Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей

Митохондрии являются существенными для органелл производства АТФ, биосинтеза аминокислот, жирных кислот, гем, железо серные кластеры и пиримидинов. Митохондрии также играют ключевую роль в гомеостазе кальция, а в регуляции апоптоза. ¹ больше доказательств ссылки митохондрии старения и возрастных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона. ² В то время как люди живут всю свою жизнь с мутации в митохондриальных белков, которые связаны с нейродегенеративные заболевания, симптомы болезни возникают только в будущем. Это означает, что изменения происходят в митохондриях с возрастом, которые позволяют патологии болезни появляться. Действительно, митохондриальная фитнес коррелирует с общего состояния здоровья и продолжительности жизни клетки дрожжей и в клетках млекопитающих. ^3,4 Здесь мы опишем, как использовать генетически кодируемых, логометрических флуоресцентные биосенсоры для оценки двух важных особенностях Митокhondria в живых дрожжевых клеток: окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ.

Функции митохондрий в аэробных мобилизации энергии хорошо известна. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние является продуктом сокращения и окислителей в органеллы, в том числе NAD ⁺ / NADH, FAD / ГВС _2, NADP ⁺ / NADPH, глутатион / глутатион дисульфида (GSH / GSSG) и активные формы кислорода (ROS). Разобщение митохондрии или гипоксия влияет на митохондриальную дыхательную активность и изменяет отношение NAD ⁺ до NADH в органеллы. АФК, которые получают из неэффективного переноса электронов между комплексами цепи переноса электронов во внутренней митохондриальной мембраны, а также от дезаминирование аминов через моноаминоксидазы в наружной мембраны митохондрий ^5, повреждения липиды, белки и нуклеиновые кислоты и имеют были связаны со старением и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний ^6,7,8. ROS также играют важную роль в передаче сигнала в мitochondria, через окисление GSH. Например, NADH дегидрогеназы не только способствует продукции АФК, но и регулируется за счет взаимодействия с бассейном глутатиона ^9,10. α-кетоглутаратдегидрогеназы и аконитазу, компоненты ЦТК, проявляют пониженную активность в окислительных средах ^11,12.

Действительно, окислительно-восстановительный потенциал-зависимого регулирования аконитазу активность сохраняется от бактерий до млекопитающих ^13,14. Таким образом, наблюдая окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ митохондрий крайне важно для понимания их функции и роль в патологии болезни.

Биохимические методы были использованы для оценки окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ целых клеток или изолированными митохондриями. Широко используются методы оценки окислительно-восстановительное состояние целых клеток или изолированных митохондрий, основанные на измерении уровней окислительно-восстановительной пары GSH / GSSG ^15. Люциферин-люциферазы системы обычно используют для измерения митохондриальнойУровней АТФ в любом проницаемыми целых клеток или изолированных митохондрий. ^{16,17,18,19,20} В этом анализе люциферазы связывается с АТФ и катализирует окисление и хемилюминесценции с люциферин. ²¹ интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству АТФ в реакционной смеси. ²²

Эти методы показали основную информацию о функции митохондрий, включая обнаружение того, что пациенты с нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, имеют аномально низких уровней АТФ. ²³ Тем не менее, они не могут быть использованы для изображения жизни, интактных клеток. Кроме того, методы, основанные на цельноклеточной анализа обеспечивают в среднем окислительно-восстановительное состояние или уровень АТФ во всех отсеках ячейки. Измерения в изолированных органелл являются потенциально проблематично из-за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ может изменяться в процессе внутриклеточного фракционирования. Наконец, недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие показывают, чтомитохондрий в отдельные клетки являются гетерогенными в функции, которые в свою очередь влияет на продолжительность жизни матери и дочерним клеткам. ³ Таким образом, существует необходимость измерения митохондриальной АТФ и окислительно-восстановительное состояние в живых клетках с субклеточных разрешение.

