Method Article

CometChip: Высокая пропускная 96-Ну Платформа для измерения повреждений ДНК в Microarrayed клетках человека

DOI:

10.3791/50607

⸱

October 18th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2Environmental Toxicology, Chulabhorn Graduate Institute, 3Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь платформу, которая позволяет кометы обнаружения анализа повреждений ДНК с беспрецедентной пропускной способности. Узоры устройств клетки млекопитающих в микрочипов и позволяет параллельную обработку 96 образцов. Подход облегчает анализ повреждения ДНК базовый уровень, экспозиция индуцированных повреждений ДНК и репарации ДНК кинетики.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ДНК повреждающие агенты могут способствовать старению, болезням и раку, они вездесущи в окружающей среде и производятся в клетках человека как нормальные клеточные метаболиты. По иронии судьбы, в высоких дозах повреждающие ДНК агенты также используются для лечения рака. Таким образом, возможность количественной оценки реакций на повреждение ДНК имеет решающее значение в области общественного здравоохранения, фармацевтики и клинической медицины. В этой статье мы опишем новую платформу, которая использует методы микропроизводства для моделирования клеток в фиксированном микрочипе. «CometChip» основан на хорошо зарекомендовавшем себя анализе гель-электрофореза для одиночных клеток (также известном как анализ кометы), который оценивает уровень повреждения ДНК путем оценки степени миграции ДНК через матрицу в электрическом поле. Тип повреждения, измеряемый этим анализом, включает в себя аосновные сайты, поперечные сшивки и разрывы нитей. Вместо того, чтобы быть случайным образом диспергированными в агарозе в традиционном анализе, клетки захватываются в массив агарозных микролунок под действием силы тяжести. Платформа также может быть увеличена с размера стандартного предметного стекла микроскопа до 96-луночного формата, что позволяет выполнять параллельную обработку. Здесь мы опишем протоколы использования чипа для оценки повреждений ДНК, вызванных известными генотоксическими агентами, и реакции клеточной репарации после воздействия. Благодаря интеграции биологических и инженерных принципов этот метод потенциально способен к надежным и чувствительным измерениям повреждений ДНК в клетках человека и обеспечивает необходимую пропускную способность для тестирования на генотоксичность, разработки лекарств, эпидемиологических исследований и клинических анализов.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электрофорез Сингл гелевые (SCGE) анализ (ака комет) является широко используемым методом для количественного определения широкого спектра повреждений ДНК, в том числе базовых поражений, лишенного основани звена сайтов, одиноких разрывов ДНК, двойные разрывов ДНК, сшивки и щелочей чувствительны сайты. Главный принцип анализа является то, что поврежденная ДНК мигрирует более охотно, чем неповрежденной ДНК в результате фрагментации и потери сверхвитков структуры. Степень миграции пропорциональна количеству повреждений ДНК, и может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии. Изображение-захвата и профиль интенсивности анализ индивидуального кометы в форме ДНК затем доставить измерения параметров, таких как длина хвоста, момент хвост, и% ДНК в хвосте, чтобы выявить уровень повреждений ДНК в клетке 1-4.

В настоящее время существует два широко используемых версий комет: а) щелочная комет и б) комет в нейтральных. Щелочная комет является наиболее широкоб версия, которая использует высокую рН буфер, чтобы расслабиться ДНК перед электрофореза и таким образом обнаруживает все типы разрывов ДНК и щелочно-чувствительных участков. Комет в нейтральных, с другой стороны, менее практикуется, поскольку он использует нейтральный буфер для поддержания двойных спиралей и обнаруживать только двойные разрывы цепи 2,5. Для химических и физических агентов, которые вызывают DSBs, SSBs создаются в концерте, и образуются при значительно более высоких уровнях (например, γIR-индуцированные SSBs являются на порядок чаще, чем DSBs). Для большинства повреждающих ДНК экспозиций, ДР гораздо реже, чем другие классы повреждений ДНК, и, следовательно, труднее обнаружить. Мы показали в предыдущих публикациях окно обнаружения обеих версий. 6,7

Хотя комет регулярно используется для проведения фундаментальных исследований на повреждения ДНК и ремонта и генотоксичности испытаний 1,2,8-15, анализ был сообщили, что плохую воспроизводимость благодаря образца-to-образец, от человека к человеку и лабораторного к-лаборатории изменчивости. Кроме того, анализ является низкая пропускная способность, отчасти потому, что захвата изображений и анализа данных являются трудоемкими. Вместе, эти ограничения способствуют его относительно низкой принятия в крупномасштабных исследований. Благодаря интеграции инженерных технологий и принципов, CometChip приносит решение проблем пропускной способности и несоответствий, которые связаны с традиционной комет 6,7. Вкратце, для создания чипа, форма микроизготовленном помощью фотолитографии для создания Microposts с диаметром как малые, как, что из одной клетки. Затем пресс-форму используется, чтобы печать на расплавленного агарозы, в результате чего массив лунок после гель затвердевает. Фишки разрабатывается для обеспечения исследователей переменного размера скважин совместимы с различными типами клеток. Чтобы загрузить чип, клетки в СМИ дают осесть в лунки под действием силы тяжести; избыточные клетки смываются. Trapped клетки затем инкапсулируются насчисле тонкий слой с низкой температурой плавления агарозы, и бездонный 96-луночный планшет, затем прижать к поверхности геля, чтобы создать 96 macrowells, каждый из которых сотни лунок на его нижней поверхности.

