Методическая статья

Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

32.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50623

⸱

16 сентября 2013 г.

 ,  ,  , 
1Section of Molecular Genetics and Microbiology, The University of Texas at Austin, 2Department of Chemistry and Biochemistry, The University of Texas at Austin, 3The Institute of Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin

В этой статье

Краткое содержание

Выделение и характеристика области липида А липополисахарида (ЛПС) из грамотрицательных бактерий дает представление о клеточной поверхности механизмов, основанных устойчивости к антибиотикам, выживаемости бактерий и пригодности, и как химически разнообразны липид А молекулярные частицы дифференциально модулировать хост врожденные иммунные реакции.

Аннотация

Липополисахарид (LPS) является основным молекулу клеточной поверхности грамотрицательных бактерий, наносят на наружный листок наружной мембраны бислой. ЛПС можно разделить на три области: дистальный О-полисахарида, основной олигосахаридными и липидов область, состоящая из липида A молекулярные частицы и остатки 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic кислоты (КДО). Домен липидов является единственным компонентом важное значение для выживания бактериальной клетки. После его синтеза, липидов химически модифицирован в ответ на экологических стрессов, таких как рН или температуры, в целях содействия устойчивость к антибиотикам соединений, и уклониться от признания медиаторов принимающей врожденного иммунного ответа. Ниже подробно описывается протокол малого и масштабный изоляцию липида А из грамотрицательных бактерий. Изолированный материал затем химически охарактеризован с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) или масс-спектрометрии (МС). В дополнение к матрице-лазерной десорбцией / ионизации-время фсвет (MALDI-TOF) МС, мы также описать тандем MS протоколы для анализа липида А молекулярные частицы с помощью ионизации электрораспылением (ESI), соединенный с столкновения индуцированной диссоциации (CID) и вновь принятых на работу ультрафиолетовое фотодиссоциацию методы (UVPD). Наши протоколы MS позволяют однозначного определения химической структуры, первостепенное значение для характеристики липидных молекул А, которые содержат уникальные или новые химические модификации. Мы также описываем радиоизотопное мечение, и последующее выделение, из липида А из бактериальных клеток для анализа с помощью ТСХ. По сравнению с протоколами MS на основе ТСХ обеспечивает более экономичный и быстрый метод характеризации, но не могут быть использованы для однозначно назначать липида А химические структуры без использования стандартов известной химической структуры. За последние два десятилетия выделение и характеристика липида А привело к многочисленным захватывающих открытий, которые улучшили наше понимание физиологии грамотрицательных бактерий, механизмов сопро антибиотиковрасстояние, человеческий врожденного иммунного ответа, и предоставили много новых целей в развитии антибактериальных соединений.

Введение

Липополисахарид (LPS) является основным внешняя поверхность молекула почти всех грамотрицательных микроорганизмов и состоит из трех доменов: молекулярных дистальный O-антиген полисахаридов, основной олигосахаридных, и мембранно-связанный липидов домена осаждается на внешней створки Внешняя мембрана двухслойная 1,2. Липидный домен состоит из 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic (KDO) остатков и липида A видов молекул, где липид может быть определена как хлороформ растворимой части ЛПС при легкой кислотного гидролиза 1, 2. Стандарт липидов молекула может быть химически определяется как diglucosamine позвоночника, что является гекса-ацилирована и бис-фосфорилируются; согласуется с основными видами липида А, наблюдаемых в модель организма кишечной палочки (E.coli) 1,2. Девять конституитивно выраженные гены, консервативные по всей грамотрицательных бактерий, несут ответственность за производство липидов домена (рис. 1) 1,2. Большинство бактерий имеют дополнительный набор генов, которые изменяются в степени филогенетического сохранения, что участвовать в дальнейшей химической модификации липидов 3. Дефосфорилирование, удаление ацильных цепей, и добавление химических групп, таких как аминосахаров (например aminoarabinose) и / или фосфоэтаноламин являются наиболее часто наблюдается деятельности (рис. 1). Многие из ферментов, ответственных за липидов модификации непосредственно активировать окружающей среды сигналов, таких как двухвалентные катионы, или их экспрессия регулируется двухкомпонентных ответ-регуляторных систем 3.

