применение ворота клеточной популяции на гистограмме, чтобы определить процент населения Candida Albicans-инфицированных клеток.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы использовали Cellometer цитометром изображения видения для контроля роста H. capsulatum в клетки макрофагов. RAW 264.7 клетки были инфицированы H. capsulatum дрожжевых клетках и в различные моменты времени, образцы подвергали AO / PI последующим окрашиванием на основе изображения цитометрии. Параллельно образцы анализировали с помощью традиционных перечисление КОЕ. В каждый момент времени, образцы инкубировали в воде для лизиса макрофагов и освобожденных дрожжевые клетки были определены Cellometer п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изображение цитометрии позволяет пользователю захватить высокое качество изображения и, используя специализированное программное обеспечение, выполнить быстрое количественное клеток. Один потенциальный вызов принятием изображения цитометрии в области микробного патогенеза является то, что микробы для подсчета присутствуют в смешанной популяции клеток, включая клетки млекопитающих. Здесь показано, что изображение цитометрии могут быть использованы для количественного определения жизнеспособных дрожжей патогенные инфекции...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы Leo Li-Ин Чан и Бенджамин Paradis являются сотрудниками Nexcelom Bioscience LLC.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
DMEMLife Technologies11965-084
Фетальная бычья сывороткаLife Technologies16000044
AO/PI SolutionNexcelom BioscienceCSK-0102
Одноразовая счетная камераNexcelom BioscienceCHT4-SD100
< strong>EQUIPMENT
Cellometer Vision ПрограммноеNexcelom
Cellometer Vision Software
обеспечение Bioscience

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Worsham, P. L., Goldman, W. E. Quantitative plating of Histoplasma capsulatum without addition of conditioned medium or siderophores. J. Med. Vet. Mycol. 26, 137-143 (1988).
  2. Goihman-Yahr, M., Pine, L., Albornoz, M. C., Yarzabal, L., de Gomez, M. H., San Martin, B., Ocanto, A., Molina, T., Convit, J. Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells. Mycopathologia. 71, 73-83 (1980).
  3. Bhatti, M. A., Hjertstedt, J., Hahn, B. L., Sohnle, P. G. Inefficient delivery of yeast cells as an explanation for reduced plating efficiency of Candida albicans. Med. Mycol. 40, 465-469 (2002).
  4. Chang, W. L., vander Heyde, H. C., Klein, B. S. Flow cytometric quantitation of yeast: a novel technique for use in animal model work and in vitro immunologic assays. Journal of Immunological Methods. 211, 51-63 (1998).
  5. Green, L., Petersen, B., Steimel, L., Haeber, P., Current, W. Rapid determination of antifungal activity by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 32, 1088-1091 (1994).
  6. Kirk, S. M., Callister, S. M., Lim, L. C., Schell, R. F. Rapid susceptibility testing of Candida albicans by flow cytometry. Journal of Clinical Microbiology. 35, 358-363 (1997).
  7. Chan, L. L. -Y., Lai, N., Wang, E., Smith, T., Yang, X., Lin, B. A rapid detection method for apoptosis and necrosis measurement using the Cellometer imaging cytometry. Apoptosis. 16, 1295-1303 (2011).
  8. Chan, L. L. -Y., Shen, D., Wilkinson, A. R., Patton, W., Lai, N., Chan, E., Kuksin, D., Lin, B., Qiu, J. A novel image-based cytometry method for autophagy detection in living cells. Autophagy. 8, 1371-1382 (2012).
  9. Chan, L. L., Wilkinson, A. R., Paradis, B. D., Lai, N. Rapid Image-based Cytometry for Comparison of Fluorescent Viability Staining Methods. Journal of Fluorescence. 22, 1301-1311 (2012).
  10. Chan, L. L., Zhong, X., Pirani, A., Lin, B. A novel method for kinetic measurements of rare cell proliferation using Cellometer image-based cytometry. J. Immunol. Methods. 377, 8-14 (2012).
  11. Chan, L. L., Zhong, X., Qiu, J., Li, P. Y., Lin, B. Cellometer Vision as an alternative to flow cytometry for cell cycle analysis, mitochondrial potential, and immunophenotyping. Cytom. Part A. 79, 507-517 (2011).
  12. Hull, C. M., Johnson, A. D. Identification of a mating type-like locus in the asexual pathogenic yeast Candida albicans. Science. 285, 1271-1275 (1999).
  13. Berkes, C. A., Chan, L. L., Wilkinson, A., Paradis, B. Rapid Quantification of Pathogenic Fungi by Cellometer Image-Based Cytometry. J. Micro. Meth. 91, 468-476 (2012).
  14. Nguyen, V. Q., Sil, A. Temperature-induced switch to the pathogenic yeast form of Histoplasma capsulatum requires Ryp1, a conserved transcriptional regulator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (12), 4880-4885 (2008).
  15. Wenisch, C., Linnau, K. F., Parschalk, B., Zedtwitz-Liebenstein, K., Georgopoulos, A. Rapid susceptibility testing of fungi by flow cytometry using vital staining. Journal of Clinical Microbiology. 35, 5-10 (1997).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GFP

Похожие статьи