Этот протокол описывает общие процедуры для экспериментов с этим чипом, которые включают подготовку гель, сотовый загрузку, дозирование и ремонт, лизис клеток, электрофорез и флуоресцентных изображений. Мы демонстрируем два примера экспериментов доза-ответ с лимфобластных клеток, подвергшихся известно ДНК повреждающих агентов, используя щелочные и нейтральные версии анализа соответственно. Два эксперимента ремонт также показаны описать, как реакция ремонт после контакта может быть оценена с помощью системы.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1 Подготовка Chip

  1. Удалить чип гель от пакета и место в одной хорошо прямоугольная пластина, гель пленки стороне в вниз.
  2. Промыть гель в 25 мл 1X PBS в течение 15 мин, повторить два раза.
  3. Установите гель на стеклянную пластину и этикетки ориентации геля соответственно.
  4. Аккуратно нажмите перевернутую бездонный 96-луночного планшета на гель; убедитесь, что все скважины бездонную пластины также находятся в зоне геля.
  5. С помощью 1,5 '' зажимы с каждой стороны пластины, чтобы обеспечить фиксацию со стеклом.
  6. Аспирируйте от избыточного PBS буфера в каждую лунку.

2. Загрузка Клетки

  1. Подготовьте клеточные суспензии:
    1. Для линий клеточной суспензии, разбавленной клеточной суспензии в среде, чтобы получить конечную концентрацию 10 5 -10 6 клеток / мл.
    2. Для прикрепленных клеточных линий, в соответствии с обычными снятие / протоколы трипсинизации и гШилуте отдельные клетки в СМИ до конечной концентрации 10 5 -10 6 клеток / мл. Если клетки агрегируют, проходят клеточной суспензии в фильтре клеток для получения суспензии отдельных клеток.
  2. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного планшета.
  3. Крышка с гелевой пленки для предотвращения испарения СМИ.
  4. Разрешить клетки загрузить по крайней мере 30 мин в 37 ° С инкубатор.
  5. Удалить чип из инкубатора и аспирата СМИ из каждой лунки.
  6. Удалить зажимы и бездонный 96-луночного планшета; провести чип с стеклянной пластины под углом и осторожно промыть 1х PBS, чтобы удалить избыток клеток на агарозе.
  7. Проверьте клеток загрузку с использованием светлого поля микроскопа с объективом 4X. Если наблюдается недостаточная загрузка, повторите процедуру с шага 2.1.
  8. Поместите загруженный чип на ровной поверхности (лабораторном столе). Наложение чип с 1% низкой температурой плавления (LMP) агарозы, который предварительно нагревают при 37 ° С. Используйте приблизительно 2̵1, 3 мл агарозы LMP необходима для каждого чипа.
  9. Разрешить наложения, чтобы закрепить первую при КТ в течение 3 мин, а затем перейти к 4 ° С холодильником в течение 5 мин для полной желатинизации.

3 Способ применения и Ремонт

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения исходного уровня повреждений ДНК, перейдите к шагу 4.

  1. Тщательно выровнять скважин чипа (созданный из предыдущего зажима) с лунки новой бездонной 96-луночного планшета. Re-пресс кладязь 96-луночного планшета на верхней и надежного крепления с зажимы.
  2. Добавить 100 мкл химического вещества желаемой дозы в каждую лунку 96-луночного планшета; выполнить дозирования / лечение на льду или в 4 ° C холодильнике в течение требуемого периода времени.
  3. После дозирования, аспирация химических веществ из каждой лунки и смыть остатки вещества с помощью 1X PBS. Если прямой ущерб изучается здесь, перейдите к шагу 4.
  4. Для изучения ремонт кинетики, позволяют клетки в чипе для ремонта вноситель при 37 ° С. Lyse (перейдите к шагу 4) в определенные моменты времени.
    Примечание: Ремонт может быть выполнена на чипе с бездонной 96-луночного планшета прилагаемой или чип может быть разрезана на отдельные куски после удаления бездонной 96-луночного планшета.