Признание видов липидов А принимающей врожденной иммунной системы опосредуется звонок подобный рецептор фактора 4/myeloid дифференциации 2 (TLR4/MD2) корецептора 4. Гидрофобные силы между MD2 и липида A ацильных цепей, а также между TLR4 и 1 и 4 'фосфатными группами липида А способствующих сильную связь для губID с TLR4/MD2 4,5. Модификации, которые изменяют состояние ацилирования или отрицательный заряд липидов липидов на основе воздействия TLR4/MD2 признание и вниз по течению стимуляция врожденного иммунного ответа активаторы NF-kB и медиаторы воспаления, такие как TNF-и IL-1 β 6,7. Модификации, которые маскируют отрицательный заряд липида А также предотвратить бактерицидными катионные антимикробные пептиды от привязки к грамотрицательных поверхности клеток 3,8. Многие модификации липидов A предположили увеличить бактериальную фитнес при определенных условиях окружающей среды, таких как внутри человеческого организма или в экологической ниши. По этой причине многие модификации ферменты привлекательными объектами в рациональной разработке антимикробных соединений. Химический разнообразие структур липида А, в отношении организма и / или окружающей среды и биологических последствий этих различных структур сделать структурную характеристику липида А важным стремиться в тон изучению грамотрицательных бактерий.

Выделение молекул липида А из цельных бактерий включает экстракцию ЛПС от поверхности бактериальной клетки, стадии гидролиза, чтобы освободить липидный A, с последующим окончательным процедуры очистки 9-11. Наиболее часто приводимые ЛПС процесс экстракции процедура забора воды горячей фенол, впервые введенная Вестфаль и Янн 10. После экстракции весь LPS подвергают легкой кислотного гидролиза, который химически отделяет Kdo от 6'-гидроксила дистального глюкозамина сахара липида А (рис. 1). Существует множество подводных камней для процедуры воды горячей фенола том числе с использованием высокой реагента опасности, необходимость ухудшить сотрудничество извлеченные нуклеиновых кислот и белков, и несколько дней, необходимых для завершения протокол 10.

Наша лаборатория дальнейшее развитие добычи и изоляцию липида А как впервые разработана Карофф и Raetz 12,13. По сравнению с процедурами горячей воды фенол, метод, представленный здесь является более быстрым и эффективным, и вмещает широкий спектр объемов культуры от 5 мл до нескольких литров. Кроме того, в отличие от экстракции горячей фенольных водных, наш метод не выбрать для грубых или гладких-типов ЛПС, обеспечивая оптимальное восстановление видов липидов А. В нашем протокола, химической лизис бактериальных клеток целых выполняется с использованием смеси хлороформа, метанола и воды, где LPS может быть осаждают центрифугированием. Сочетание гидролиза легкой кислоты и экстракции растворителем (Блай-Дайер) используются, чтобы освободить липидный А из ковалентно связанного полисахарида. Способ Блаем и Dyer впервые был применен к добыче видов липидов из различных животных и растительных тканей 14, модифицированный здесь, чтобы отделить гидролизованный полисахарид из липидов А. В этом заключительном этапе разделения, хлороформ растворимые липиды селективно разделить на нижний органический фаза. Для дальнейшей очистки липид А, с обращенной фазой илиАнионный обмен колоночной хроматографии можно использовать 12.

После выделения липидов А из видов целых клеток, ряд аналитических методов может быть использован, чтобы охарактеризовать химическую структуру изолированного материала, такого как ЯМР, ТСХ и МС на основе анализа. ЯМР позволяет неразрушающего структурного анализа, и обеспечивает структурную деталь, связанную с гликозидных связей, однозначного присвоения ацильных позиций цепи, и назначение участков присоединения для липидных модификаций А ​​как aminoarabinose или фосфоэтаноламин 15-17. ЯМР-анализ липида А не обсуждается в рамках нашего протокола, но был описан адекватно в другом месте 15,16. Для экспресс-анализа ТСХ Методы, основанные на часто используются, но не в состоянии обеспечить прямую информацию о тонкой химической структуры. Протоколы, основанные МС наиболее часто используется метод для характеристики структуры липидов 18,19. Матрица связано с лазерной десорбцией ионизации (MALDI)-MS часто используется для обследования первоначально интактные видов липида А. Однозарядных ионов сгенерированы анализируемого вещества, полученного в соответствии с нашими процедурами экстракции. Как требуется более тонкая структурный анализ, методы, основанные MS / MS оказаться более информативным, чем MALDI-MS. В сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI), отдельно или многозарядных липид А ионы-предшественники являются еще фрагментирован на столкновения индуцированной диссоциации (CID) или ультрафиолетового фотодиссоциации (UVPD), для генерации структурно информативные ионы продукта 18,20,21. Обычный потери продуктов из липида А предшествующих ионов также часто генерируется во время ESI-MS обеспечивает дополнительный слой структурной информации.

