Методическая статья

Протокол генной индукции и визуализации доброкачественных и инвазивных опухолей в Cephalic комплексов Дрозофилы

DOI:

10.3791/50624

⸱

11 сентября 2013 г.

1Department of Biology, Western Kentucky University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сотрудничество между активированной онкоген как РАН V12 и мутациями в генах клеточной полярности, как написал, приведет к росту опухоли у дрозофилы, когда опухолевые клетки также отображать инвазивных поведения. Вот простой протокол для индукции и наблюдения за доброкачественных и инвазивных опухолей представлена.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Drosophila осветил наше понимание генетической основы нормального развития и заболевания в течение последних нескольких десятилетий, и сегодня он продолжает вносят огромный вклад в наше понимание сложных заболеваний 1-7. Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является комплексное мероприятие 8 и был смоделирован у дрозофилы, чтобы помочь нам лучше понять генетическую основу этого заболевания 9. Здесь я представляю простой протокол к генетически индуцировать, наблюдать, а затем анализировать прогрессирование опухолей у личинок дрозофилы. Метод индукции опухолей основана на системе MARCM 10 и использует взаимодействие между активированного онкогена, Рас-V12 и потери генов клеточной полярности (исписанной, диски большой и летальный гигантский личинок) для генерации инвазивных опухолей 9. Я продемонстрировать, как эти опухоли могут быть визуализированы в неповрежденной личинок ито как они могут быть вырезали для дальнейшего анализа. Упрощенная Протокол, представленные здесь, должны сделать возможным для эта техника, которые будут использоваться исследователями, заинтересованных в понимании роли гена в опухолевой инвазии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Прогрессирование опухоли из доброкачественной в метастатической государства является шагом мудрый процесс, который характеризуется уклонение от защитных механизмов в организме 8. Например опухолевые клетки в организме должны быть в состоянии уйти от апоптоза и иммунную систему, прорыв специализированный внеклеточный матрикс (ECM) под названием базальной мембраны, и преодолеть любые социального контроля, введенные окружающих клеток 8. Именно через шаг мудрого прогрессии, что раковые клетки приобретают способность к миграции и колонизации отдаленных объектов в процессе, называемом метастазы. Наше понимание того, как опухолевая клетка преодолевает барьеры, введенные тела все еще ​​находится в зачаточном состоянии, однако, складывающаяся картина из исследований, проведенных до сих пор указывает на повторном использовании нормальных процессов развития и сигнальных путей по раковых клеток 11-13.

Плодовая муха дрозофилы имеет вносит огромный вклад в нашу ундerstanding нормального развития и болезни за счет использования сложных генетических методов, разработанных в течение последних нескольких десятилетий 14-17. Использование мутагенеза а избыточная экспрессия инструменты мы пришли к лучшему пониманию различных онкогенов и генов-супрессоров опухолей 18-22. Тем не менее, метастазирование опухолей является результатом сотрудничества между несколькими генетических поражений, которые были изучены в первую очередь в клеточных моделях культуры 23,24, а также различные ксенотрансплантата моделей 25-27. Эти модели, хотя мощный имеют свои ограничения, поскольку они не имитировать полностью условиям, имеющимся в живом организме. Кроме того, трансгенные модели доступны у мышей являются громоздкими и не способствует генетического анализа инвазивного поведения 28,29. Несколько исследований пытались понять вторжение опухолевых клеток у дрозофилы 30,31. Эти методы в основном используют трансплантацию первичных опухолей к хостам а затем полагаться на отслеживание траnsplanted опухоли за вторжение в соседние ткани 32,33. Мощная техника называется MARCM 10 была адаптирована Pagliarini и Сюй моделировать опухолевой инвазии у дрозофилы 9. Этот элегантный генетическая моделирование опухолевой инвазии эксплуатировали сотрудничества между активированной онкоген и потери клеточной полярности. Мощность этого моделирования заключается в том, что инвазивных опухолей создаются в здоровом организме, таким образом, обход необходимость трансплантации тканей. Чтобы добиться онкогенного сотрудничества, активированный онкоген как Рас V12 выражается в клонов клеток в личиночной глаз-усиков диска. В результате технике MARCM эти клоны также отмечены зеленого флуоресцентного белка (GFP) для легкой визуализации и сделаны гомозиготных по клеточной полярности мутантов, как летальной гигантских личинок, пометки и дисков больших. В результате GFP помечены инвазивных опухолей в головной комплекс. В этом докладе япродемонстрировать, как вызвать, и визуализировать эти инвазивных опухолей как в контексте интактного личинок и в вырезали головной комплекса. Индукционная опухоль, представленная здесь использует реагенты на втором хромосомы дрозофилы. В таблице 2 я приведу листинг акций на X и 3-м хромосом, которые могут быть использованы для тех же целей. Я считаю, что это упрощенный протокол сделает этот метод легко доступны для исследователей, заинтересованных в понимании молекулярных основ опухолевой прогрессии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Индукционная доброкачественных неинвазивных опухолей