4 Lysis

  1. Для выполнения щелочной комет:
    1. Сделать работает щелочной буфере для лизиса путем добавления 1% Тритон Х-100 до щелочного лизиса маточного раствора (2,5 М NaCl, 100 мМ Na 2 EDTA, 10 мМ Трис, рН 10). Приготовьте примерно 25 мл лизирующего буфера работает для каждого чипа.
    2. Предварительно охладить работает щелочной буфере для лизиса при 4 ° С.
    3. Погрузите чип в прохладном рабочей щелочного буфера для лизиса и позволяют лизис выполнять O / N в 4 ° C холодильнике.
  2. Для выполнения комет в нейтральных:
    1. Сделать работает нейтральный буфере для лизиса путем добавления 1% Тритон Х-100 и 10% ДМСО в нейтральное лизиса маточного раствора (2,5 М NaCl, 100 мМ Na 2 EDTA, 10мМ Трис, 1% N -Lauroylsarcosine, рН 9,5). Приготовьте приблизительно 25 мл лизирующего буфера, работающих для каждого чипа.
    2. Предварительно теплые работы нейтральный буфер для лизиса на 43 ° C.
    3. Погрузите чип в теплой рабочей нейтрального буфера для лизиса и позволяют лизис выполнять O / N в 43 ° С инкубатор.

5 электрофореза

  1. Для выполнения щелочной комет:
    1. Удалить буфер для лизиса и быстро промыть чип с 1x PBS.
    2. Secure микросхема в камеру электрофореза с гель фильм стороной вниз, используя двухсторонний скотч.
    3. Доведите камеру с 4 ° С холодной комнате.
    4. Заполните камеру с холодной щелочной буфер для электрофореза (0,3 М NaOH, 1 мМ Na 2 EDTA) до уровня, который покрывает только гель.
    5. Разрешить для щелочной раскручивания в течение 40 мин.
    6. Запуск электрофореза на 1 В / см и 300 мА в течение 30 мин в холодном помещении. Регулировка громкости буфер для электрофореза в чаMBER для достижения желаемого рабочего тока.
  2. Для выполнения комет в нейтральных:
    1. Удалить лизирующего буфера и промыть чип с нейтральным буфером электрофореза (2 мМ Na 2 EDTA, 90 мМ Трис, 90 мМ борной кислоты, рН 8,5) в течение 2 х 15 мин при 4 ° С.
    2. Secure микросхема в камеру электрофореза с гель фильм стороной вниз, используя двухсторонний скотч.
    3. Доведите камеру с 4 ° С холодной комнате.
    4. Заполнить камеру с холодной нейтральной буфера электрофореза (2 мМ Na 2 EDTA, 90 мМ Трис, 90 мМ борной кислоты, рН 8,5) до уровня, который покрывает только гель.
    5. Разрешить гель сидеть в холодной комнате в течение 60 мин.
    6. Запуск электрофореза на 0,6 В / см и 6 мА в течение 60 мин в холодном помещении. Регулировка громкости буфер для электрофореза в камере для достижения желаемого рабочий ток.

6 флуоресцентных изображений

  1. Удалить чип от электрофореза камеры от перевалад комната.
  2. Нейтрализовать гели в нейтрализации буфера (0,4 М Трис, рН 7,5) в течение 2 х 15 мин в 4 ° C холодильником.
  3. Пятно чип с флуоресцентным красителем ДНК выбора (т.е., SYBR Gold, этидийбромид) под фабрикой рекомендованных процедур. Изображение с помощью флуоресцентной микроскопии.

Анализ 7. данных

Анализ кометы изображений по стандартной кометы программного обеспечения для анализа, такие как Комет 5,5.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом первом примере мы опишем подход к количественной начальные уровни повреждения ДНК в лимфобластоидных клеток человека после воздействия окислительного повреждения с помощью H 2 O 2. Для того чтобы оценить H 2 O 2 -индуцированных базовые повреждения и одиночные разрывы нитей, используются щелочные кометы условия. После завершения загрузки и клетки были инкапсулированы с наложением на агарозном, бездонный 96-луночный планшет прижимается к поверхности, чтобы создать 96-купе на чипе. Каждый из 96-луночных можно дозировать с другим типом или концентрации химических веществ. Здесь четыре различных доз H 2 O 2 были использованы 1X PBS и использовали в качестве отрицательного контроля. Типичные изображения выстроились комет показано на рисунке 1А, где необработанной (вверху), 50 мкм (средний) и 100 мкм (нижней) H 2 O 2 -exposed образцы продемонстрировали различные уровни кометных хвостов. Анализ кометных изображений можно Перформед с использованием коммерчески доступного программного обеспечения, которое обычно количественно уровня концентрации, в расчете на общую интенсивности флуоресценции и миграции расстоянии каждого хвосте кометы. Измерения обычно выполняется на 50 до 100 комет в состоянии и медианного значения (либо% хвост ДНК или длины хвоста) рассчитывается. Рисунок 1B иллюстрирует процент хвост кривую ДНК анализируются с TK6 лимфобластоидных комет клеток, подвергшихся воздействию четырех различных концентраций H 2 O 2. Консистенция среди независимых экспериментов демонстрируют эффективность такого подхода в оценке реакции повреждения ДНК от различных уровней химических обработок в клетках.