Масс-спектрометрия Тандем (MS / MS), оказалось, незаменимым и универсальным методом для выяснения структуры липида А. Во MS / MS, ионы активируются, чтобы получить диагностическую картину фрагментации, которая может использоваться для выяснения структуру иона-предшественника. Наиболее широко лавинтестированию нет доступа метод MS / MS является CID. Этот метод производит ионы фрагментов через столкновениях выбранного иона-предшественника с инертным целевого газа, в результате чего энерговклада, что приводит к диссоциации. CID доказала критический инструмент в присвоении липидной структуры A для широкого круга видов бактерий 22-33.

Хотя CID является наиболее широко реализованы способ МС / МС, он генерирует ограниченный спектр ионов продукта. 193 нм UVPD является альтернативой и дополнительный метод MS / MS. Этот метод использует лазер для облучения ионами, и поглощение фотонов приводит к подаче напряжения ионов и последующей диссоциации. Это более высокая энергия MS / MS техника производит более разнообразные ионов продукции, чем CID и таким образом обеспечивает более информативные модели фрагментации. В частности, UVPD дает информацию о тонких изменений в видов липидов А на основе раскола в гликозидной, амин, ацил и CC облигаций, привязанных к 18,21,34.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все растворы должны быть подготовлены сверхчистой водой и ВЭЖХ метанола и хлороформа. Готовые решения, которые содержат органические растворители, такие как метанол, хлороформ или пиридин и концентрированных кислот или оснований должны быть подготовлены и используются по химическом вытяжном шкафу. Все растворы могут храниться при комнатной температуре. Растворители должны быть измерены в градуированный цилиндр стекла и хранили в стеклянных бутылок с растворителем с тефлоновым покрытием крышки. Для долговременного хранения хлороформ, содержащих растворители следует хранить в тонированными янтарь стеклянных бутылках, чтобы избежать производство фосгена, хлорид высокой реакционной кислоты. Центрифуг PTFE трубки и вращающиеся колбы испарителя следует промыть метанола и хлороформа перед использованием. Следуйте необходимые федеральные, государственные и / или утилизации институциональная отходов правила утилизации растворителей и / или радиоактивных отходов.

1. Крупномасштабное липидов Добыча (50 мл до 1,5 л)

