Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей

21.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/50633

⸱

22 июля 2013 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Мы опишем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоров, которые основаны на GFP, следить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей.

Аннотация

Митохондрии играют роль во многих клеточных процессах, с метаболизмом энергии и гомеостаз кальция для контроля клеточной продолжительность жизни и запрограммированной клеточной смерти. Эти процессы влияют и зависят от окислительно-восстановительного статуса и АТФ в митохондриях. Здесь мы описываем использование двух логометрических, генетически кодируемых биосенсоры, которые могут обнаружить митохондриальных окислительно-восстановительное состояние и уровни АТФ в субклеточные разрешение в живых клетках дрожжей. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние измеряется с использованием окислительно-восстановительных чувствительной зеленый флуоресцентный белок (roGFP), который направлен на митохондриях. Mito-roGFP содержит цистеина в положениях 147 и 204 GFP, которые подвергаются обратимым и экологически зависимой окисления и восстановления, которые в свою очередь изменяют спектр возбуждения белка. MitGO-Ateam является энергией резонанса Ферстера переводом (лад) датчик, в котором ε субъединицы F O F 1-АТФ-синтазы зажат между FRET донором и акцептором флуоресцентныхrescent белков. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит к изменениям в конформации белка, которые приносят лад донора и акцептора в непосредственной близости и позволяют резонансный перенос энергии флуоресценции с донора на акцептор.

Введение

Митохондрии являются существенными для органелл производства АТФ, биосинтеза аминокислот, жирных кислот, гем, железо серные кластеры и пиримидинов. Митохондрии также играют ключевую роль в гомеостазе кальция, а в регуляции апоптоза. 1 больше доказательств ссылки митохондрии старения и возрастных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз и болезнь Хантингтона. 2 В то время как люди живут всю свою жизнь с мутации в митохондриальных белков, которые связаны с нейродегенеративные заболевания, симптомы болезни возникают только в будущем. Это означает, что изменения происходят в митохондриях с возрастом, которые позволяют патологии болезни появляться. Действительно, митохондриальная фитнес коррелирует с общего состояния здоровья и продолжительности жизни клетки дрожжей и в клетках млекопитающих. 3,4 Здесь мы опишем, как использовать генетически кодируемых, логометрических флуоресцентные биосенсоры для оценки двух важных особенностях Митокhondria в живых дрожжевых клеток: окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ.

Функции митохондрий в аэробных мобилизации энергии хорошо известна. Митохондриальных окислительно-восстановительное состояние является продуктом сокращения и окислителей в органеллы, в том числе NAD + / NADH, FAD / ГВС 2, NADP + / NADPH, глутатион / глутатион дисульфида (GSH / GSSG) и активные формы кислорода (ROS). Разобщение митохондрии или гипоксия влияет на митохондриальную дыхательную активность и изменяет отношение NAD + до NADH в органеллы. АФК, которые получают из неэффективного переноса электронов между комплексами цепи переноса электронов во внутренней митохондриальной мембраны, а также от дезаминирование аминов через моноаминоксидазы в наружной мембраны митохондрий 5, повреждения липиды, белки и нуклеиновые кислоты и имеют были связаны со старением и связанных с возрастом нейродегенеративных заболеваний 6,7,8. ROS также играют важную роль в передаче сигнала в мitochondria, через окисление GSH. Например, NADH дегидрогеназы не только способствует продукции АФК, но и регулируется за счет взаимодействия с бассейном глутатиона 9,10. α-кетоглутаратдегидрогеназы и аконитазу, компоненты ЦТК, проявляют пониженную активность в окислительных средах 11,12.

Действительно, окислительно-восстановительный потенциал-зависимого регулирования аконитазу активность сохраняется от бактерий до млекопитающих 13,14. Таким образом, наблюдая окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ митохондрий крайне важно для понимания их функции и роль в патологии болезни.