Чтобы узнать о вариации среди образцов (например, между macrowells) и между повторами одного и того же эксперимента, между образца и между экспериментальной изменчивости построена на фиг.2А и 2В соответственно. В каждом эксперименте каждую лунку 96-WЧип локоть эквивалентно другом образце и, следовательно, изменение и к скважине показывает изменение между образец устройства. Здесь TK6 клетки, нагруженные в 12 скважинах чипа 96-луночного лечили той же дозы H 2 O 2 и сразу лизируют после лечения. Все другие экспериментальные этапы проводили параллельно и медианы по крайней мере, 50 комет из каждого macrowell были нанесены на рисунке 2А. Среднее значение медианы является 77,53% ДНК в хвосте, с стандартное отклонение 3,99%. Из этих данных, мы вычисляем, что коэффициент вариации среди образцов составляет 5,2%, что в несколько раз ниже, чем традиционной анализа, что свидетельствует о повышении устойчивости этом анализе 6,16. Чтобы узнать о воспроизводимости анализа, мы подвержены TK6 клетки в чипе с 75 мкМ H 2 O 2 и анализировать немедленного уровень повреждений ДНК. Этот эксперимент был повторен в шесть раз и данные из каждого эксперимента приведены на Figure 2B. В одинаковых условиях эксперимента, мы получили результаты, начиная от 41,76% до 57,87%, в виде серых баров в рисунке. Среднее значение шести повторов 49,57%, при этом стандартная ошибка среднего значения только 2,04%. Низкая вариация среди повторов следует, что метод ДНК-комет выполняется на этом новом устройстве хорошо воспроизводим.

Для оценки кинетики ремонт, клетки могут восстановить их ДНК в свежую среду после обработки. Лизирующий macrowells в различные моменты времени показывает изменение повреждений ДНК с течением времени. Пример показан на рисунке 3. В этом эксперименте TK6 клетки сначала инкапсулируются в чипе, обрабатывали 50 мкМ H 2 O 2, и дают возможность восстановить до 60 мин после облучения. Клетки лизировали в 0, 20, 45 и 60 мин соответственно. Типичные кометы изображения в различные моменты времени приведены на фигуре 3А, и изменение уровня повреждения ДНК с течением времени показана на рисунке3B. Эти данные показали, что почти все повреждения устраняются в течение 45 мин после H 2 O 2 лечение. Многие переменные могут влиять на скорость ремонта, в том числе типа клеточной линии и химического агента, используемого. Поэтому исследователи могут внести изменения в протокол (то есть, увеличивая время ремонта), чтобы разместить дополнительные потребности в своих исследованиях. Здесь мы предлагаем еще один пример ремонта эксперимента, используя этот чип, в котором TK6 клетки заражали другом генотоксического агента N-метил-N '-Nitro- N -Nitrosoguanidine (MNNG) представляет собой алкилирующий агент, известный вызвать базовые повреждения включая 7-метилгуанина и 3-метиладенин. Эти повреждения преобразуются в лишенного основани звена сайтов либо от спонтанного депуринизации или от ферментативного удаления ДНК-гликозилазами. Полученную лишенного основани звена может быть расщеплена в щелочных условиях и, таким образом обнаружена на чипе. Первоначальная экспозиция вызывает значительное увеличение ущерба, видно из давнохвосты, и с течением времени эти хвосты уменьшаются, как клетки восстановить неповрежденную ДНК во время ремонта. Несмотря на то, алкилирование и окислительное повреждение оба первую очередь отремонтировать по эксцизионной репарации оснований пути, количество повреждений, полученных и белки, участвующие в ремонте различаться. Эти изменения могут привести к различным темпам преобразования в лишенного основани звена сайты, а также различные темпы ремонта в результате лишенного основани звена сайтов. На рисунке 4, ремонт кинетика TK6 клеток воздействию 0,1, 1 и 3 мкг / мл MNNG показаны. В этом эксперименте, мы продлили время эксперимента к 2 ч после воздействия, потому что MNNG повреждения при по-видимому, сохранится дольше и очищается более медленными темпами по сравнению с H 2 O 2, индуцированной повреждения.