  1. Подготовьте однофазный Блай-Дайера смесь: хлорформ-метанол-1X забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), рН 7,4; 1:2:0.8 объем / объем). Смешайте 200 мл хлороформа, 400 мл метанола и 160 мл PBS в 1 л бутылке растворителей. Крышка бутылки и перемешать с помощью инверсии (> 30x). Периодически Ослабить крышку во время смешивания, чтобы выразить и сохранить опечатаны.
  2. Подготовка предварительно уравновешенную двухфазной Bligh-Dyer смесь-хлороформ: метанол: вода (2:2:1.8 объем / объем). Смешайте 400 мл хлороформа, 400 мл метанола и 180 мл воды в 1 л бутылке растворителей. Крышка бутылки и перемешать с помощью инверсии, убедившись, что периодически ослабить крышку во время смешивания, чтобы выразить. Пусть равновесие O / N и магазин запечатанный.
  3. Подготовьте мягкий буфер кислотного гидролиза (50 мМ ацетата натрия, рН 4,5, 1% додецилсульфат натрия (SDS)). Для 500 мл мягкого буфера кислотного гидролиза, вес 2,05 г ацетата натрия и переносят в стакан емкостью 500 мл. Добавьте воду до объема ~ 350 мл и перемешивают, затем добавляют 50 мл 10% ДСН. Смешать и довести рН до 4,5, трансфер в мерный цилиндр, и добавить воды до 500 мл.
  4. Готовитьхлороформ: метанол (4:1, об / об): Измерение 100 мл хлороформа и передавать к растворителю бутылку. Мера 25 мл метанола и смешивают с хлороформом. Хранить в стеклянной бутылке янтарного.
  5. Привить 5 мл СМИ (Лурия бульон или другие) из одного бактериальной колонии. Grow O / N при 37 ° С, или при необходимости ° С в течение роста. Схема процедуры экстракции показано на рисунке 2.
  6. На следующий день, измерить OD 600 и использовать культуру 5 мл O / N, чтобы привить 200 мл культуры в исходное OD 600 0,05. не растут клетки до наружным диаметром 600 из 0,8-1,0 достигается.
  7. Урожай клеток путем центрифугирования при 10000 х г в течение 10 мин. Дольше спинами могут потребоваться для штаммов, окатышей плохо. Вылейте СМИ супернатант.
  8. Промыть осадок клеток с 50 мл 1х забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS). Повторите центрифугирования для осаждения клеток. Слейте супернатант и магазин осадок клеток при -20 ° С, или перейдите к шагу 1.9.
  9. Ресуспендируют клеток в 40 млиз 1x PBS и разделить между двумя 250 мл центрифуг PTFE труб (дающих 20 мл клеточной суспензии / трубки). Добавить 25 мл хлороформа и 50 мл метанола в каждую пробирку, для одной фазы Bligh-Dyer (хлороформ: метанол: вода; 1:2:0.8 объем / объем) (рис. 2). Смешайте по инверсии и инкубировать при комнатной температуре в течение> 20 мин для обеспечения полного лизиса клеток.
  10. Центрифуга смеси при 2000 х г в течение 20 мин. LPS будет гранул вместе с белков и нуклеиновых кислот (рис. 2), однако, фосфолипиды, изопрениловые липиды, и небольшие, гидрофобные пептиды будут оставаться в супернатанте. Удалите супернатант.
  11. Вымойте гранул ЛПС с ~ 100 мл однофазный Блай-Дайер смеси. Центрифуга при 2000 мкг в течение 20 мин. Удалите супернатант. При изоляции липидов А из Е. палочки или Salmonella, только один мыть требуется, однако дополнительные этапы стирки могут быть необходимы, чтобы уменьшить загрязнение фосфолипидов при выделении липид А из некоторых организмов.
  12. Добавить 27 мл мил.д. кислота буфера гидролиз (50 мМ ацетат натрия, рН 4,5; 1% SDS, см. шаг 1.3), чтобы LPS гранул, и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, пока только маленькие частицы остаются. Разрушать ультразвуком, чтобы равномерно ресуспендируйте ЛПС осадок в растворе с наконечника зонда для обработки ультразвуком при постоянной рабочий цикл в течение 20 сек при 50% выходе. Повторите ультразвуком образцов 2x (20 сек / взрыв, ~ 5 сек между вспышками).
  13. Образцы отварить в водяной бане в течение 30 мин. Внимание: убедитесь, что колпачки плотно, но не полностью герметичен. Некоторые организмы, как холерного вибриона (холерных вибрионов) требуют более длительного времени инкубации (1 час), чтобы увеличить общий выход липидов А. Удалить бутылки от водяной бане и дать образец охлаждаться до комнатной температуры, прежде чем приступить.
  14. Для извлечения липидов после гидролиза, конвертировать решение SDS в двухфазной Блай-Дайер (рис. 2) смеси путем добавления 30 мл хлороформа и 30 мл метанола, для хлороформа: метанол: вода (2:2:1.8, об / объем) смеси. Смешайте инверсией и центрифугировать образец в течение 10 мин в 2,000 х г. Экстракт нижней фазы в чистую центрифужную пробирку ПТФЭ с помощью стеклянной пипетки.
  15. Выполнение второй экстракции добавлением 30 мл нижней фазы из предварительно уравновешенную двухфазной Bligh-Dyer смеси (этап 1.2), в верхней фазы со стадии 1,14. Перемешать, затем центрифуги при 2000 мкг в течение 10 мин. Извлеките нижнюю фазу, и бассейн с нижней фазы, добываемой в шаге 1.14.
  16. Промывают объединенные нижние фазы (60 мл всего) путем добавления 114 мл, предварительно уравновешенную двухфазной Bligh-Dyer верхней фазы (этап 1.2), чтобы создать двухфазной Bligh-Dyer смеси (хлороформ: метанол: вода; 2:02: 1,8, об / об). Смешайте. Центрифуга при 2000 мкг в течение 10 мин.
  17. Снимите нижнюю фазу к чистой стеклянной вращающейся колбе испарителя и сухого образца с помощью роторного испарителя (рис. 2).
  18. Добавить 5 мл хлороформ: метанол (4:1, об / об) во вращающуюся колбу и обрабатывают ультразвуком баня (> 30 секунд), чтобы помочь в суспензии липидных из сторон колбу. Используйте стекло пипетки передачи для передачи липидов на чистуюстеклянная трубка (13 х 100 мм и более) закрывают PTFE выстроились фенольные винтовые колпачки. Сухой образец под струей азота с использованием сушилки азота.
  19. Ресуспендируют высушенного липида в 1 мл смеси хлороформ: метанол (4:1, об / об). Трансфер в небольшой образец стекла флакона (12 х 32 мм) с коническим основанием для более количественного ресуспендированием использованием малых объемов (см. табл оборудования / Реагенты). Высушите с использованием сушилки азота.
  20. Высушенный образец можно хранить при температуре от -20 ° С до последующего ТСХ (Протокол 2) или МС-анализа (протокол 3, 4 или 5). (Примечание: количество материала выделены и использованы в последующих протоколов предлагается на основе что достаточно для большинства организмов Тот же образец липида может быть использован в Protocols 2-5, принимая во внимание% материала, удаляемого см. обсуждение для более подробной информации...).