Биохимические методы были использованы для оценки окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ целых клеток или изолированными митохондриями. Широко используются методы оценки окислительно-восстановительное состояние целых клеток или изолированных митохондрий, основанные на измерении уровней окислительно-восстановительной пары GSH / GSSG 15. Люциферин-люциферазы системы обычно используют для измерения митохондриальнойУровней АТФ в любом проницаемыми целых клеток или изолированных митохондрий. 16,17,18,19,20 В этом анализе люциферазы связывается с АТФ и катализирует окисление и хемилюминесценции с люциферин. 21 интенсивность излучаемого света пропорциональна количеству АТФ в реакционной смеси. 22

Эти методы показали основную информацию о функции митохондрий, включая обнаружение того, что пациенты с нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, имеют аномально низких уровней АТФ. 23 Тем не менее, они не могут быть использованы для изображения жизни, интактных клеток. Кроме того, методы, основанные на цельноклеточной анализа обеспечивают в среднем окислительно-восстановительное состояние или уровень АТФ во всех отсеках ячейки. Измерения в изолированных органелл являются потенциально проблематично из-за митохондриальных окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ может изменяться в процессе внутриклеточного фракционирования. Наконец, недавние исследования, проведенные в нашей лаборатории и другие показывают, чтомитохондрий в отдельные клетки являются гетерогенными в функции, которые в свою очередь влияет на продолжительность жизни матери и дочерним клеткам. 3 Таким образом, существует необходимость измерения митохондриальной АТФ и окислительно-восстановительное состояние в живых клетках с субклеточных разрешение.

Биосенсоры для митохондриальной функции, описанные здесь, как на основе GFP. Редокс-чувствительный GFP (roGFP) 24,25 GFP является вариант, в котором экспонированы на поверхности цистеина добавляют в молекуле. roGFP, как дикого типа GFP, имеет два пика возбуждения (при ~ 400 нм и ~ 480 нм) и один пик излучения при ~ 510 нм. Окисление остатков цистеина в roGFP приводит к увеличению возбуждение при ~ 400 нм. Сокращение этих цистеина способствует возбуждению при ~ 480 нм. Таким образом, отношение 510 нм, излучение при возбуждении roGFP при 480 нм и 400 нм показывает относительное количество восстановленной и окисленной roGFP, которая отражает окислительно-восстановительное состояние окружающей среды флуорофор о.

Два испионами roGFP широко используются: roGFP1 и roGFP2. Оба содержат те же вставки цистеина. roGFP1 на основе дикого типа GFP и roGFP2 основана на S65T GFP, который имеет более эффективное возбуждение при 480 нм и менее эффективное возбуждение при 400 нм по сравнению с wtGFP 24. roGFP1 меньше, чем рН-чувствительные roGFP2 и его динамический диапазон простирается далее в диапазоне значений приведенного. Таким образом, roGFP1 может быть более полезным для мониторинга более восстанавливающих отсеки, такие как митохондрии или цитозоле, и отсеков с переменным рН, такие как эндосомам. roGFP2 имеет более яркое сигнала и, в некоторых исследованиях, больший динамический диапазон, чем roGFP1 24,26. Исследования, проведенные в Arabidopsis THALIANA показывают, что время, требуемое для реакции на изменения в окислительно-восстановительное состояние одинакова для обоих датчиков (т ½ для окисления, 65 и 95 сек и т ½ для уменьшения, 272 и 206 сек, для roGFP1 и roGFP2, соответственно). 26

MitGO-ATeam2 является малоинвазивным, надежныедатчик, который измеряет митохондриальной АТФ в начинающие CEREVISIAE дрожжей Saccharomyces. GO-Ateam является энергии Ферстера резонансной передачи (FRET) зонд, который состоит из ε-субъединицы F о F 1-АТФ-синтазы FRET зажатой между донором и акцептором флуоресцентного белка (GFP и оранжевый флуоресцентный белок (ОФП) соответственно) 27. Связывание АТФ с ε субъединицы приводит конформационные изменения в белке, которые приносят лад донора в непосредственной близости от акцептора и позволяют передачу энергии от донора к акцептора. Есть два варианта GO-Ateam, GO-GO и ATeam1-ATeam2. GO-ATeam2 имеет более высокое сродство к MgATP чем GO-ATeam1, что делает ее более пригодной для измерения обычно ниже, [АТФ] в митохондриях по сравнению с цитозоль 27.

Для зондирования митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, мы построили слитого белка (Mito-roGFP1), состоящий из roGFP1 слитый с последовательностью лидера ATP9й экспрессируется из центромеры основе (низкое число копий), дрожжевой экспрессирующий плазмиду под контролем сильного глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GPD) промотор (p416GPD, Addgene). Мы использовали roGFP1 для исследования окислительно-восстановительного состояния митохондрий в контексте старения CEREVISIAE модель грибок cerevisiae. Мы считаем, что roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния, которые происходят в процессе старения и в ответ на наличие питательных веществ, но не имеет никакой очевидной пагубное влияние на дрожжевые клетки. Мы также видим, изменчивость в окислительно-восстановительного состояния митохондрий в индивидуальные клетки дрожжей жизни, открытие, которое подчеркивает важность биосенсоров субклеточную с пространственным разрешением.

