Сотрудничество между активированной онкоген как РАН V12 и мутациями в генах клеточной полярности, как написал, приведет к росту опухоли у дрозофилы, когда опухолевые клетки также отображать инвазивных поведения. Вот простой протокол для индукции и наблюдения за доброкачественных и инвазивных опухолей представлена.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Drosophila осветил наше понимание генетической основы нормального развития и заболевания в течение последних нескольких десятилетий, и сегодня он продолжает вносят огромный вклад в наше понимание сложных заболеваний 1-7. Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является комплексное мероприятие 8 и был смоделирован у дрозофилы, чтобы помочь нам лучше понять генетическую основу этого заболевания 9. Здесь я представляю простой протокол к генетически индуцировать, наблюдать, а затем анализировать прогрессирование опухолей у личинок дрозофилы. Метод индукции опухолей основана на системе MARCM 10 и использует взаимодействие между активированного онкогена, Рас-V12 и потери генов клеточной полярности (исписанной, диски большой и летальный гигантский личинок) для генерации инвазивных опухолей 9. Я продемонстрировать, как эти опухоли могут быть визуализированы в неповрежденной личинок ито как они могут быть вырезали для дальнейшего анализа. Упрощенная Протокол, представленные здесь, должны сделать возможным для эта техника, которые будут использоваться исследователями, заинтересованных в понимании роли гена в опухолевой инвазии.
Введение
Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является шагом мудрый процесс, который характеризуется уклонение от защитных механизмов в организме 8. Например опухолевые клетки в организме должны быть в состоянии уйти от апоптоза и иммунную систему, прорыв специализированный внеклеточный матрикс (ECM) под названием базальной мембраны, и преодолеть любые социального контроля, введенные окружающих клеток 8. Именно через шаг мудрого прогрессии, что раковые клетки приобретают способность к миграции и колонизации отдаленных объектов в процессе, называемом метастазы. Наше понимание того, как опухолевая клетка преодолевает ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Индукционная доброкачественных неинвазивных опухолей
- Используйте запасы перечисленных в таблице 2 для индукции доброкачественных опухолей.
- Подготовьте закваски для "Тестер" складе следующего генотипа: Y, W, EY-FLP1; ванна-Gal80, FRT40A; Act5C> у +> Gal4, UAS-GFP
- Подготовьте закваски для "испытания" на складе следующего генотипа: W; FRT40A, БАС-Рас V12 / суо
- Соберите десять женщин девственниц из "тестер" складе и десять мужчин из "тестируемого" складе.
- Крест на мужчин и женщин из "тестер" и "испытания" на складе, помещая их обоих во флаконе с лету пищи....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В результате протокола, представленные здесь пользователь сможет вызвать доброкачественные опухоли за счет избыточной экспрессии активированного онкоген в личиночной глаз усиков имагинального диска. Пользователь также сможет побудить инвазивных опухолей в глаза усиков диска за счет избыточной экспрессии активированного онкоген в клонах клеток также мутантные по гену клеточной полярности. Опухоли могут быть легко визуализированы с помощью флуоресцентного стереомикроскопа как "зеленый флуоресцентный" ткани в цел.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Рак является сложным заболеванием с гораздо лучшего понимания сегодня, чем в прошлом. Тем не менее, многое еще предстоит узнать и объяснил прежде чем мы имеем полную картину основных механизмов. Простой протокол, представленные здесь делает возможным генетически вызывать доброкачественные и инвазивных опухолей в целом организме, а затем изучить биологию, связанную с прогрессированием опухолей в этой модели. Большинство существующих методов у дрозофилы и других организмов либо используют культуры на основе клето.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Я не имею ничего раскрывать.
Благодарности
Исследования в моей лаборатории поддерживается WKU кафедры биологии запуска средств, WKU исследовательский фонд RCAP-Я допускаю # 11-8032 и грантом KBRIN-ЗОНА финансируется за счет родительского грант от Национального Института общей медицинских наук Национального института здравоохранения под награда числа 5P20GM103436-13. Я также хотел бы выразить признательность доктору Тянь Сю в лаборатории которого я познакомился с этой техникой и д-р Раймонд Pagliarini который первым установленном эту технику в лаборатории Сюй.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 10X PBS (фосфатно-солевой буфер) pH 7,2 стоковый раствор | Invitrogen, Sigma Aldrich | ||
| Chilled 1X PBS pH7,2 рабочий раствор | Invitrogen, Sigma Aldrich | Make fresh и хранить в холодильнике, можно использовать до недели | |
| Flynap | Carolina Biologicals | Анестезия от мух необходима для обезболивания личинок | |
| Фиксатор | 0,1M PIPES, pH 7,2, 4% Параформальдегид | Нужен для фиксации рассеченного головного комплекса | |
| Ведро для льда | несколькими | растворами на льду. Кроме того, препарируйте головной комплекс в охлажденном 1X PBS и затем поместите на лед в пробирку Eppendorf | |
| 1,7 мл Eppendorf tube | Различные | ||
| стеклянные предметные стекла, покровное стекло | Fisher Scientific | ||
| Vectashield Mounting Media или любой другой монтажный материал | Vector Laboratories | ||
| Halocarbon 200 или 700 Oil | Polysciences Inc. или Halocarbon.com | Галокарбон 200 используется для крепления личинок для визуализации на флуоресцентном стереоскопе | |
| Салли Хансен "Hard as Nails" лак для ногтей | Можно найти в любом магазине товаров общего назначения | Необходим для герметизации краев Coverslip | |
| Флуоресцентный стереомикроскоп Leica MZ16.5 или любой другой флуоресцентный стереомикроскоп | Leica и другие | Необходим для наблюдения за флуоресценцией GFP у личинок | |
| Щипцы Dumont #5 | Fine Science Tools | ||
| Pyrex 9 луночная пластина или любая другая чашка для препарирования | Кисть для рисования Sigma Aldrich | ||
| Можно найти в любом магазине | |||
| Table 1. Материалы, необходимые для выполнения экспериментального протокола, представленного в этой статье. | |||
Ссылки
- Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
- Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
- Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