Анализ DSBs с использованием нейтральных условиях очень похож на протокол для анализа однонитевых поражений с использованием щелочных условиях. Чтобы показать уровень начальный урон, TK6 клетки подвергали воздействию переменных уровней Гир, и в результате клетки лизировали и подвергали электрофорезу при нейтральном рН (фиг.5А). Стоит отметить, что морфология кометных хвостов отличается от щелочных условиях анализа. Чтобы достичь заметного фрагментированной ДНК с помощью этого анализа, ИК доза используется значительно выше (0-100 Гр), чем дозы, необходимой, чтобы увидеть повреждение с использованием щелочных условиях. Кроме того, мы обнаружили, что длина хвоста является наиболее чувствительным параметром в отражая степень повреждения ДНК при использовании комет в нейтральных 7. Анализируемый кривой доза-ответ проиллюстрировано на фиг.5В. Ремонт ДНК дважды разрывов ДНК в клетках также может быть оценена, и было показано Weingeist эт. Аль. 7. Взятые вместе, нейтральный CometChip предлагает ценный инструмент для высокой пропускной анализа ДНК DSBs.

1highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 1. H 2 O 2 дозы реакция TK6 клеток с использованием щелочной комет. () Одевался микролуночные кометы от необработанных TK6 лимфобластах (вверху) и TK6 клеток, подвергнутых до 50 мкм (в середине) и 100 мкм (нижний) H 2 O 2 в течение 20 мин при 4 ° С. Шкала бар составляет 100 мкм. (B) H 2 O 2 ответа доза TK6 клетках, подвергнутых различным уровнем H 2 O 2. Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех независимых экспериментов, в которых средний процент хвоста ДНК, по крайней мере 50 отдельных кометы было получено в каждом эксперименте. Усы представляют стандартную ошибку среднего от трех независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-1
Рисунок 2. Inter-Sample и Интер-экспериментальной Изменчивость. () Образец-на-Sample вариации. TK6 лимфобластных клеток человека были загружены на 12 лунок чипа 96-луночного. Каждую лунку подвергают воздействию 100 мкл 50 мкМ H 2 O 2 в течение 20 мин при 4 ° С. Сотовый были немедленно лизируют и анализировали на ДНК хвост%. Данные из каждой лунки показано здесь. Каждая коробка представляет среднее по крайней мере, 50 отдельных комет из каждой лунки. Среднее значение 12 скважин 77,53%, стандартное отклонение составляет 3,99%, а коэффициент вариации вычисляется как 5,2%. (B) Эксперимент-на-эксперимента изменение. TK6 лимфобластных клеток человека были загружены в чипе на 96-луночный, подвергается воздействию 100 мкл 75 мкМ H 2 O 2 в течение 20 мин при 4 ° С. Сотовый были немедленно лизируют и анализировали на ДНК хвост%.Тот же самый эксперимент был повторен в 6 раз, а данные каждого повтора показана в виде серой панели. Каждый блок представляет средний% хвост ДНК, по крайней мере 100 отдельных комет из каждого повтора. Среднее из 6 повторов 49,57%, как показано на задней панели здесь. Стандартное отклонение 6 повторов 4,99%, а стандартная ошибка среднего вычисляется быть 2,04%, представлен в виде бара ошибки в рисунке.

figure-results-2
Рисунок 3. Ремонт H 2 O 2, индуцированной ущерб в TK6 лимфобластах. (А) Схематическое ремонтных исследования с представительными комет. TK6 клетки обрабатывают повреждающих агентов и оставляли для восстановления в средах при 37 ° С до лизиса. (В) Ремонт кинетика TK6 клеток после обработки 50 мкМ H 2 O 2 в течение 20 мин при 4 и #176; С. Каждая точка данных представляет собой среднее значение трех независимых экспериментов, в которых средний процент хвоста ДНК, по крайней мере 50 отдельных кометы было получено в каждом эксперименте. Усы представляют стандартную ошибку среднего от повторяющихся экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 4. Ремонт МННГ-индуцированного повреждения в TK6 лимфобластов. TK6 клетки обрабатывают 0,1, 1 и 3 мкг / мл MNNG в течение 30 мин при 4 ° С и оставляли для восстановления в средах при 37 ° С до 120 мин после экспозиции. Средний процент хвоста ДНК, по крайней мере 50 отдельных кометы был получен для каждого из трех независимых экспериментов. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонениеот среднего из трех независимых экспериментов.