  1. Используйте запасы перечисленных в таблице 2 для индукции доброкачественных опухолей.
  2. Подготовьте закваски для "Тестер" складе следующего генотипа: Y, W, EY-FLP1; ванна-Gal80, FRT40A; Act5C> у +> Gal4, UAS-GFP
  3. Подготовьте закваски для "испытания" на складе следующего генотипа: W; FRT40A, БАС-Рас V12 / суо
  4. Соберите десять женщин девственниц из "тестер" складе и десять мужчин из "тестируемого" складе.
  5. Крест на мужчин и женщин из "тестер" и "испытания" на складе, помещая их обоих во флаконе с лету пищи.
  6. Наведите крест в инкубаторе 25 ° C и позволяют самцы и самки к спариванию и откладывают яйца в течение 24-48 часов.
  7. Проверьте флаконы для достаточной откладывания яиц и на наличие первые личинки возрастной стадии убедившись, что культура не высыхания.
    1. Добавить несколько капель в автоклаведистиллированную воду к культуре, чтобы держать его влажным (если культура высыхания).
    2. Продолжайте следить за культуру и повторите шаг 1.7.1 по мере необходимости.
  8. Соблюдайте блуждающих третий личинок Instar под флуоресцентным стереомикроскопом как указано в разделе 3.

2. Индукция инвазивных опухолей

  1. Использование запасов, перечисленные в таблице 2 для индукции инвазивных опухолей.
  2. Используйте закваски, начиная с шага 1.2 выше следующего генотипа: Y, W, эй-FLP1; ванна-Gal80, FRT40A; Act5C> у +> Gal4, UAS-GFP
  3. Подготовьте закваски для "испытания" на складе следующего генотипа: W; LGL 4, FRT40A, БАС-Рас V12 / суо
  4. Соберите десять женщин девственниц из "тестер" складе и десять мужчин из "тестируемого" складе.
  5. Крест на мужчин и женщин из "тестер" и "испытания" на складе, помещая их обоих во флаконе с лету еООД.
  6. Наведите крест в инкубаторе 25 ° C и позволяют самцы и самки к спариванию и откладывают яйца в течение 24-48 часов.
  7. Проверьте флаконы для достаточной откладывания яиц и на наличие первые личинки возрастной стадии убедившись, что культура не высыхания.
    1. Добавить несколько капель автоклавного дистиллированной воды к культуре, чтобы держать его влажным (если культура высыхания).
    2. Продолжайте следить за культуру для сухости и повторите шаг 2.7.1 по мере необходимости.
  8. Соблюдайте третий личинок Instar под флуоресцентным стереомикроскопом как указано в разделе 3.

3. Наблюдение Доброкачественные и инвазивных опухолей

  1. Используйте третий личинок Instar для доброкачественной изоляции опухоли и визуализации.
    1. Влажный кисть в дистиллированной воде, и использование этого кисть очистить несколько третий возрастной стадии личинок от стенки флакона культуры.
    2. Наведите личинок в депрессии слайд с 1X PBS, а затем с помощью влажной Кисть ломе от любой пищевой материал от личиночной эпидермиса.
    3. Поместите личинок в чашку Петри и оставляют при -20 ° C морозильнике в течение 30 мин для иммобилизации личинки.
      1. Альтернативный метод для иммобилизации личинок с помощью FLYNAP.
      2. Поставьте FLYNAP палочку, смоченным в FLYNAP во флакон с 3.1.3.2 и после подключения флакон Пусть подключен флакон с личинками стоять от 30 до 40 мин.
    4. Поместите иммобилизованного личинку на предметное стекло, добавить каплю света галоидоуглеводородов масла, накрыть покровным стеклом и наблюдать под флуоресцентным стереомикроскопом с возможностью визуализации зеленый флуоресцентный белок (GFP).
    5. Доброкачественная личинки подшипник опухоли высветится зеленый в передней области, где головной комплекс присутствует.
  2. Выберите день 10 личинок (после индукции) из культуры, установленной в шаге 2 выше для наблюдения инвазивных опухолей. День 10 личинки выбираются потому личинки подшипник инвазивной опухоли имеют расширенный лARVAL этап и вообще не в pupariate.
  3. Выполните действия, описанные 3.1.1 3.1.4 только вместо третьей стадии личинок использования день 10 личинок.
    1. На следующий день 10 инвазивная подшипник опухоли личинки будут светиться зеленым в передней области, где головной комплекс присутствует.
  4. Если флуоресцентный микроскоп оснащен цифровой камерой, то сфотографировать флуоресцирующей доброкачественной и инвазионных личинок подшипника опухоли.