Биосенсоры для митохондриальной функции, описанные здесь, как на основе GFP. Редокс-чувствительный GFP (roGFP) ^24,25 GFP является вариант, в котором экспонированы на поверхности цистеина добавляют в молекуле. roGFP, как дикого типа GFP, имеет два пика возбуждения (при ~ 400 нм и ~ 480 нм) и один пик излучения при ~ 510 нм. Окисление остатков цистеина в roGFP приводит к увеличению возбуждение при ~ 400 нм. Сокращение этих цистеина способствует возбуждению при ~ 480 нм. Таким образом, отношение 510 нм, излучение при возбуждении roGFP при 480 нм и 400 нм показывает относительное количество восстановленной и окисленной roGFP, которая отражает окислительно-восстановительное состояние окружающей среды флуорофор о.

Два испионами roGFP широко используются: roGFP1 и roGFP2. Оба содержат те же вставки цистеина. roGFP1 на основе дикого типа GFP и roGFP2 основана на S65T GFP, который имеет более эффективное возбуждение при 480 нм и менее эффективное возбуждение при 400 нм по сравнению с wtGFP ^24. roGFP1 меньше, чем рН-чувствительные roGFP2 и его динамический диапазон простирается далее в диапазоне значений приведенного. Таким образом, roGFP1 может быть более полезным для мониторинга более восстанавливающих отсеки, такие как митохондрии или цитозоле, и отсеков с переменным рН, такие как эндосомам. roGFP2 имеет более яркое сигнала и, в некоторых исследованиях, больший динамический диапазон, чем roGFP1 ^24,26. Исследования, проведенные в Arabidopsis THALIANA показывают, что время, требуемое для реакции на изменения в окислительно-восстановительное состояние одинакова для обоих датчиков (т ½ для окисления, 65 и 95 сек и т ½ для уменьшения, 272 и 206 сек, для roGFP1 и roGFP2, соответственно). ²⁶

MitGO-ATeam2 является малоинвазивным, надежныедатчик, который измеряет митохондриальной АТФ в начинающие CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces. GO-Ateam является энергии Ферстера резонансной передачи (FRET) зонд, который состоит из ε-субъединицы F _о F _{1-АТФ-синтазы} FRET зажатой между донором и акцептором флуоресцентного белка (GFP и оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) соответственно) ^27. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит конформационные изменения в белке, которые приносят лад донора в непосредственной близости от акцептора и позволяют передачу энергии от донора к акцептора. Есть два варианта GO-Ateam, GO-GO и ATeam1-ATeam2. GO-ATeam2 имеет более высокое сродство к MgATP чем GO-ATeam1, что делает ее более пригодной для измерения обычно ниже, [АТФ] в митохондриях по сравнению с цитозоль ^27.

Для зондирования митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, мы построили слитого белка (Mito-roGFP1), состоящий из roGFP1 слитый с последовательностью лидера ATP9й экспрессируется из центромеры основе (низкое число копий), дрожжевой экспрессирующий плазмиду под контролем сильного глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GPD) промотор (p416GPD, Addgene). Мы использовали roGFP1 для исследования окислительно-восстановительного состояния митохондрий в контексте старения CEREVISIAE модель грибок cerevisiae. Мы считаем, что roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, которые происходят в процессе старения и в ответ на наличие питательных веществ, но не имеет никакой очевидной пагубное влияние на дрожжевые клетки. Мы также видим, изменчивость в окислительно-восстановительного состояния митохондрий в индивидуальные клетки дрожжей жизни, открытие, которое подчеркивает важность биосенсоров субклеточную с пространственным разрешением.