MitGO-ATeam2 является вариант GO-ATeam2, который имеет сигнальную последовательность митохондриальной цитохром с оксидазы субъединицы VIIIA вставляется в аминоконцу GO-ATeam2. 27 Мы изменили mitGO ATeam2-зонд (любезно предоставленные лабораторией H. Noji, Институт OF научных и промышленных исследований, Университет Осака, Япония) для использования в дрожжах субклонированием к ней через Xba1 и HindIII сайтах, в вектор экспрессии дрожжей pAG415GPD-БДКК (Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), которая является низкой плазмидой содержащие сильного конститутивного промотора GPD. Мы выразили mitGO-ATeam2 у почкующихся дрожжей, и найти, по контрастного с ДНК-связывающим красителем DAPI, что он локализуется исключительно в митохондрии, где он служит эффективным зондом для измерения физиологических изменений в митохондриальной уровня АТФ.

roGFP и GO-Ateam оба генетически закодированы. В результате, они могут быть введены и стабильно сохраняться в интактных клетках, и предоставлять информацию о окислительно-восстановительное состояние или уровней АТФ в отдельных, живые клетки. Более того, и биосенсоров отслеживать изменения в окислительно-восстановительного состояния или уровня АТФ, которые происходят в физиологических условиях. +28 Оба зонда также радиометрические. В результате измерений, выполненных с этих зондов не влияет на чаНГРЭС биосенсоров в концентрации или освещения образца или толщины. Наконец, и биосенсоры обеспечить субклеточных пространственным разрешением. Действительно, roGFP была ориентирована в митохондрии, ER, эндосомы и пероксисом 24, и может обнаружить изменения в окислительно-восстановительное состояние каждого из этих органелл, в значительной степени зависит от рН.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Трансформации дрожжевых клеток с Биосенсоры

  1. Преобразование нужный штамм дрожжей с плазмиду, несущую митохондрий roGFP или mitGO-ATeam2 методом ацетат лития 27.
  2. Чтобы подтвердить преобразование с плазмидой биосенсор и предотвратить потерю плазмиды, выбрать и сохранить трансформантов на соответствующих селективных синтетических полной среде (SC-Ura для митохондрий roGFP или SC-Leu для mitGo-ATeam2). Если флуоресцентного зонда была субклонировали в другую плазмиду, чем описанные здесь, используют соответствующие селективной среде. Визуализируйте трансформантах с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить, что они выражают люминесцентные биосенсоров и обладают нормальной морфологии митохондрий.

2. Рост клеток и подготовка для работы с изображениями

Функции клеток и ответ на медикаментозное лечение во многом зависит от плотности клеток и метаболической активности. Лучшие результаты получены, когда клеткиактивно делятся (в середине логарифмической фазы, ~ 0,5 - 1 × 10 7 клеток / мл). Наиболее надежный способ генерации середине логарифмической фазы роста культуры последовательной плотности для инокуляции от стационарной фазы предварительной культуры.

  1. Подготовьте стационарной фазы предварительной культуры: выбрать одну колонию трансформированных клеток от пластины и прививку селективном жидком носителе (5 мл в 50-мл конической нижней трубки). Расти при 30 ° C при встряхивании со скоростью 225 оборотов в минуту, пока оптическая плотность культуры при 600 нм (OD 600) не достигало плато (24-48 ч).
  2. Подготовьте середине логарифмической фазы роста культуры для наблюдения: использовать соответствующий объем предварительной культуры для инокуляции 5 мл селективной среды в 50 мл коническую-дно трубки. YPD носитель аутофлуоресцентной и не должны использоваться для этих исследований. Использование синтетических полной, глюкоза основаны, падением напряжения (SC-УПА) средства массовой информации. Рост клеток при 30 ° С, встряхивая при 225 оборотах в минуту, в течение 4-16 ч, пока они не достигают середины логарифмической фазы роста (~ 0,5 - 1 × 10 7 клеток / мл). Плотность клеток может быть определенапутем измерения OD 600; откалибровать спектрофотометр для определения правильного OD 600 считывания. На нашем Beckman DU530 (Beckman Coulter, Indianapolis, IN), в середине логарифмической фазы соответствует OD 600 0,1-0,3.