2. Визуализация липида А видами через тонкослойной хроматографии

  1. Подготовка системы ТСХ подвижной фазы растворителей (хлороформ: пиридин: 88%-ной муравьиной кислоты и воды; 50:50:16:5 объем / объем). CombinE 200 мл хлороформа, 200 мл пиридина, 64 мл 88% муравьиной кислоты, и 20 мл воды в бутылке 1 л растворителя. Крышка бутылки, перемешать инверсионных несколько раз, и вентиляционные.
  2. Используйте TLC танк, который будет учитывать 20 х 20 см пластины. Линия ТСХ бак с ~ 40 см хроматографической бумаги.
  3. Для ТСХ добавить 200 мл хлороформа-пиридин-88%-ной муравьиной кислоты и воды (50:50:16:5, об / об) смеси. Разрешить бак предварительно равновесия в течение> 3 часов, часто O / N является предпочтительным и удобнее.
  4. Удалить высушенных образцов липидов из морозильника (шаг 1,20), и пусть нагреться до комнатной температуры.
  5. Бритвой удалить диоксид кремния от верхней кромки силикагель ТСХ пластине 60. Использование тупой карандаш, нарисуйте линию, параллельную нижней части плиты, 2 см от дна. Эта линия является источником для выявления образцов. Марк увеличивает вдоль этой опорной линии, чтобы определить образцы 1 см друг от друга.
  6. Растворить высушенного липида с шагом 2,4 в 200 мкл смеси хлороформ: метанол (4:1, об / об), и гомогенат вихрь (3x, ~ 15 сек каждый) дает ~ 100 -500 нг / мкл липидного если извлеченный из Е. палочка.
  7. Использование микрокапиллярных стекла пипетки, определить одну десятую часть объема (20 мкл) на пластину ТСХ как отмечено в пункте 2.5. Разрешить образцы до воздушно-сухого на ТСХ пластине для ~ 15 мин. (Примечание: Образцы в небольшой стеклянные флаконы могут быть высушены с использованием сушилки азоте и хранили при -20 ° С для последующего использования в протоколах 3-5 Обратите внимание% удаляемого материала.).
  8. Поместите пластины тонкослойной хроматограммы, содержащий пятнистый образцов в предварительно уравновешенную бака. После того, как передняя растворителя достигает вершины ТСХ пластины (~ 2,5-3 ч), удалить пластину и сухой воздух (> 60 мин). Холодного воздуха пистолет может быть использован, чтобы обеспечить полное сухости.
  9. В то время как пластина сушки, включите горячей плите при температуре 250 ° С в течение обугливания.
  10. В вентилируемом химическом вытяжном шкафу, готовят 10%-ной серной кислоты и этанола в течение обугливание липиды решен на ТСХ пластине кремния (концентрированной серной кислоты: 100% этанола; 1:09 об / об). Мера 10 мл серной кислоты и добавить медленно в 90 мл 100% этанола. Уходполностью перемешать и передать реагента распылитель стекло хроматографии.
  11. В вытяжной шкаф, использовать стеклянную хроматографическую распылитель реагентов для распыления высушенного пластинки ТСХ с 10%-ной серной кислоты и этанола. Спрей смесь равномерно по всей пластине.
  12. Поместите пластинки ТСХ на горячей плите 250 ° C до обугленные образцы липидов не появляться в виде черных / коричневых пятен (<1 мин). Не передержать пластину, так как это вызовет весь пластина свою очередь, коричневый и сделать визуализация видов липидов трудным.