MitGO-ATeam2 является вариант GO-ATeam2, который имеет сигнальную последовательность митохондриальной цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA вставляется в аминоконцу GO-ATeam2. ²⁷ Мы изменили mitGO ATeam2-зонд (любезно предоставленные лабораторией H. Noji, Институт OF научных и промышленных исследований, Университет Осака, Япония) для использования в дрожжах субклонированием к ней через Xba1 и HindIII сайтах, в вектор экспрессии дрожжей pAG415GPD-БДКК (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), которая является низкой плазмидой содержащие сильного конститутивного промотора GPD. Мы выразили mitGO-ATeam2 у почкующихся дрожжей, и найти, по контрастного с ДНК-связывающим красителем DAPI, что он локализуется исключительно в митохондрии, где он служит эффективным зондом для измерения физиологических изменений в митохондриальной уровня АТФ.

roGFP и GO-Ateam оба генетически закодированы. В результате, они могут быть введены и стабильно сохраняться в интактных клетках, и предоставлять информацию о окислительно-восстановительное состояние или уровней АТФ в отдельных, живые клетки. Более того, и биосенсоров отслеживать изменения в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ, которые происходят в физиологических условиях. ⁺²⁸ Оба зонда также радиометрические. В результате измерений, выполненных с этих зондов не влияет на чаНГРЭС биосенсоров в концентрации или освещения образца или толщины. Наконец, и биосенсоры обеспечить субклеточных пространственным разрешением. Действительно, roGFP была ориентирована в митохондрии, ER, эндосомы и пероксисом ^24, и может обнаружить изменения в окислительно-восстановительное состояние каждого из этих органелл, в значительной степени зависит от рН.

1. Трансформации дрожжевых клеток с Биосенсоры

1. Преобразование нужный штамм дрожжей с плазмиду, несущую митохондрий roGFP или mitGO-ATeam2 методом ацетат лития ^27.
2. Чтобы подтвердить преобразование с плазмидой биосенсор и предотвратить потерю плазмиды, выбрать и сохранить трансформантов на соответствующих селективных синтетических полной среде (SC-Ura для митохондрий roGFP или SC-Leu для mitGo-ATeam2). Если флуоресцентного зонда была субклонировали в другую плазмиду, чем описанные здесь, используют соответствующие селективной среде. Визуализируйте трансформантах с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить, что они выражают люминесцентные биосенсоров и обладают нормальной морфологии митохондрий.

2. Рост клеток и подготовка для работы с изображениями

Функции клеток и ответ на медикаментозное лечение во многом зависит от плотности клеток и метаболической активности. Лучшие результаты получены, когда клеткиактивно делятся (в середине логарифмической фазы, ~ 0,5 - 1 × 10 ⁷ клеток / мл). Наиболее надежный способ генерации середине логарифмической фазы роста культуры последовательной плотности для инокуляции от стационарной фазы предварительной культуры.

1. Подготовьте стационарной фазы предварительной культуры: выбрать одну колонию трансформированных клеток от пластины и прививку селективном жидком носителе (5 мл в 50-мл конической нижней трубки). Расти при 30 ° C при встряхивании со скоростью 225 оборотов в минуту, пока оптическая плотность культуры при 600 нм (OD ₆₀₀₎ не достигало плато (24-48 ч).
2. Подготовьте середине логарифмической фазы роста культуры для наблюдения: использовать соответствующий объем предварительной культуры для инокуляции 5 мл селективной среды в 50 мл коническую-дно трубки. YPD носитель аутофлуоресцентной и не должны использоваться для этих исследований. Использование синтетических полной, глюкоза основаны, падением напряжения (SC-УПА) средства массовой информации. Рост клеток при 30 ° С, встряхивая при 225 оборотах в минуту, в течение 4-16 ч, пока они не достигают середины логарифмической фазы роста (~ 0,5 - 1 × 10 ⁷ клеток / мл). Плотность клеток может быть определенапутем измерения OD _600; откалибровать спектрофотометр для определения правильного OD ₆₀₀ считывания. На нашем Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), в середине логарифмической фазы соответствует OD ₆₀₀ 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 чувств колебания в органеллы в ответ на метаболические изменения. Например, в данном анализе митохондриальных окислительно-восстановительные изменения состояния, когда дрожжи растут на брожению источники углерода (например, глюкоза, как и в средах SC) по сравнению с несбраживаемые источники углерода (например, глицерин, как и в SGlyc среды), и даже в разные партии одного и того же средств массовой информации. Таким образом, использование той же партии СМИ для всех экспериментов.