figure-results-4
Рисунок 5. Реагирования ИК доза TK6 клеток с использованием нейтрального комет. () Выстраиваемый микролуночные кометы от необработанных TK6 лимфобластах (вверху) и TK6 клетках, подвергнутых 40 Гр (в центре) и 80 Гр (нижняя) гамма-излучения. Шкала бар составляет 100 мкм. Ответ на дозу (B) ИК TK6 клетках, подвергнутых различным уровнем гамма-облучения. Каждая точка данных представляет собой средний длина хвоста (мкм) не менее 300 комет объединенных от шести macrowells на чипе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Вездесущие генотоксинов в окружающей среде, а также в пределах клеток человека оказывают неизбежное напряжение и повреждение клеточной ДНК. На самом деле, было подсчитано, что есть 1000 с повреждений ДНК, присутствующих в клетках человека в устойчивом состоянии 18. Понимание повреждаемость и ремонт кинетики у человека не только приносит понимание в области фундаментальных исследований, но и приносит пользу развитию наркотиков. Как ни странно, несмотря на способность повреждения ДНК содействия рак, повреждающих ДНК агентов используются на очень высоких уровнях, чтобы лечить рак, делая знания о повреждении ДНК и ремонт отношение к персонализированной медицины. CometChip является роман исследования устройство, которое использует практику микротехнологий революционизировать на повреждения ДНК анализа давно существовала. Основываясь на тех же принципах традиционной комет, чип обеспечивает значительно более высокую пропускную способность и лучшую воспроизводимость. Мы описываем здесь способы использования этого чипа. Для уточнения его полезность и надежность, мы покажем результаты сюдам несколько экспериментов, где чип была использована для оценки ущерба, вызванную несколькими отличается повреждающих ДНК агентов, и где она была использована для оценки репарации ДНК. Вместе, представленные здесь результаты предоставить полезную информацию для использования чип и продемонстрировать свою широкую применимость к исследованию на повреждения и репарации ДНК.

Одним из наиболее важных шагов в этом протоколе есть для достижения эффективную погрузку клеток. Многие клеточные линии были протестированы на этой системе, в том числе как подвески и прилипшие клетки. Загрузка эффективность зависит от многих факторов, таких как тип клеток, размер клеток, концентрации и времени загрузки. Подвеска клеточные линии, такие как лимфобластоидных клеток являются самым простым в работе. Концентрация клеточной суспензии может составлять от 10 4 до 10 6 клеток на 96-луночный и загрузка обычно завершается в 15-30 мин. Более высокая плотность клеток облегчает загрузку и сокращает количество времени, необходимого для урегулирования клеток в лунках.

Загрузка параметры для адгезивных клеток может отличаться от суспензии клеток. Клеточные линии, такие как рак яичника китайского хомячка (СНО), было установлено, что подобное эффективность загрузки в виде суспензии клеток (после обработки трипсином) и, таким образом, использовать аналогичные условия нагрузки. Другие типы клеток, такие как опухолевые клетки, которые легко образуют клеточных агрегатов в суспензии, требуют дополнительной обработки. Переходя клеточных суспензий с помощью одного фильтра клеток и добавление трипсина в суспензионной среды может подавлять образование кластеров клеток во время загрузки. И, наконец, с точки зрения времени загрузки, время, необходимое для захвата прикрепленных линий клеток в лунках может варьировать от 20 минут до 1 часа. В результате, рекомендуется пользователям выполнять пилотные эксперименты по определению оптимальных условий загрузки, прежде чем приступить к дальнейших исследований. Загрузка эффективность может быть визуализирована в светлом поле микроскопа или, точнее, показал окрашиванием инкапсулированных клеток с DAPI или другой ДНКпятна до их оценки под флуоресцентным микроскопом.

Одно из главных преимуществ этого метода и чипа универсальность. Во-первых, исследователи не ограничиваются определенной концентрации рабочей клеток, потому что избыточные клетки смываются, и микрочипов обеспечивает равномерное кометы плотности. Во-вторых, лунки могут быть сделаны с различных размеров, чтобы вместить типов клеток различных размеров. В условиях, что несколько клеток, фиксируемых на одной микролунку, нескольких ячеек кометы являются самостоятельными откалиброван и доходности соответствует результаты по сравнению с одиночными комет клеток 6,7. Еще одно преимущество рисунка клетки в микрочипе, что все кометы, то в то же фокальной плоскости с фиксированными положениями, уменьшая шум в связи с нефокусированных комет и облегчения автоматизированной обработки изображений и анализа. Значительные улучшения в производительности и чувствительности, предоставляемые CometChip возможности применения анализа для масштабных исследований. Взятые вместе, чип обеспечиваетса ценным инструментом для оценки ущерба ДНК для исследователей, токсикологов, врачей и эпидемиологов.

В то время как метод ДНК-комет известен своей отличной чувствительностью в обнаружении широкий спектр повреждений ДНК, этот анализ также страдает от низкой специфичности. Используя этот протокол значительно улучшает воспроизводимость и пропускную способность анализа, но не демонстрирует прогресс в специфичности. Тем не менее, мультиплексирование с другими анализа методик было сообщено, чтобы быть эффективными в достижении более высокой специфичностью. Одним из примеров является включение очищенных поражения конкретных ферментов. Эти ферменты могут конвертировать в противном случае недетектируемые базовых поражений в обнаруживаемых разрывов ДНК и лишенного основани звена сайтов 1,19-21. Широко используемым примером является ремонт эндонуклеазы гликозилаза формамидопиримидин-ДНК (Fpg), которая показывает изменения окислительного ДНК 19,22. Поскольку шаг ферментативного расщепления применяется после лизиса клеток, система может рассматриваться же образомса традиционный агарозы слайд без изменений в протоколе. Хотя Подробный протокол здесь не описывается, этот подход был адаптирован многими традиционными кометных пользователей анализа в прошлом, и протоколы могут быть легко найдены. В предыдущей публикации мы использовали этот метод для идентификации люминесцентные индуцированных повреждений 22.