Mito-roGFP1 чувств колебания в органеллы в ответ на метаболические изменения. Например, в данном анализе митохондриальных окислительно-восстановительные изменения состояния, когда дрожжи растут на брожению источники углерода (например, глюкоза, как и в средах SC) по сравнению с несбраживаемые источники углерода (например, глицерин, как и в SGlyc среды), и даже в разные партии одного и того же средств массовой информации. Таким образом, использование той же партии СМИ для всех экспериментов.

  1. Клетки готовы к концентрации (см. шаг 2.4) и изображения, если лечение не может быть исполнено. Если клетки лечат, инкубировать клетки с соответствующей обработки и перехода к следующему шагу.
  2. Концентрат 1 мл культуры путем центрифугировани при 6000 х г в течение 15 сек иресуспендирования осадка клеток в 20 мкл среды. Эти условия максимизировать число различаемых сот в поле зрения.
  3. Нанести 2 мкл ресуспендировали клетки слайдов. Покрытие с покровным (№ 1,5, предпочтительно высокопроизводительной 170 ± 5 мкм толщиной) и герметизации краев покровного стекла с прозрачным лаком для ногтей или valap (см. реагенты). Чтобы скрепить с valap, расплав небольшое количество на металлического шпателя, держа его над пламенем горелки Бунзена, то распространение небольшое количество по краям покровного стекла.
  4. Поддержание клетки при 30 ° С в течение изображений. Цель нагревателя на 100x иммерсионной линзы масло, используемое для работы с изображениями хорошо работает для этого приложения. В этих условиях, морфологии митохондрий, окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ остаются неизменными во время съемки в течение 10-15 мин.