3. Структурная характеристика липида А через MALDI-TOF масс-спектрометрии

  1. От этапа 1,20, (или шагом 2.7) удалить липида А образец из морозильника и пусть нагреться до комнатной температуры. Ресуспендируют высушенного липида образца в ~ 20 мкл хлороформ: метанол (4:1, об / об) и вихрь, чтобы получить ~ 1-5 мкг / мкл липидного решение, если извлеченный из Е. палочка. (Примечание: 10% менее концентрированным, если материал, используемый с шага 2.7).
  2. Подготовка матричные компоненты ATT. Насыщенные 6-аза-2-thiothymine в 50% смеси ацетонитрил: добавить 500 мкл воды и 500 мкл ацетонитрила в 1,5 мл микроцентрифужных трубки, а затем добавить> 10 мг 6-аза-2-thiothymine таким образом, что 50% ацетонитрила супер-насыщен. Насыщенный трехосновный цитрат аммония решение: Добавить> 1 мг до 500 мкл воды, осаждаются должны быть очевидны. Вихревые и центрифуги решения перед использованием; только насыщенный супернатант используется.
  3. Подготовка матричную смесь, ATT: насыщенный 6-аза-2-thiothymine в 50% ацетонитрила, насыщенным трехосновный цитрат аммония (20:1, об / об). Смешайте матричные компоненты вместе добавлением 20 мкл раствора ATT в 1 мкл насыщенных трехосновный раствора цитрата аммония в 500 мкл трубки микроцентрифужных, вихря смешивать, и центрифуги до обращения в MALDI пластины.
  4. Подготовка MALDI тарелку, добавив 0,5 мкл калибрующего смесь на MALDI пластины на месте рядом, где образцы будут зачислены, чтобы обеспечить наиболее точное определение соотношения масса / заряд.
  5. Депозит 0,5 мклиз ATT матрицы на MALDI пластины на каждом месте, где липидный Образец будет размещена.
  6. Депозит 0,5 мкл образца (2,5% от общей выборки) на месте ATT матрицы, перемешать на тарелку, и приобрести спектры образцом Сканирование оптимальных ионных сигналов (рис. 3). Примечание: Суммы для наиболее оптимального MS сигнала может меняться в зависимости от организма и должны быть определены эмпирически. Чтобы добавить больше материала можно определить 0,5 мкл несколько раз, позволяя заметили смесь высохнуть между добавлением дополнительной образца. Образец также может быть сконцентрирован (сухой и ресуспендируют в меньшем объеме) или разбавленными по мере необходимости. Более исходный материал (объем начиная клеточной культуры) также может быть использован (см. обсуждение).

4. Электроспрей ионизации масс-спектрометрии и Столкновение индуцированных Диссоциация липида А

  1. Подготовка хлороформ: метанол смесь растворителей (1:1, объем / объем) путем смешивания 200 мкл запаса ВЭЖХ метанола с 200 мл хлороформа ВЭЖХ в стеклянной зольвентиляционные бутылку.
  2. Передача 200 мкл хлороформ: метанол смеси растворителей во флакон с липида А (например, от шага 1,20, 2,7 или высушены после протокола 3) и разрушать ультразвуком липидной раствор в течение 5 мин или пока все вещество растворяют.
  3. Настройте масс-спектрометр для режима отрицательной ионизацией электрораспылением.
  4. Использование 250 мкл шприца и шприцевой насос, непосредственно влить разбавленный образец липида А при скорости потока от 2,0-3,5 мкл / мин.
  5. Оптимизация и повышения липидного ион сигнал путем настройки ионной оптики. Полный спектр масс теперь может быть собрана из видов липида А (рис. 4).
  6. Изолировать и активировать целевую липид А, выбрав CID в качестве способа МС / МС.
  7. Увеличивайте CID напряжение (или нормализованное энергии столкновения, ПОО), пока липида предшественника видов составляет около 10% относительное изобилие по сравнению с самой высокой иона продукта.
  8. Приобретение и средний спектры, пока достаточное отношение сигнал-шум не будет достигнута для гоионы е первым. Число сканирований, необходимых зависит от интенсивности сигнала от исходного предшественника и может составлять от 3-300 сканирования (фиг.5А).

5. MS / MS на липида А ультрафиолетовым фотодиссоциации

  1. Подготовка образца и масс-спектрометра, как на этапах 4.1-4.5.
  2. Включите лазер, сопряженный с масс-спектрометром. Масс-спектрометр был оснащен эксимерного лазера 193 нм и изменен, чтобы позволить включение УФ в HCD ячейке прибора. Фотодиссоциация был осуществлен способом, подобным тому, который описан ранее 35. Мы используем модифицированный вакуумный коллектор с оптическим окном CaF 2 для передачи фотонов в больших энергий C-ловушки диссоциации (HCD) клеток. Лазер срабатывает во время MS / MS на транзисторно-транзисторной логики (TTL) сигнала от масс-спектрометра с генератором импульсов / задержки.
  3. Настройка программного обеспечения прибора, так что лазер вызовет эксимерного лазера, когдаионы введите HCD ячейку. Это требует скромные модификации программного обеспечения.
  4. Включите генератора импульсов такой, что лазер работает в импульсном режиме каждые 2 мс (500 Гц).
  5. Изолировать липидного иона-предшественника, выбрав HCD как метод МС / МС и отрегулируйте столкновительную энергию до 1% Ницца. Это позволяет изолировать ионы предшественника для ультрафиолетовой диссоциации в клетке HCD. Хотя используется клетка HCD, ПО модифицируется для выполнения UVPD течение этого интервала.
  6. Активация изолированной липида А ион, увеличивая энергию лазера и регулировки количества лазерных импульсов. Типичный эксперимент UVPD будет выполнено с использованием 6 мл десять импульсов.
  7. Как и в шаге 4.8, приобретать и средний спектры до достаточно шум сигнала к пока не будет достигнута для ионов UVPD продукта. Число сканирований, необходимых зависит от интенсивности сигнала от исходного предшественника и может составлять от 3-300 сканирования (фиг.5В).