3. Клетки готовы к концентрации (см. шаг 2.4) и изображения, если лечение не может быть исполнено. Если клетки лечат, инкубировать клетки с соответствующей обработки и перехода к следующему шагу.
4. Концентрат 1 мл культуры путем центрифугировани при 6000 х г в течение 15 сек иресуспендирования осадка клеток в 20 мкл среды. Эти условия максимизировать число различаемых сот в поле зрения.
5. Нанести 2 мкл ресуспендировали клетки слайдов. Покрытие с покровным (№ 1,5, предпочтительно высокопроизводительной 170 ± 5 мкм толщиной) и герметизации краев покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей или valap (см. реагенты). Чтобы скрепить с valap, расплав небольшое количество на металлического шпателя, держа его над пламенем горелки Бунзена, то распространение небольшое количество по краям покровного стекла.
6. Поддержание клетки при 30 ° С в течение изображений. Цель нагревателя на 100x иммерсионной линзы масло, используемое для работы с изображениями хорошо работает для этого приложения. В этих условиях, морфологии митохондрий, окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ остаются неизменными во время съемки в течение 10-15 мин.

3. Настройка изображения

1. Настройка для работы с изображениями Mito-roGFP1 на широком поле флуоресцентного микроскопа
   Шаги здесь приспособлены к AxioObserver.Z1 микроскоп с возбуждением Colibri светодиодных источников, широким полем Orca ER камеру и AxioVision приобретение программного обеспечения. Фотообесцвечивание обоих каналов и фотопреобразование окисленных Mito-roGFP1 значительно сокращается с использованием светодиодной подсветки по сравнению с ртутной лампой освещения (см. ниже).
   Для максимального сигнала и разрешение, использовать самую высокую числовую апертуру возможно в объективном, а самое низкое увеличение которое обеспечивает достаточное пространственное разрешение. Кроме того, для Mito-roGFP изображений, убедитесь, что цель передает также при 365 нм. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar цели (Zeiss) работает хорошо для этого приложения.
   Формирование захвата программное обеспечение для захвата окисленных и восстановленных Mito-roGFP1 видов. Мы используем следующие условия.
   1. Настройка канала для окисленных Mito-roGFP использовать возбуждение при 365 нм (100% силы СИД) и выбросов фильтр, пригодный для GFP, таких, как 38 HE Набор фильтров (Zeiss), с включенным возбуждениян фильтр удаляется из куба. Снятие возбуждения фильтр позволяет возбуждения на обоих 365 нм и 470 нм, без необходимости переключения фильтра, тем самым увеличивая достижимое разрешение времени.
   2. Настройка канала для снижения митохондрий roGFP использовать возбуждение при 470 нм (100% индикатор мощности) и, как упоминалось выше, тот же фильтр твердых куб использоваться для окисленного митохондрий roGFP. Установите камеру 1x1 биннинге для оптимизации пространственного разрешения.
   3. Установить программное обеспечение для измерения AZ стек, состоящий из 11 кусочков 0,5 мкм с расстоянием, собирая обоих каналов в каждом положении Z. Этот способ приобретения медленнее, чем приобретение каждого стека г, в свою очередь, но он предотвращает артефакты, связанные с митохондриальной движение между приобретением окисленных и восстановленных каналов.