3. Настройка изображения

  1. Настройка для работы с изображениями Mito-roGFP1 на широком поле флуоресцентного микроскопа
    Шаги здесь приспособлены к AxioObserver.Z1 микроскоп с возбуждением Colibri светодиодных источников, широким полем Orca ER камеру и AxioVision приобретение программного обеспечения. Фотообесцвечивание обоих каналов и фотопреобразование окисленных Mito-roGFP1 значительно сокращается с использованием светодиодной подсветки по сравнению с ртутной лампой освещения (см. ниже).
    Для максимального сигнала и разрешение, использовать самую высокую числовую апертуру возможно в объективном, а самое низкое увеличение которое обеспечивает достаточное пространственное разрешение. Кроме того, для Mito-roGFP изображений, убедитесь, что цель передает также при 365 нм. 100x/1.3NA EC PlanNeofluar цели (Zeiss) работает хорошо для этого приложения.
    Формирование захвата программное обеспечение для захвата окисленных и восстановленных Mito-roGFP1 видов. Мы используем следующие условия.
    1. Настройка канала для окисленных Mito-roGFP использовать возбуждение при 365 нм (100% силы СИД) и выбросов фильтр, пригодный для GFP, таких, как 38 HE Набор фильтров (Zeiss), с включенным возбуждениян фильтр удаляется из куба. Снятие возбуждения фильтр позволяет возбуждения на обоих 365 нм и 470 нм, без необходимости переключения фильтра, тем самым увеличивая достижимое разрешение времени.
    2. Настройка канала для снижения митохондрий roGFP использовать возбуждение при 470 нм (100% индикатор мощности) и, как упоминалось выше, тот же фильтр твердых куб использоваться для окисленного митохондрий roGFP. Установите камеру 1x1 биннинге для оптимизации пространственного разрешения.
    3. Установить программное обеспечение для измерения AZ стек, состоящий из 11 кусочков 0,5 мкм с расстоянием, собирая обоих каналов в каждом положении Z. Этот способ приобретения медленнее, чем приобретение каждого стека г, в свою очередь, но он предотвращает артефакты, связанные с митохондриальной движение между приобретением окисленных и восстановленных каналов.
    4. Изображение нескольких ячеек для определения соответствующего времени экспозиции, производя сильное, но не насыщение сигнала. Важно поддерживать соотношение времени экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 для всех экспериментовс. Например, если время экспозиции для окисленной и восстановленной митохондрий roGFP1 в 300 и 100 мс соответственно, то время экспозиции для окисленных митохондрий roGFP1 должна быть в 3 раза, что для уменьшен митохондрий roGFP для всех экспериментах.
  2. Настройка для работы с изображениями mitGO-ATeam2 от спектрального конфокальной микроскопии
    Для количественной оценки уровня АТФ использованием mitGO-ATeam2, флуоресценция GFP (максимум излучения 510 нм) следует отличать от, что из р (максимум излучения 560 нм). Есть флуоресценции наборы фильтров, которые разрешают флуоресценции от этих флуорофорам. Однако мы считаем, что спектральный детектор, доступный на многих лазерной сканирующей конфокальной микроскопы, лучше всего подходит для этого приложения. Спектрального детектора отделяет флуоресцентного излучения на множество компонентов (как правило, 32 или более) в зависимости от длины волны. Несколько соседних полосах длин волн могут быть объединены в один канал изображения. Длины волн должны быть объединены выбираются эмпирически так, чтобы максимизировать сигнала от GFP и ОФП, избегая при этом кроссовер сигнал, что бы посрамить FRET измерения. Используйте высокие числовые апертуры линзы доступны. Мы используем 100x/1.49 или 60x/1.49 Apo-TIRF линзы. Мы используем Nikon A1R конфокальной микроскопии NIS работает Элементы программного обеспечения. Формирование захвата программное обеспечение для захвата АТФ-связанного и несвязанного ATP-mitGO-ATeam2 видов. Мы используем следующие условия.
    1. Установить обскуры до 1,0 единиц Эйри (АС), который в нашей системе соответствует AZ разрешение около 0,42 мкм.
    2. Установить сканирования зум образом приблизиться к пределу Найквиста, которая будет максимально пространственной информации в изображении. В нашей системе размер пикселя 0,12 мкм.
    3. Поскольку митохондрии могут двигаться во время съемки, это может быть полезно для увеличения скорости визуализации, обрезка полей до 512 х 256 пикселей. Общее время, необходимое для изображения одного кадра в системе составляет 1,0 сек, в том числе два раза сканирования среднего. В зависимости от желаемого пространственное разрешение, поле может быть обрезано по дальнейшему увеличениемэлектронной временным разрешением.
    4. Excite при 488 нм, и собирать излучение от 500 - 520 нм для GFP, и от 550 - 580 нм для ОФП. Фактическое оптимальные значения могут изменяться в зависимости от характеристик системы формирования изображения.
    5. Оптимальной мощности лазера для нашей системы от 6,0 до 6,4%. Оптимальная мощность лазера будет разным для каждого микроскопа системы, но в идеале быть как можно ниже, в то время как до сих пор производит интерпретируемые изображения. Используйте внутренний или внешний измеритель мощности для мониторинга изменений в мощности лазера, которые происходят обычно в течение долгого времени в любой оптической системы.
    6. Регулировка усиления детектора и интенсивности освещающего света максимально обнаружен диапазон значений пикселей, но избежать насыщения сигнала, на столько ячеек, сколько возможно. Не анализируйте любые клетки, содержащие более 1% насыщенных пикселей. Изображение всех образцов с использованием той же цели, мощность лазера, сканирование зумом, размер пикселя, усиления и смещения.

4. Image Acquisition

  1. Найдите Фокусное пла дной из интересующих клеток с использованием проходящего света для минимизации отбеливания флуоресцентного зонда.
  2. После обнаружения одного или более интересующих клеток, собирают г серии по всей глубине средней клетки (около 7 мкм), используя размер шага 0,5 мкм.
  3. Изображение другие интересующие клетки на слайде, но не изображение одного слайда дольше 15 мин. Через 15 минут на слайде, клетки теряют жизнеспособность.

5. Анализ

Митохондриальной АТФ определяется путем измерения отношения mitGO-ATeam2 излучение при 560 нм к поглощению при 510 нм +27 окислительно-восстановительное состояние органеллы определяется как сводится к окислению (R / O) Отношение митохондрий roGFP;. Т.е. излучения на длине волны 510 нм при возбуждении на 470 нм деленное на излучение на длине волны 510 нм при возбуждении при 365 нм. Перед расчетом отношения, вычесть фона и определения порогового значения для пикселов, принадлежащих флуоресцентный митохондрий.