Основным преимуществом этого метода является пропускная он обеспечивает, которая открывает двери для исследований, которые ранее были практически невозможно. Способность обрабатывать 96 образцов на той же платформе, не только снижает затраты труда и времени, но и снижает экспериментальные шумы и значительно повышает воспроизводимость. Интер вариации выборки значительно ниже, чем традиционной слайд-к-слайд изменения, которые могут быть в 2 раза выше, чем различий, наблюдаемых с этим чипом 6,7. Пониженный уровень шума также приводит к улучшению чувствительности, что позволяет определять более тонких различий между образцами. Поскольку устройство использует STAndard 96-а, она совместима с общей исследовательского оборудования и HTS технологий. Рассмотрим исследование, которое требует оценки 100 образцов, при условии, что средняя исследователь может обрабатывать ~ 30 стеклянные слайды более в течение нескольких дней. Учитывая, что каждый образец должен быть выполнен в трех экземплярах, потребовалось бы приблизительно одного месяца, чтобы завершить такое исследование, которое также неизбежно страдают от образца к образцу изменение. В отличие от этого, обработка 100 условия, каждая в трех экземплярах, с этого чипа требуется всего лишь несколько пластин и может быть выполнена в течение трех дней. Это значительное улучшение пропускной открывает двери для исследований, которые ранее были недостижимы.

Протокол, представленные здесь описывает как основные процедуры для выполнения стандартного комет и измененные шаги, необходимые для использования CometChip платформу. С возможностью измерения оба уровня, присущие повреждения ДНК и последующее ответ ремонта, анализ является весьма актуальным дляразнообразие биологических и клинических применений. Информация о воздействии определенных химических воздействий на геном облегчает профилактики и лечения заболеваний. Кроме того, есть также значительный интерес в определении различий в чувствительности повреждения ДНК и ремонтных мощностей среди лиц 23,24. Эта техника обеспечивает пропускную необходимое для таких масштабных исследований. Знания о том, индивидуальных вариаций имеет решающее значение для выявления восприимчивых людей и для проектирования индивидуальных методов лечения или профилактику стратегии. Взятые вместе, технология, представленная здесь обеспечивает высокую пропускную способность, объективную и количественную платформу анализа повреждений ДНК, которая имеет потенциал, чтобы стать стандартной методологии в ближайшем будущем.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CometChip был лицензирован компанией Trevigen, Inc. на основании патентной заявки, которая включает Wood, Weingeist, Bhatia и Engelward.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа в первую очередь поддерживать на 5-UO1-ES016045 при частичной поддержке 1-R21-ES019498 и R44-ES021116. DMW была поддержана NIEHS подготовки Гранта в экологической токсикологии T32-ES007020. Оборудование было предоставлено Центром гигиены окружающей среды наук P30-ES002109.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
UltraPure LMP Agarose (низкая температура плавления)Invitrogen16520Несколько поставщиков
Фосфатный буферный раствор Dulbecco (PBS) 1xGibco by life technologies14190Несколько поставщиков
Crystalline NaClMacron Chemicals7581-06Несколько поставщиков
Crystalline Na2EDTAMacron Chemicals4931-04Множественные поставщики, Раздражающий
кристаллический трис (основание)Sigma-AldrichT1503Множественные поставщики, Раздражающий
кристаллический трис (кислота)J.T.Baker4106Множественные поставщики
Кристаллический N-лауроилсаркозинSigma-AldrichL9150Множественные поставщики, Высокотоксичный при вдыхании, Раздражающий
Triton X-100Sigma-AldrichX100Множественные поставщики, Вредно при проглатывании., Раздражающее вещество
Диметилсульфоксид (ДМСО)Sigma-AldrichD4540Множественные поставщики, Горючая жидкость, Эффект органа-мишени
Кристаллический NaOHMacron Chemicals7708-06Множественные поставщики, Коррозионная
соляная кислотаVWRBDH3871Несколько поставщиков, Коррозионный
Кристаллическая борная кислотаSigma-AldrichB6768Множественные поставщики, Эффект органа-мишени, Тератоген, Репродуктивная опасность
CometChipTrevigenВ стадии разработки для распространения, свяжитесь с Trevigen напрямую для получения необходимых материалов
1-луночная чашкаThomas Scientific73521-420
Бездонная 96-луночная пластинаVWR655000-06
1,5-дюймовые связующие зажимыСкобыНесколько поставщиков
Стеклянная пластинаМетка ФурнитураИзготовлена по размеру 96-луночной пластины
Система горизонтального электрофореза OwlVWR27372-131Несколько поставщиков
PowerPac Basic Power SupplyBio-Rad164-5050Несколько поставщиков