4. Рассечение Cephalic комплекса и дальнейшего наблюдения доброкачественных и инвазивных опухолей

Полупрозрачные эпидермис личинки делает его трудно наблюдать степень вторжения опухолей. Таким образом, степень инвазии лучше визуализируются с помощью рассечения головной комплекс из личинки. Следующие шаги должны быть использованы препарировать головной комплекс.

  1. Использование влажной кисть выбрать третьего возраста личинок (для доброкачественных опухолей) и день 10 личинок (для инвазивных опухолей) ером соответствующие культуры флаконов.
  2. Наведите личинок в скважине рассечение блюдо с холодной 1X PBS. Используйте кисть, чтобы соскоблить любые частицы пищи от личиночной эпидермиса.
    1. Трансфер чистую личинок в свежую лунку рассечение блюдо с холодной 1X PBS.
    2. Проверка на наличие флуоресценции GFP с помощью стереомикроскопа способный обнаруживать флуоресценции. Откажитесь без GFP личинок подшипника.
  3. Добавить 1,0 мл холодной 1X PBS в свежую лунку на рассечение блюдо и с использованием пары щипцов передачи личинку подшипник либо доброкачественных или инвазивных опухолей (протокол рассечение остается тем же самым для этих двух типов опухолей).
  4. Держите личинку вниз, используя пару щипцов о 2/3rds от переднего конца.
    1. Используйте другую пару щипцов и ловко отделить заднюю 1/3rd личинки и выбросьте его.
    2. Отпусти передней 2/3rds личинки. Как давление внутри личинки освобождается содержимоеличинка сочиться из полости тела.
    3. Используйте пару щипцов для удаления кишечник, толстый корпус и другие внутреннее содержимое личинки, которые сочилась из полости тела.
    4. Используйте пару щипцов держать рот крючок личинки и вставьте его в личиночной эпидермиса и, используя другую пару щипцов инвертировать личинку полностью.
    5. Используйте пинцет, чтобы аккуратно и осторожно удалите жир тела, слюнные железы, кишечника, крыло диска комплекс и любые трахеи трубки. Теперь головной комплекс должен быть виден прикреплен к ротовой крючок перевернутой личинки. Полушария головного мозга и брюшной нервной (VNC) будет по-прежнему подключен к личиночной эпидермиса через нервы, исходящих из VNC.
    6. Используйте пару щипцов, чтобы мягко разорвать связи между головных нервов и личиночной эпидермиса.
    7. Как нервные соединения между VNC и личиночной эпидермиса разбиты и избыток жира в организме и других тканей удаляется, головной сотрудничествоmplex станет ясно видны и будут прикреплены к личиночной эпидермиса только в устье крючков.
    8. Головной комплекс можно оставить ассоциируются с личиночной эпидермиса если комплекс должно быть исправлено для последовательных применений, таких как окрашивание антител или для последующей визуализации.
    9. Если ни ниже по течению приложения не будет выполнена, то головной комплекс может быть отделен от личиночной эпидермиса и помещают в каплю глицерина на основе монтажную носитель для дальнейшего наблюдения и анализа. Используйте Vectashield как монтажной СМИ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В результате протокола, представленные здесь пользователь сможет вызвать доброкачественные опухоли за счет избыточной экспрессии активированного онкоген в личиночной глаз усиков имагинального диска. Пользователь также сможет побудить инвазивных опухолей в глаза усиков диска за счет избыточной экспрессии активированного онкоген в клонах клеток также мутантные по гену клеточной полярности. Опухоли могут быть легко визуализированы с помощью флуоресцентного стереомикроскопа как "зеленый флуоресцентный" ткани в целом личинок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак является сложным заболеванием с гораздо лучшего понимания сегодня, чем в прошлом. Тем не менее, многое еще предстоит узнать и объяснил прежде чем мы имеем полную картину основных механизмов. Простой протокол, представленные здесь делает возможным генетически вызывать доброкачественные и инвазивных опухолей в целом организме, а затем изучить биологию, связанную с прогрессированием опухолей в этой модели. Большинство существующих методов у дрозофилы и других организмов либо используют культуры на основе клето...