палатка "> открытом доступе (например ImageJ 30) или коммерчески доступными (например Volocity, Perkin-Elmer) программное обеспечение может быть использовано для анализа Mito-roGFP1 или mitGO-ATeam2. В зависимости от используемого программного обеспечения для получения изображений и анализа изображений может сначала должны быть преобразованы в другие форматы, такие как TIFF, до их открытия в анализе программного обеспечения. Если изображения преобразуются, важно, чтобы убедиться, что значения пикселей не изменяются во время преобразования. Анализ Mito-roGFP1 данных, используя обе программы описан ниже. Программы меню и опций, чтобы выбрать в каждом меню выделены жирным курсивом.

5.1 Анализ ImageJ

  1. Открытие изображений и изменения типа до 32 бит: Тип изображения → → 32 бит.
  2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Рассчитать среднюю интенсивность в этой ROI: Анализ → Измерить.
  3. Вычтите расчетным средним фоном из стека: Процесс → Математика → вычитать.
  4. Использование вычитается обеспечение Z-Stack, найти середину кусочек и на порог митохондрий: Изображение → Настройка → Порог и нажмите кнопку Применить на пороге окна. Применить ко всем ломтиков в стеке. Проверьте установить фоновую пикселей NaN.
  5. Создать соотношение Z стека: Процесс → Image Calculator Разделите пониженной стек окисленные Z стек для Mito-roGFP1 анализа. Разделите 560 нм (АТФ связанной) изображение, 510 нм (АТФ несвязанного) изображение для mitGO ATeam2-анализа.
  6. Нарисуйте ROI вокруг области интереса. Выберите Анализ → Инструменты → ROI менеджер, и нажмите кнопку Добавить, чтобы записать ROI. Несколько регионов могут быть сохранены в менеджере. В диспетчере ROI, выберите все трансформирования, затем выберите Mруды → Multi-измерения для измерения всех стек ломтиками. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

5.2 Анализ Volocity

  1. Импортировать изображения в Volocity библиотеки и создать последовательность изображений с 2 ​​каналами.
  2. Нарисуйте области интереса (ROI) в районе, где нет клеток. Выберите: Инструменты → Ratio.
  3. Используйте Volocity для расчета фона: Получить Рой.
  4. Регулировка порога включить митохондриальных структур.
  5. Проверьте возможность применить LUT радуги отношению канала. Интенсивность модулированных каналов может привести к менее шумные изображения для презентации ции, но оно не должно использоваться для количественного определения среднего отношения.
  6. Выберите вкладку измерений, выбрать формат канала и привлечь ROI вокруг области интереса. Измерение отношения канала, за исключением нулевых значений. Множественные участки могут быть выбраны и измереныв то же время. Экспорт данных в электронную таблицу для анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Измерение митохондриальных окислительно-восстановительного состояния митохондрий-roGFP

Здесь мы показываем, что Мито-roGFP1 имеет динамический диапазон для обнаружения изменений в митохондриальных окислительно-восстановительное состояние от полностью окисляется до уменьшена в живых дрожжевых клеток, не влияя на рост дрожжей клетки или морфологии митохондрий. Сначала мы находим митохондрии клеток, экспрессирующих GFP-целевых и roGFP1 расти по обычным ставкам (рис. 1А). Максималь...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем методы использовать Mito-roGFP1 и mitGO-ATeam2 в качестве биосенсоров для оценки митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и уровня АТФ в живых клетках дрожжей. Мы считаем, что выражение плазмидой Mito-roGFP1 или mitGO-Ateam результатов в количественном ориентации на митохондрии, без очевидного эффекта на морфологии митохондрий или распространения на сотовые темпы роста. 3-Mito roGFP1 может обнаружить изменения в митохондриальных окислительно-восстановительного состояния от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Эта работа была поддержана награды от HHMI 56006760 в JDV, Национального института здоровья (NIH) (2 TL1 RR 24158-6), чтобы DMAW, а с Эллисон Медицинский фонд (AG-SS-2465) и NIH (GM45735, GM45735S1 и GM096445) в LP. GM45735S1 была выдана из NIH в оздоровлении американской экономики и реинвестировании 2009 года. Микроскопы используются для этих исследований были частично поддержана через NIH / NCI грант (5 P30 CA13696).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
 Reagents
Antimycin ASigma-Aldrich (St. Louis, MO)1397-94-0Растворен в этаноле до исходного раствора 2 мг/мл.
Дрожжевая среда для выращивания SGlyc (на основе синтетического глицерина) *Пропустите SGlyc-Ura
**Опустите Растворите SGlyc-Leu		в H2O. Отрегулируйте pH до 5,5 с NaHCO3. Autoclave.