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collins, A. R. The Comet Assay for DNA Damage and Repair Principles, Applications, and Limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), (2004).
  2. Olive, P. L., Banáth, J. P. The comet assay a method to measure DNA damage in individual cells. Nature. 1 (1), 23-29 (2006).
  3. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and biophysical research communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  4. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental cell research. 175 (1), 184-191 (1988).
  5. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Molecular biotechnology. 26 (3), 249-261 (2004).
  6. Wood, D. K., Weingeist, D. M., Bhatia, S. N., Engelward, B. P. Single cell trapping and DNA damage analysis using microwell arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10008-10013 (2010).
  7. Weingeist, D. M., et al. Single-cell microarray enables high-throughput evaluation of DNA double-strand breaks and DNA repair inhibitors. Cell cycle. 12 (6), 907-915 (2013).
  8. Brendler-Schwaab, S., Hartmann, A., Pfuhler, S., Speit, G. The in vivo comet assay: use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis. 20 (4), 245-254 (2005).
  9. Witte, I., Plappert, U., de Wall, H., Hartmann, A. Genetic toxicity assessment: employing the best science for human safety evaluation part III: the comet assay as an alternative to in vitro clastogenicity tests for early drug candidate selection. Toxicological sciences : an official journal of the Society of Toxicology. 97 (1), 21-26 (2007).
  10. Valverde, M., Rojas, E. Environmental and occupational biomonitoring using the Comet assay. Mutation research. 681 (1), 93-109 (2009).
  11. Møller, P. Genotoxicity of environmental agents assessed by the alkaline comet assay. Basic & clinical pharmacology & toxicology. 96, Suppl 1.. 1-42 (2005).
  12. Dusinska, M., Collins, A. R. The comet assay in human biomonitoring: gene-environment interactions. Mutagenesis. 23 (3), 191-205 (2008).
  13. Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. Comet assay: a reliable tool for the assessment of DNA damage in different models. Cell biology and toxicology. 25 (1), 5-32 (2009).
  14. McKenna, D. J., McKeown, S. R., McKelvey-Martin, V. J. Potential use of the comet assay in the clinical management of cancer. Mutagenesis. 23 (3), 183-190 (2008).
  15. Cadet, J., Douki, T., Ravanat, J. -L. Oxidatively generated damage to the guanine moiety of DNA: mechanistic aspects and formation in cells. Accounts of chemical research. 41 (8), 1075-1083 (2008).
  16. Forchhammer, L., et al. Variation in the measurement of DNA damage by comet assay measured by the ECVAG† inter-laboratory validation trial. Mutagenesis. 25 (2), 113-123 (2010).
  17. Olive, P. L., Wlodek, D., Banáth, J. P. DNA double-strand breaks measured in individual cells subjected to gel electrophoresis. Cancer research. 51 (17), 4671-4676 (1991).
  18. Frelon, S., Douki, T., Ravanat, J. L., Pouget, J. P., Tornabene, C., Cadet, J. High-performance liquid chromatography--tandem mass spectrometry measurement of radiation-induced base damage to isolated and cellular DNA. Chemical research in toxicology. 13 (10), 1002-1010 (2000).
  19. Georgakilas, A. G., Holt, S. M., Hair, J. M., Loftin, C. W. Measurement of oxidatively-induced clustered DNA lesions using a novel adaptation of single cell gel electrophoresis (comet assay). Current protocols in cell biology. , Suppl Chapter 6, Unit 6.11.. (2010).
  20. Fortini, P., Raspaglio, G., Falchi, M., Dogliotti, E. Analysis of DNA alkylation damage and repair in mammalian cells by the comet assay. Mutagenesis. 11 (2), 169-175 (1996).
  21. Collins, A. R., Dusinská, M., Horská, A. Detection of alkylation damage in human lymphocyte DNA with the comet assay. Acta biochimica Polonica. 48 (3), 611-614 (2001).
  22. Ge, J., et al. Standard fluorescent imaging of live cells is highly genotoxic. Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 83 (6), 552-560 (2013).
  23. Trzeciak, A. R., Barnes, J., Evans, M. K. A modified alkaline comet assay for measuring DNA repair capacity in human populations. Radiation research. 169 (1), 110-121 (2008).
  24. Marcon, F., Andreoli, C., Rossi, S., Verdina, A., Galati, R., Crebelli, R. Assessment of individual sensitivity to ionizing radiation and DNA repair efficiency in a healthy population. Mutation research. 541 (1-2), 1-8 (2003).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

CometChipDNA DamageComet AssayHigh throughput ScreeningMicroarrayed CellsAlkaline LysisElectrophoresisFluorescence ImagingGenotoxicity TestingCell Loading

Related Articles