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Я не имею ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования в моей лаборатории поддерживается WKU кафедры биологии запуска средств, WKU исследовательский фонд RCAP-Я допускаю # 11-8032 и грантом KBRIN-ЗОНА финансируется за счет родительского грант от Национального Института общей медицинских наук Национального института здравоохранения под награда числа 5P20GM103436-13. Я также хотел бы выразить признательность доктору Тянь Сю в лаборатории которого я познакомился с этой техникой и д-р Раймонд Pagliarini который первым установленном эту технику в лаборатории Сюй.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10X PBS (фосфатно-солевой буфер) pH 7,2 стоковый растворInvitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7,2 рабочий растворInvitrogen, Sigma AldrichMake fresh и хранить в холодильнике, можно использовать до недели
FlynapCarolina BiologicalsАнестезия от мух необходима для обезболивания личинок
Фиксатор0,1M PIPES, pH 7,2, 4% ПараформальдегидНужен для фиксации рассеченного головного комплекса
Ведро для льданесколькимирастворами на льду. Кроме того, препарируйте головной комплекс в охлажденном 1X PBS и затем поместите на лед в пробирку Eppendorf
1,7 мл Eppendorf tubeРазличные
стеклянные предметные стекла, покровное стеклоFisher Scientific
Vectashield Mounting Media или любой другой монтажный материалVector Laboratories
Halocarbon 200 или 700 OilPolysciences Inc. или Halocarbon.comГалокарбон 200 используется для крепления личинок для визуализации на флуоресцентном стереоскопе
Салли Хансен "Hard as Nails" лак для ногтейМожно найти в любом магазине товаров общего назначенияНеобходим для герметизации краев Coverslip
Флуоресцентный стереомикроскоп Leica MZ16.5 или любой другой флуоресцентный стереомикроскопLeica и другиеНеобходим для наблюдения за флуоресценцией GFP у личинок
Щипцы Dumont #5Fine Science Tools
Pyrex 9 луночная пластина или любая другая чашка для препарированияКисть для рисования Sigma Aldrich
Можно найти в любом магазине
Table 1. Материалы, необходимые для выполнения экспериментального протокола, представленного в этой статье.
товаров общего назначения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bale, A. E. Hedgehog signaling and human disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 3, 47-65 (2002).
  2. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342, 1-11 (2004).
  3. Coombs, G. S., Covey, T. M., Virshup, D. M. Wnt signaling in development, disease and translational medicine. Curr Drug Targets. 9, 513-531 (2008).
  4. Gistelinck, M., Lambert, J. C., Callaerts, P., Dermaut, B., Dourlen, P. Drosophila models of tauopathies: what have we learned. Int J Alzheimers Dis. 2012, 970980(2012).
  5. Marsh, J. L., Thompson, L. M. Drosophila in the study of neurodegenerative disease. Neuron. 52, 169-178 (2006).
  6. Reiter, L. T., Bier, E. Using Drosophila melanogaster to uncover human disease gene function and potential drug target proteins. Expert Opin Ther Targets. 6, 387-399 (2002).
  7. Valenta, T., Hausmann, G., Basler, K. The many faces and functions of beta-catenin. EMBO J. 31, 2714-2736 (2012).
  8. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  9. Pagliarini, R. A., Xu, T. A genetic screen in Drosophila for metastatic behavior. Science. 302, 1227-1231 (2003).
  10. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) in Drosophila. Nat Protoc. 1, 2583-2589 (2006).
  11. Boccaccio, C., Comoglio, P. M. Invasive growth: a MET-driven genetic programme for cancer and stem cells. Nat Rev Cancer. 6, 637-645 (2006).
  12. Srivastava, A., Pastor-Pareja, J. C., Igaki, T., Pagliarini, R., Xu, T. Basement membrane remodeling is essential for Drosophila disc eversion and tumor invasion. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 2721-2726 (2007).
  13. Wang, W., Eddy, R., Condeelis, J. The cofilin pathway in breast cancer invasion and metastasis. Nat Rev Cancer. 7, 429-440 (2007).