   4. Изображение нескольких ячеек для определения соответствующего времени экспозиции, производя сильное, но не насыщение сигнала. Важно поддерживать соотношение времени экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 для всех экспериментовс. Например, если время экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 в 300 и 100 мс соответственно, то время экспозиции для окисленных митохондрий roGFP1 должна быть в 3 раза, что для уменьшен митохондрий roGFP для всех экспериментах.
2. Настройка для работы с изображениями mitGO-ATeam2 от спектрального конфокальной микроскопии
   Для количественной оценки уровня АТФ использованием mitGO-ATeam2, флуоресценция GFP (максимум излучения 510 нм) следует отличать от, что из р (максимум излучения 560 нм). Есть флуоресценции наборы фильтров, которые разрешают флуоресценции от этих флуорофорам. Однако мы считаем, что спектральный детектор, доступный на многих лазерной сканирующей конфокальной микроскопы, лучше всего подходит для этого приложения. Спектрального детектора отделяет флуоресцентного излучения на множество компонентов (как правило, 32 или более) в зависимости от длины волны. Несколько соседних полосах длин волн могут быть объединены в один канал изображения. Длины волн должны быть объединены выбираются эмпирически так, чтобы максимизировать сигнала от GFP и ОФП, избегая при этом кроссовер сигнал, что бы посрамить FRET измерения. Используйте высокие числовые апертуры линзы доступны. Мы используем 100x/1.49 или 60x/1.49 Apo-TIRF линзы. Мы используем Nikon A1R конфокальной микроскопии NIS работает Элементы программного обеспечения. Формирование захвата программное обеспечение для захвата АТФ-связанного и несвязанного ATP-mitGO-ATeam2 видов. Мы используем следующие условия.
   1. Установить обскуры до 1,0 единиц Эйри (АС), который в нашей системе соответствует AZ разрешение около 0,42 мкм.
   2. Установить сканирования зум образом приблизиться к пределу Найквиста, которая будет максимально пространственной информации в изображении. В нашей системе размер пикселя 0,12 мкм.
   3. Поскольку митохондрии могут двигаться во время съемки, это может быть полезно для увеличения скорости визуализации, обрезка полей до 512 х 256 пикселей. Общее время, необходимое для изображения одного кадра в системе составляет 1,0 сек, в том числе два раза сканирования среднего. В зависимости от желаемого пространственное разрешение, поле может быть обрезано по дальнейшему увеличениемэлектронной временным разрешением.
   4. Excite при 488 нм, и собирать излучение от 500 - 520 нм для GFP, и от 550 - 580 нм для ОФП. Фактическое оптимальные значения могут изменяться в зависимости от характеристик системы формирования изображения.
   5. Оптимальной мощности лазера для нашей системы от 6,0 до 6,4%. Оптимальная мощность лазера будет разным для каждого микроскопа системы, но в идеале быть как можно ниже, в то время как до сих пор производит интерпретируемые изображения. Используйте внутренний или внешний измеритель мощности для мониторинга изменений в мощности лазера, которые происходят обычно в течение долгого времени в любой оптической системы.
   6. Регулировка усиления детектора и интенсивности освещающего света максимально обнаружен диапазон значений пикселей, но избежать насыщения сигнала, на столько ячеек, сколько возможно. Не анализируйте любые клетки, содержащие более 1% насыщенных пикселей. Изображение всех образцов с использованием той же цели, мощность лазера, сканирование зумом, размер пикселя, усиления и смещения.