Состав:
0,67% Дрожжевая азотная основа без аминокислот
3% Глицерин
0,05% Глюкоза
2 мг/мл аденин
2 мг/мл урацил*
1 мг/мл L-аргинин
1 мг/мл L-гистидин
1 мг/мл L-лейцин**
3 мг/мл L-лизин
2 мг/мл L-метионин
4 мг/мл L-фенилаланин
2 мг/мл L-триптофан
3 мг/мл L-тирозин
SC (синтетический полный, на основе глюкозы) дрожжевая среда для выращивания *пропустить SGlyc-Ura
**пропустить SGlyc-Leu		Растворить в H2O. Отрегулируйте pH до 5,5 с помощью NaHCO3. Автоклав. Состав:
0,67% Дрожжевая азотная основа без аминокислот
3% глюкоза
2 мг/мл аденин
2 мг/мл урацил*
1 мг/мл L-аргинин
1 мг/мл L-гистидин
1 мг/мл L-лейцин**
3 мг/мл L-лизин
2 мг/мл L-метионин
4 мг/мл L-фенилаланин
2 мг/мл L-триптофан
3 мг/мл L-тирозин
ValapОбъедините ингредиенты в соотношении 1:1:1 (вес:масса). Расплавить путем погружения в 70 градусов; C H2O ванна. Разложите по стеклянным чашкам Петри. Хранить при комнатной температуре. Ингредиенты:
вазелиновый вазелин, твердый парафин, ланолин
 Equipment and SoftwareПредварительно
очищенная золотая печать Rite-on Micro SlidesThomas Scientific (Swedesboro, NJ)3050Размер: 25 x 75 мм; Толщина: от 0,93 до 1,05 мм
Высокоэффективные покровные стекла, No 1,5, 18x18 ммZeiss (Thornwood, NY)474030-9000-000Они менее вариативны по толщине (170&mn; 5 μ m) чем стандартные покровные стекла, уменьшающие сферическую аберрацию и улучшающие характеристики 3D-визуализации
Защитное стекло микроскопа Fisherbrand, No 1,5Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания)12-545EРазмер: 22 x 22 мм, толщина No 1,5 (170 μ m)
Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп A1 со спектральным детектором и объективом 100x/1.49 NA Apo-TIRFNikon (Мелвилл, Нью-Йорк)
микроскоп AxioObserver.Z1, оснащенный объективом 100x/1.3NA EC Plan-Neofluar (Zeiss) и охлаждаемой ПЗС-камерой Orca ER (Hamamatsu) и управляемый программным обеспечением AxiovisionZeiss (Торнвуд, штат Нью-Йорк); Хамамацу (город Хамамацу, Япония) 
Программное обеспечение для анализа 3D-изображений VolocityPerkin Elmer (Waltham, MA)Реставрационный модуль для деконволюции; Модуль количественной оценки для расчета и измерения соотношения
Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохранения (Бетесда, Мэриленд)http://rsb.info.nih.gov/ij/