6. 32 Р-маркировкалипида А и последующим выделением

  1. Привить 5 мл медиа (Лурия бульон или других средствах массовой информации) от одной колонии. Grow O / N при 37 ° С или при необходимой температуре.
  2. На следующий день, измерить OD 600 и использовать культуру O / N, чтобы привить 7 мл культуры в исходное OD 600 в ~ 0,05, выращенных в стандартном 20 х 150 мм одноразовые стекла пробирку. Добавить 2,5 мкКи / мл неорганической 32 P. не растут клетки до наружным диаметром 600 из 0,8-1,0 достигается. Пожалуйста, следуйте федеральные, государственные, и / или институциональные рекомендации по безопасному и правильному обращению с радиоактивными материалами.
  3. Урожай клеток в 16 х 125 мм стекло центрифужные пробирки с PTFE выстроились колпачок с использованием фиксированной угол клинической центрифуге при 1500 мкг в течение 10 мин. Удалить супернатант в соответствующем радиоактивного контейнер для отходов. Все радиоактивные отходы (например, жидкости, стекла, биологической) генерируется на последующих стадиях должны быть утилизированы в соответствии с федеральными, государственными и / или институциональные графический интерфейсdelines.
  4. Промыть осадок клеток 5 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS). Центрифуга течение 10 мин при 1500 х г. Удалите супернатант.
  5. Ресуспендируют клеток в 5 мл однофазного Bligh-Dyer смеси (рис. 2), состоящий из хлороформ: метанол: вода (1:2:0.8, об / об). Vortex смешивать, и инкубировать при комнатной температуре в течение> 20 мин для обеспечения полного лизиса клеток.
  6. Центрифуга в клинической центрифуге при 1500 мкг в течение 20 мин. Аккуратно слейте супернатант, который содержит фосфолипиды и изопренил липиды.
  7. Ресуспендируют гранул ЛПС в 1,8 мл 50 мМ ацетата натрия, рН 4,5, 1% SDS буфера на вортексе. Разрушать ультразвуком образец с использованием ванны ультразвукового пока осадок не равномерно рассеяны (~ 30 сек).
  8. Инкубируйте образца в течение 30 мин в кипящей водяной бане. Убедитесь в том, шапки трудны, но не герметично.
  9. Удалить из водяной бани и позволить, чтобы охладить образец при комнатной температуре в течение 5-10 мин.
  10. Преобразование раствора в двухфазной Bligh-Dyer смеси путем добавления 2 мл хлороформа и 2 млметанол, получая хлороформ: метанол: водный (2:2:1.8 объем / объем) смеси. Vortex для смешивания, и центрифуги в течение 10 мин в клинической центрифуге при 1500 х г в отдельных фазах.
  11. Извлеките нижнюю фазу в чистую стекла трубки центрифуги с помощью стеклянной пипетки (первого отжима).
  12. Выполнение второй экстракции на образце путем добавления 2 мл предварительно уравновешенную двухфазной Bligh-Dyer нижней фазы (полученного, как на стадии 1.2) к оставшемуся верхней фазы со стадии 11. Vortex и центрифуги 10 мин. Удалить нижнюю фазу и в сочетании с нижней фазы от первой экстракции.
  13. К объединенной нижней фазы (~ 4 мл общего объема), добавьте 7,6 мл, предварительно уравновешенную верхней фазы (этап 1.2), что дает двухфазную решение Bligh-Dyer (хлороформ: метанол: вода; 2:2:1.8, об / об.) Vortex и центрифуги в течение 10 мин.
  14. Извлеките нижнюю фазу на чистую стеклянную трубку и сушат с использованием сушилки азота. Высушенные образцы можно хранить при -20 ° С до дальнейшего использования.