4. Image Acquisition

1. Найдите Фокусное пла дной из интересующих клеток с использованием проходящего света для минимизации отбеливания флуоресцентного зонда.
2. После обнаружения одного или более интересующих клеток, собирают г серии по всей глубине средней клетки (около 7 мкм), используя размер шага 0,5 мкм.
3. Изображение другие интересующие клетки на слайде, но не изображение одного слайда дольше 15 мин. Через 15 минут на слайде, клетки теряют жизнеспособность.

5. Анализ

Митохондриальной АТФ определяется путем измерения отношения mitGO-ATeam2 излучение при 560 нм к поглощению при 510 нм ⁺²⁷ окислительно-восстановительное состояние органеллы определяется как сводится к окислению (R / O) Отношение митохондрий roGFP;. Т.е. излучения на длине волны 510 нм при возбуждении на 470 нм деленное на излучение на длине волны 510 нм при возбуждении при 365 нм. Перед расчетом отношения, вычесть фона и определения порогового значения для пикселов, принадлежащих флуоресцентный митохондрий.

5.1 Анализ ImageJ

1. Открытие изображений и изменения типа до 32 бит: Тип изображения → → 32 бит.
2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Рассчитать среднюю интенсивность в этой ROI: Анализ → Измерить.
3. Вычтите расчетным средним фоном из стека: Процесс → Математика → вычитать.
4. Использование вычитается обеспечение Z-Stack, найти середину кусочек и на порог митохондрий: Изображение → Настройка → Порог и нажмите кнопку Применить на пороге окна. Применить ко всем ломтиков в стеке. Проверьте установить фоновую пикселей NaN.
5. Создать соотношение Z стека: Процесс → Image Calculator Разделите пониженной стек окисленные Z стек для Mito-roGFP1 анализа. Разделите 560 нм (АТФ связанной) изображение, 510 нм (АТФ несвязанного) изображение для mitGO ATeam2-анализа.
6. Нарисуйте ROI вокруг области интереса. Выберите Анализ → Инструменты → ROI менеджер, и нажмите кнопку Добавить, чтобы записать ROI. Несколько регионов могут быть сохранены в менеджере. В диспетчере ROI, выберите все трансформирования, затем выберите Mруды → Multi-измерения для измерения всех стек ломтиками. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

5.2 Анализ Volocity

1. Импортировать изображения в Volocity библиотеки и создать последовательность изображений с 2 ​​каналами.
2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Выберите: Инструменты → Ratio.
3. Используйте Volocity для расчета фона: Получить Рой.
4. Регулировка порога включить митохондриальных структур.
5. Проверьте возможность применить LUT радуги отношению канала. Интенсивность модулированных каналов может привести к менее шумные изображения для презентации ции, но оно не должно использоваться для количественного определения среднего отношения.
6. Выберите вкладку измерений, выбрать формат канала и привлечь ROI вокруг области интереса. Измерение отношения канала, за исключением нулевых значений. Множественные участки могут быть выбраны и измереныв то же время. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

Измерение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния митохондрий-roGFP

Здесь мы показываем, что Мито-roGFP1 имеет динамический диапазон для обнаружения изменений в митохондриальных окислительно-восстановительное состояние от полностью окисляется до уменьшена в живых дрожжевых клеток, не влияя на рост дрожжей клетки или морфологии митохондрий. Сначала мы находим митохондрии клеток, экспрессирующих GFP-целевых и roGFP1 расти по обычным ставкам (рис. 1А). Максимальная скорость роста, измеряемые максимальный наклон кривой роста во время входа в фазе роста и время достижения максимальной скорости роста, похожа в клетках, экспрессирующих Mito-GFP и Mito-roGFP1. Кроме того, в митохондриях дрожжей, экспрессирующих Mito-roGFP1 выставку дикого типа морфологии (рис. 1В). В частности, они являются трубчатыми, выровняйте по матери-буд оси, а накапливаются на кончиках мать и дочь клеток. Поскольку митохондриальная дисфункция часто вызывает фрагментацию, это нормальная морфология поддерживает идею, что Мито-roGFP1 делаетНе возмущают функции митохондрий.

Для оценки динамического диапазона митохондрий roGFP1, мы рассмотрели середине логарифмической фазы клетки дикого типа дрожжей с перекисью водорода (H 2 O 2) и дитиотреитола (DTT), соответственно, и измеренное среднее митохондриальной R / O соотношение для оценки митохондриальной окислительно-восстановительного состояния (рис. 2). Титрование H 2 O 2 или DTT от 0 до 10 мМ приводит к дозозависимое изменение средней сотовой R / O соотношении с измеренным в диапазоне от 0,6 (в окислительных условиях) до 1,23 (в восстановительных условиях). Таким образом, мито-roGFP1 является эффективным биосенсора для анализа митохондриальных окислительно-восстановительное состояние в живых клетках.

Mito-roGFP1 также предлагает субклеточную разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния. Это разрешение субклеточную показывает, что митохондрии в индивидуальные клетки дрожжей отличаются относительной окислительно-восстановительного состояния. Если митохондрий в одной клетке дрожжей функционально различны, то возможно, чтоу пассивно или активно сегрегированный (рис. 3). Подобное разделение может способствовать мать-дочь возрастом асимметрия и омоложение дочерних клеток. Этот факт подчеркивает необходимость биосенсоров с субклеточных разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния.