  14. Brand, A. GFP as a cell and developmental marker in the Drosophila nervous system. Methods Cell Biol. 58, 165-181 (1999).
  15. Brand, A. H., Dormand, E. L. The GAL4 system as a tool for unravelling the mysteries of the Drosophila nervous system. Curr Opin Neurobiol. 5, 572-578 (1995).
  16. Vidal, M., Cagan, R. L. Drosophila models for cancer research. Curr Opin Genet Dev. 16, 10-16 (2006).
  17. Parks, A. L., et al. Systematic generation of high-resolution deletion coverage of the Drosophila melanogaster genome. Nat Genet. 36, 288-292 (2004).
  18. Blair, S. S. Genetic mosaic techniques for studying Drosophila development. Development. 130, 5065-5072 (2003).
  19. Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
  20. Xu, T., Wang, W., Zhang, S., Stewart, R. A., Yu, W. Identifying tumor suppressors in genetic mosaics: the Drosophila lats gene encodes a putative protein kinase. Development. 121, 1053-1063 (1995).
  21. Rebay, I., et al. A genetic screen for novel components of the Ras/Mitogen-activated protein kinase signaling pathway that interact with the yan gene of Drosophila identifies split ends, a new RNA recognition motif-containing protein. Genetics. 154, 695-712 (2000).
  22. Therrien, M., Morrison, D. K., Wong, A. M., Rubin, G. M. A genetic screen for modifiers of a kinase suppressor of Ras-dependent rough eye phenotype in Drosophila. Genetics. 156, 1231-1242 (2000).
  23. Albini, A., et al. A rapid in vitro assay for quantitating the invasive potential of tumor cells. Cancer Res. 47, 3239-3245 (1987).
  24. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. J Cell Sci. 99 (Pt 4), 769-775 (1991).
  25. Fidler, I. J. New developments in in vivo models of neoplasia. Cancer Metastasis Rev. 10, 191-192 (1991).
  26. Mueller, B. M., Romerdahl, C. A., Trent, J. M., Reisfeld, R. A. Suppression of spontaneous melanoma metastasis in scid mice with an antibody to the epidermal growth factor receptor. Cancer Res. 51, 2193-2198 (1991).
  27. Konantz, M., et al. Zebrafish xenografts as a tool for in vivo studies on human cancer. Ann N Y Acad Sci. 1266, 124-137 (2012).
  28. McIntyre, R. E., vander Weyden, L., Adams, D. J. Cancer gene discovery in the mouse. Curr Opin Genet Dev. 22, 14-20 (2012).
  29. Mattison, J., vander Weyden, L., Hubbard, T., Adams, D. J. Cancer gene discovery in mouse and man. Biochim Biophys Acta. 1796, 140-161 (2009).
  30. Miles, W. O., Dyson, N. J., Walker, J. A. Modeling tumor invasion and metastasis in Drosophila. Dis Model Mech. 4, 753-761 (2011).
  31. Stefanatos, R. K., Vidal, M. Tumor invasion and metastasis in Drosophila: a bold past, a bright future. J Genet Genomics. 38, 431-438 (2011).
  32. Beaucher, M., et al. Drosophila brain tumor metastases express both neuronal and glial cell type markers. Dev Biol. 301, 287-297 (2007).
  33. Beaucher, M., Hersperger, E., Page-McCaw, A., Shearn, A. Metastatic ability of Drosophila tumors depends on MMP activity. Dev Biol. 303, 625-634 (2007).
  34. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  35. Igaki, T., Pagliarini, R. A., Xu, T. Loss of cell polarity drives tumor growth and invasion through JNK activation in Drosophila. Curr Biol. 16, 1139-1146 (2006).
  36. Uhlirova, M., Jasper, H., Bohmann, D. Non-cell-autonomous induction of tissue overgrowth by JNK/Ras cooperation in a Drosophila tumor model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13123-13128 (2005).
  37. Uhlirova, M., Bohmann, D. JNK- and Fos-regulated Mmp1 expression cooperates with Ras to induce invasive tumors in Drosophila. EMBO J. 25, 5294-5304 (2006).
  38. Menut, L., et al. A mosaic genetic screen for Drosophila neoplastic tumor suppressor genes based on defective pupation. Genetics. 177, 1667-1677 (2007).
  39. Wu, M., Pastor-Pareja, J. C., Xu, T. Interaction between Ras(V12) and scribbled clones induces tumour growth and invasion. Nature. 463, 545-548 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DrosophilaMARCMGFP

Похожие статьи