7. Visualiзация 32 Р-меченых липидов вида с помощью тонкослойной хроматографии

  1. Подготовка 32 Р-меченых липидов образце, TLC бак, и ТСХ-пластин, как описано в шагах 2.1-2.8.
  2. Растворить 32 P-меченых образец в 500 мкл 4:01 хлороформ-метанол (объем / объем). Vortex и ванна соникат для полного растворения липидного материала. Добавьте 5 мкл образца в сцинтилляционный флакон, содержащий 5 мл сцинтилл ционной смеси. Всего в сцинтилляционного счетчика и вычислить общую имп / мин образца.
  3. При визуализации меченные радиоактивным изотопом видов липидов, 10 х 20 см или 20 х 20 см ТСХ могут быть использованы. Для 10x20 см пластинах, образцы должны быть выставлены вдоль происхождения отмечены на этапе 2.5, так что наибольший размер пластины является вертикальная (т.е. образцы пятнами на происхождения отмечены на 2 см. выше 10 см стороне).
  4. Использование микрокапиллярных пипетку, место 10,000-20,000 CPM / образец на плите и позволить пятна высохнуть (> 15 мин). Образцы возможно, необходимо будет сосредоточено сушкой приазота и ресуспендировали в соответствующем объеме, для достижения 10,000-20,000 отсчетов / мин / место (2 мкл или 2 мкл за один раз для всего <10 мкл).
  5. Поместите пластины тонкослойной хроматограммы, содержащий меченные радиоактивным изотопом образцов в предварительно уравновешенную бака. После того, как фронт растворителя достигает верхней части ТСХ-планшета (~ 3 ч), удалить пластину и сушат на воздухе (> 60 мин). Внимание: ТСХ провод т в присутствии пиридина должны быть тщательно сушат в химическом вытяжном шкафу, как следовые количества пиридина может привести к повреждению экраны phosphorimaging. Холодного воздуха пистолет может быть использован, чтобы обеспечить полное сухости.
  6. Оберните пластину в пищевую пленку и выставить на экране Phosphorimager в авторадиографической кассеты O / N. На следующее утро, пробегать по экрану для получения изображения (рис. 6). Использование программного обеспечения для анализа денситометрия изображения, этот метод позволяет точно, относительной количественной оценки видов липидов А.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Каноническое липидов Е. палочка и Salmonella enterica серовар Typhimurium является гекса-ацилированный дисахарид глюкозамина с фосфатных групп в 1 - и 4 '-положениях. Во время роста в богатых средств массовой информации (например, Лурия Бульон) часть липида А содержит пирофосфат группу в положении 1 при массовом Трис-фосфорилируются видов 36 (рис. 1). Kdo (3-дезокси-D-манно-octulosonic кислота), приводится в 6'-гидроксил и служит мостом, чт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом протоколе мы подробно изоляцию липидных видов А из целых клеток бактерий, и описаны TLC или аналитические методы, основанные MS химически характеризуют этот изолированный материал. Тандемной масс-спектрометрии является мощной стратегией для процессов нового структурной характеристики биологических соединений, и имеет неоценимое значение для химической характеристике арсенал липидных молекул А наблюдаемых в природе. CID и UVPD два взаимодополняющих способов активации, которые создают различные типы ионов ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами AI064184 и AI76322 от Национальных Институтов Здоровья (NIH) и Грант 61789-MA-МУР от Research Office армии к MST исследований была также поддержана Welch Foundation Grant F1155 и NIH грант R01GM103655 в АБ

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ХлороформThermo Fisher ScientificC607ВЭЖХ
МетанолThermo Fisher ScientificA452ВЭЖХ
Тефлон FEP Центрифуга БутылкиThermo Fisher Scientific05-562-21
Силикагель 60 TLC пластиныEMD Biosciences5626-6
Класс No 3MM Хроматографическая бумагаВатман3030700
Orbitrap EliteThermo Fisher Научный
масс-спектрометр
ExciStar XS Excimer LasrerCoherent Inc.
Излучатели PicoTip Nanospray ESIНовые модели≥ 30 μ m для уменьшения засорения
Модель 505 Генератор импульсов/задержкиBerkeley Nucleonics Corporation
Горячая пластина Thermoylne 2200Barnstead/ThermolyneHPA2235MQ
16x125 мм GPI 15-415 Резьбовые одноразовые боросиликатные культуральные пробиркиCorning Pyrex99449-16X
Многоразовые резьбовые колпачки из ПТФЭ GPI 45-415Corning9999-152
Персональная молекулярная имидж-система (phosphorimager)BioRad170-9400
Кассета для авторадиографииThermo Fisher ScientificFBCS810
Phosphorscreen SO230Kodak
Peptide Mass Standards KitSequazymeP2-3143-00
Sonifier S250-ABranson101063196
1,5 мл 12x32 мм Коническое основание с винтовой резьбой ФлаконThermo Fisher ScientificC4000-V1

Ссылки

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. , 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

MALDI TOFESI

Похожие статьи