Давно известно 31, что свет может вызвать изменения в хромофора GFP. Под воздействием высокой интенсивности света 400 нм, roGFP1 подвергается фотопреобразование к видам с различным спектром излучения 26. Когда фотопреобразования происходит, происходит уменьшение в зеленое излучение из окисленных митохондрий roGFP1 и увеличение зеленое излучение при возбуждении пониженной митохондрий roGFP1, который изменяет отношение R / O митохондрий roGFP1 (фиг.4В). Использование низкой интенсивности возбуждения (например, освещение на 40% при использовании 400 нм светодиод в источник света колибри), нет никаких существенных фотопреобразования анализируемый период (фиг.4С). P называют способ уменьшить фотопреобразование является возбуждение окисленной формы roGFP при 365 нм (см. обсуждение).

Измерение с митохондриальной АТФ-mitGO ATeam2

MitGO-ATeam2 локализуется в митохондриях при экспрессии в клетках млекопитающих. 27 Мы считаем, что mitGO ATeam2-локализуется с DAPI-окрашенных митохондриальной ДНК у дрожжей, и находится в трубчатых структур, характерных дрожжей дикого типа митохондрий (рис. 5а). Таким образом, мы убедились, что митохондрии от млекопитающих цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA локализует зонд митохондрий у дрожжей без нарушения морфологии митохондрий. Кроме того, мы находим, что скорость роста клеток, экспрессирующих mitGO-ATeam2 аналогична клеток, экспрессирующих митохондрий целевых GFP в глюкозу и глицерин СМИ (рис. 5В). Таким образом, выражение mitGO-ATeam2 не появляется вредного воздействия на клетки или митохондрий.

С учетом имеющихся данных, что mitGO-ATeam2 является эффективным биосенсоров для митохондриальных АТФ, мы использовали этот зонд для мониторинга уровней митохондриальных АТФ в дрожжи, которые были распространены использованием брожению или неферментируемым источник углерода (рис. 6А и 6В). Сокращение общего люминесцентные области в глюкозо-Выросшие клетки подтвердил, что репрессии глюкозой приводит к снижению митохондриального изобилия. Отметим, от клетки к клетке изменения в уровне mitGO-ATeam2. Интересно, что наши предварительные данные показывают, что есть ма у быть различия в уровни АТФ в различных митохондрий в пределах одной клетки (рис. 6D).