Ссылки

  1. Rizzuto, R., De Stefani, D., Raffaello, A., Mammucari, C. Mitochondria as sensors and regulators of calcium signalling. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 13 (9), 566-578 (2012).
  2. Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
  3. McFaline-Figueroa, J. R., Vevea, J., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  4. Hamilton, M. L., Van Remmen, H., et al. Does oxidative damage to DNA increase with age. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10469-10474 (2001).
  5. Cadenas, E., Davies, K. J. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress, and aging. Free Radical Biology & Medicine. 29 (3-4), 222(2000).
  6. Mammucari, C., Rizzuto, R. Signaling pathways in mitochondrial dysfunction and aging. Mechanisms of Ageing and Development. 131 (7-8), 536-543 (2010).
  7. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  8. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  9. Taylor, E. R., Hurrell, F., Shannon, R. J., Lin, T. -K., Hirst, J., Murphy, M. P. Reversible glutathionylation of complex I increases mitochondrial superoxide formation. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 19603-19610 (2003).
  10. Beer, S. M., Taylor, E. R., et al. Glutaredoxin 2 catalyzes the reversible oxidation and glutathionylation of mitochondrial membrane thiol proteins: implications for mitochondrial redox regulation and antioxidant defense. The Journal of Biological Chemistry. 279 (46), 47939-47951 (2004).
  11. Tretter, L., Adam-Vizi, V. Inhibition of Krebs cycle enzymes by hydrogen peroxide: A key role of [alpha]-ketoglutarate dehydrogenase in limiting NADH production under oxidative stress. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (24), 8972-899 (2000).
  12. Nulton-Persson, A. C., Szweda, L. I. Modulation of mitochondrial function by hydrogen peroxide. The Journal of Biological Chemistry. 276 (26), 23357-23361 (2001).
  13. Gardner, P. R., Fridovich, I. Effect of glutathione on aconitase in Escherichia coli. Archives of Biochemistry and Biophysics. 301 (1), 98-102 (1993).
  14. Gardner, P. R., Raineri, I., Epstein, L. B., White, C. W. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 270 (22), 13399-13405 (1995).
  15. Schafer, F., Buettner, G. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple. Free Radical Biology and Medicine. 30 (11), 1191-1212 (2001).
  16. Maechler, P., Wang, H., Wolheim, C. B. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett. 422, 328-332 (1998).
  17. Ouhabi, R., Boue-Grabot, M., Mazat, J. P. Mitochondrial ATP synthesis in permeabilized cells: Assessment of the ATP/O values in situ. Anal. Biochem. 263, 169-175 (1998).
  18. Strehler, B. L., Totter, J. R. Firefly luminescence in the study of energy transfer mechanism in substrates and enzymes determinations. Arch. Biochem. Biophys. 40, 28-41 (1952).
  19. Lemasters, J. J., Backenbrock, C. R. Adenosine triphosphate: Continuous measurement in mitochondrial suspension by firefly luciferase luminescence. Biochem. Biophys. Res. Commun. 55, 1262-1270 (1973).
  20. Wibom, R., Lundin, A., Hultman, E. A sensitive method for measuring ATP formation in rat muscle mitochondria. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 50, 143-152 (1990).
  21. Manfredi, G., Spinazzola, A., Checcarelli, N., Naini, A. Assay of Mitochondrial ATP Synthesis in Animal Cells. Methods in Cell Biology, Mitochondria. Pon, L. A., Schon, E. A. 65, Academic Press. New York. 133-145 (2001).
  22. DeLuca, M. Firefly luciferase. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. 44, 37-68 (1976).
  23. Atamna, H., Frey, W. H. Mechanisms of mitochondrial dysfunction and energy deficiency in Alzheimer's disease. Mitochondrion. 7, 297-310 (2007).
  24. Hanson, G. T., Aggeler, R., et al. Investigating mitochondrial redox potential with redox-sensitive green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
  25. Dooley, C. T., Dore, T. M., Hanson, G. T., Jackson, W. C., Remington, S. J., Tsien, R. Y. Imaging dynamic redox changes in mammalian cells with green fluorescent protein indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
  26. Schwarzländer, M., Fricker, M. D., et al. Confocal imaging of glutathione redox potential in living plant cells. Journal of Microscopy. 231 (2), 299-316 (2008).
  27. Nakano, M., Imamura, H., Nagai, T., Noji, H. Ca2+ regulation of mitochondrial ATP synthesis visualized at the single cell level. ACS Chem Biol. 6 (7), 709-715 (2011).
  28. Berg, J., Hung, Y. P., Yellen, G. A genetically encoded fluorescent reporter of ATP:ADP Ratio. Nature Methods. 6 (2), 161-166 (2009).
  29. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  30. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
  31. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science (New York, N.Y.). 297 (5588), 1873-1877 (2002).
  32. Dairaku, N., Kato, K., et al. Oligomycin and antimycin A prevent nitric oxide-induced apoptosis by blocking cytochrome c leakage. J. Lab. Clin. Med. 143 (3), 141-153 (2004).
  33. Cannon, M. B., Remington, S. J. Re-engineering redox-sensitive green fluorescent protein for improved response rate. Protein Sci. , 45-57 (2006).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Биосенсоры АТФмитохондриальный roGFPFRET-зонд на АТФмитохондрии дрожжейфлуоресцентная микроскопияанализ изображенийпротокол пороговой обработкисубклеточное разрешение
Логометрический биосенсоры, которые измеряют митохондриальных окислительно-восстановительного состояния и АТФ в живых клетках дрожжей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.