Рисунок 1. Mito-roGFP1 обнаруживает митохондриальных окислительно-восстановительное состояние, не затрагивая клетки роста или митохондриальной морфологии. (A) рост дрожжей, экспрессирующих митохондрий целевых GFP или ро-GFP1 измеряли как изменение оптической плотности при 600 нм в зависимости от времени роста SC-УПА жидкой среде при температуре 30 ° C. (В) Верхняя панель: Нормальный морфологии митохондрий и локализация канала в необработанных изображений. Нижняя панель: соотношение изображения показывают пониженная передача, деленная на окисленные канал (цвет ссылки справа). На снимках изображены эффект порога выбор на результаты. Оптимальный порог включает митохондриальной структуры и исключает фоне.jove.com/files/ftp_upload/50633/50633fig1hires.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 2. Mito-roGFP1 обнаруживает изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния в ответ на лечение перекисью водорода или дитиотреитол. (AB) в середине логарифмической фазы клетки дрожжей, экспрессирующих Mito-roGFP1 инкубировали в SC-УПА средах с отсутствием лечения (0) или с указанными концентрациями Н 2 О 2 или DTT в течение 20 мин при 30 ° С (А) Максимальный проекции интенсивности R / O митохондрий roGFP1 соотношение изображения накладываются на проходящем свете изображений, которые показывают клетки контуров. Цвет ссылки для Mito-roGFP1 показан в правом верхнем углу. Бар:. 5 мкМ (B) сильным Количественный> из R / O Mito-roGFP1 соотношение по каждому экспериментальных условиях. Ошибка бары стандартная ошибка среднего. Результаты были получены не менее 20 клеток в каждом состоянии. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 3. Mito-roGFP1 предлагает субклеточную разрешение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния. Максимальной проекции интенсивности R / O Mito-roGFP1 соотношение канал накладывается на проходящего света изображения. Цвет ссылки для Mito-roGFP1 показан в правом верхнем углу. Бар: 5 мкм. Это конкретная ячейка имеет средний R / O Mito-roGFP1 отношением 0,88. Однако отдельные митохондрии внутри этой ячейки показывают различные окислительно-восстановительные государств. Цифры указаны расчетные R / O Mito-roGFP1 соотношение для различных митохондриальных Reрегионов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 4. Высокой интенсивности возбуждения приводит к фотопреобразования и измененных R / O митохондрий roGFP1 соотношениях. В середине логарифмической фазы дрожжей, экспрессирующих митохондрий roGFP1 облучали светом 400 нм при 40% (A) или 100% (В) энергии от источника света СИД и флуоресценцию от восстановленного и окисленного Mito-roGFP1 был захвачен каждые 4 сек. На иллюстрациях показаны максимальные прогнозы, в которых цвета представляют R / O отношение Mito-roGFP1 (см. цветовую гамму в правый нижний угол). Бар:. 5 мкм (с) R / O отношение Mito-roGFP1 оставался постоянным в течение периода изображений при освещении при 40% мощности светодиодные. Тем не менее, при освещении на 100% светодиодный власти, мынаблюдать зависимое от времени изменение R / O отношение митохондрий roGFP1, который отражает photoswitching из флуорофора. Черные квадраты, 40% силы СИД;. Серые алмазы, 100% силы СИД Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 5. MitGO-ATeam2 локализуется в митохондриях в дрожжах и не влияет на дрожжах цены рост клеток. (А) Клетки дрожжей выразив mitGO-ATeam2 выращивали до середины логарифмической фазе, закрепляются параформальдегиде и окрашивали ДНК-связывающих красителей DAPI, как описано ранее . 19 На иллюстрациях показаны максимальные интенсивности проекции деконволюции Z-серии. Для простоты, mitGO-ATeam2 изображения были получены с помощью обычного фильтра GFP, так что они представляют собой только население несвязанный к АТФ. Cell Outлиниями показаны белым цветом. N: ядерная ДНК. мтДНК: митохондриальной ДНК. Бар: 1 мкм (B) Кривые роста дикого типа, клетки дрожжей, экспрессирующих митохондрий целевых GFP или mitGO-ATeam2 на основе глюкозы (SC), и на основе глицерина (SGlyc) жидкой среде при 30 ° С.. Эти данные представляют собой среднее quadruplicates для каждого штамма в каждый момент времени, и является представителем двух независимых экспериментов. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Рисунок 6. MitGO-ATeam2 измеряет изменения уровней АТФ в митохондриях дрожжей на субклеточном и suborganellar разрешение. (AB) Выброс mitGO-ATeam2 с GFP (510 нм) и ОФП (560 нм) и количественного 560/510 нм эмиссия соотношение дрожжей Клетки выращивали в течение ночи в глюкотаковой на основе (SC) (A) или на основе глицерина (SGlyc) (B) информации. Цвет ссылки для 560/510 соотношение канал указан в правом нижнем углу. Бар:. 1 мкм (C) Количественный анализ 560/510 соотношение клетки размножают в SGlyc среды с или без антимицин (2 мкг / мл) в течение 1 часа при 30 ° С. Снижение уровня АТФ на антимицином лечения является статистически значимым (Крускала-Уоллиса критерий значимости). (D) 560 нм nm/510 отношение mitGO-ATeam2 в середине логарифмической фазы клеткой дикого типа распространяются на СК-средах. Цвет ссылки для 560/510 соотношение канал указан в правом нижнем углу. Ячейка контур показаны белым. Среднее 560/510 нм коэффициент для всей клетке 0,43. Цифры, приведенные в 560/510 нм соотношения конкретных регионов в митохондриях. Бар: 1 мкм. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.

Нет конфликта интересов объявлены.