Методическая статья

Метод для культивирования эмбриональных С. Элеганс Клетки

DOI:

10.3791/50649

⸱

21 сентября 2013 г.

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем здесь пересмотренный протокол для крупномасштабного культуры эмбриональных С. Элеганс клетки. Эмбриональные С. Элеганс клетки, культивируемые в лабораторных, используя этот метод, по-видимому, дифференцировать и резюмировать экспрессию генов в определенном порядке клеток. Методы, которые требуют прямого доступа к клеткам или изоляцию специфические типы клеток из других тканей можно применять на С. Элеганс культивируемых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С. Элеганс является мощным модель системы, в которой генетические и молекулярные методы легко применимы. До недавнего времени не менее, методы, которые требуют прямой доступ к клеткам и выделения специфических типов клеток, не могли быть применены в C. Элеганс. Это ограничение было связано с тем, что ткани заключены внутри герметичной кутикулы, которое не легко переваривается обработкой ферментами и / или моющих средств. Основываясь на ранней пионерской работе по Laird Блум, Кристенсен и его коллеги 1 разработали надежный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в больших масштабах. Яйца изолированы от беременных взрослых путем обработки отбеливающей / NaOH и затем обрабатывали хитиназы, чтобы удалить скорлупы. Эмбриональные клетки затем диссоциирует с помощью ручного пипетки и помещают на подложки, покрытые стеклом в сыворотке крови, обогащенной средах. В 24 часов в одиночных камерах начинают дифференцироваться путем изменения морфологии и, выражая определенную Marke клетокRS. C. Элеганс-клетки, культивируемые с помощью этого метода выживать в течение 2 недель в пробирке и были использованы для электрофизиологических, иммунохимическими и визуализации анализа, а также они были отсортированы и используется для микрочипов профилирования.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis Элеганс (C. Элеганс) является мощным модельным организмом для изучения молекулярных основ клеточной функции, дифференциации и поведения. В то время как его геном, метаболические и биосинтеза похожи на позвоночных », его генетических и молекулярных уступчивость гораздо больше 2. Среди его преимуществ являются его размер и простой анатомии, его быстрый цикл жизни (3 дней при 25 ° С), короткий срок службы (2 недели) и большое количество потомства (> 200). Благодаря своей гермафродитного природы и коротким жизненным циклом, молекулярные и генетические манипуляции просты в С. Элеганс, в том числе получения трансгенных животных 3,4 и применения генных методов бросовым таких как РНК-интерференция 5. С. Элеганс тело и яичной скорлупы прозрачны. Поэтому клетки могут быть легко визуализированы как в взрослых и эмбриона с помощью стандартного микроскопии. В последние 40 лет, С. Элеганс сообщество создало бесценные ресурсы для C. Исследование Элеганс в том числе большой коллекции мутантов, врезками и трансгенных, подробное описание анатомии и развития 6,7, в том числе полная реконструкция нервной системы 8, и полностью секвенированных генома, которая хорошо аннотированный и доступной для всего сообщества ( www.wormbase.com ).

Несмотря на многочисленные преимущества, некоторые экспериментальные подходы, создают большие сложности в С. Элеганс. К ним относятся те, которые требуют доступ к плазматической мембране клеток и тканей изоляции или типов клеток. Действительно C. Elegans ткани заключены внутри ее под давлением гидростатического скелета, которое не легко переваривается ферментативной обработкой или моющих средств. В конце 1990-х годов Мириам Гудман и Джанет Ричмонд впервые методы электрофизиологических записей С. Элеганснейроны и мышечные клетки в месте 9,10. Хотя эти методы дали нам важную информацию о нейронных и функции мышц в естественных условиях, они являются сложными и низкая пропускная. Альтернативные методы для изучения функции клеток в естественных условиях была разработана, в основном в частности, в естественных изображений кальция с использованием генетически закодированные датчики кальция, такие как GCamP и Cameleon 11-13. Эти методы не менее, не позволяют использование фармакологических средств, так как они применяются на интактных живых животных.

Первая попытка культивирования C. Элеганс клетки в пробирке в больших масштабах выступил Laird Блум в ходе подготовки своей диссертации 14. К сожалению, трудности, возникающие с плохой адгезии клеток к подложке, плохое дифференцировка клеток и выживание предотвратить создание этой ранней протокола как надежного метода культуры клеток. В 1995 году Эдгар и его коллеги опубликовали процедуруисследовать деление клеток и морфогенеза путем выделения и культуры одного C. Элеганс эмбрионов 15. Эмбриональные клетки, полученные путем гидролиза из яичной скорлупы с комбинацией ферментативной обработки и ручной диссоциации, продолжали размножаться, производя до ~ 500 клеток 15. Впоследствии Леунг и его коллеги культивировали небольшие количества бластомеров для изучения кишечной морфогенез. Они показали, что один в пробирке изолированные E бластомер производится поляризованные клетки кишечника, которые создали структуру, аналогичную просвет кишечника, взаимодействуя друг с другом через верхушечных слипчивых соединений 16. Бюхнер и его коллеги также сообщили подобный метод для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке 17.

Основываясь на этой ранней работы, Кристенсен и его коллеги разработали надежную протокол для культивирования эмбриональных C. Элеганс клетки в пробирке 1. Онипоказали, что изолированные C. Элеганс клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток и поддерживать функции, которыми они обладают в естественных условиях, в том числе экспрессию маркеров для соты. Некоторые методы, которые являются сложными в естественных условиях, могут быть применены на изолированных С. Элеганс эмбриональные клетки. К ним относятся электрофизиологические 1,18 19 изображений, и иммунохимических методов 20,21, а также изоляцию специфические типы клеток флуоресцентным-Активированный сортировки клеток (FACS) для строительства клеточных конкретных библиотек кДНК 22,23. Генные нокдаун методы, такие как РНК-интерференция (RNAi) может быть применен на культивируемой С. Элеганс клетки 1 и роман метаболический метод маркировки с помощью Азидо-сахар в качестве инструмента для открытия гликопротеина недавно был разработан для в пробирке культурного C. Элеганс клетки 24.

В заключение, метод культуры клеток расширяет массив Oе методы, которые могут быть применены к С. Элеганс модель в попытке расшифровать функции генов в контексте живой организм. Мы описываем здесь протокол для культивирования C. Элеганс эмбриональные клетки в пробирке, которая в значительной степени на основе протокола, впервые описанным Кристиансен и 1 коллегами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Звездочки (*) указывают новые или измененные меры по сравнению с Кристенсен и др.. 1

1. Настройка Материал

  1. Процедура культуры клеток требует большого количества яиц, изолированных от беременных взрослых. Расти C. Элеганс на 8P пластин агара высевают с na22 (доступно через C. Элеганс генной консорциума - CGC) бактерий, чтобы изолировать большое количество яиц. В этих плит количество пептона, используемой в 8 раз сумма, которая обычно используется для NGM пластин. Чем выше концентрация пептон более эффективно поддерживает рост na22 бактерий, которые в отличие от OP50-, растут в толстых слоях.

8P пластины рецепт:

Растворите 3 г NaCl, 20 г Бакто-пептона, 25 г агара в 1 л стерильной дистиллированной воды и автоклаве в течение 30 мин. Пусть Medium Cool при 55 ° С, а затем добавить стерильно фильтруют 1 мл холестерина (5 мг / мл в этаноле), 1 мл 1 MgCl 2, 1 мл MgSO 4 и 25 мл KP буфера (фондовой 500 мл: 5 г K 2 HPO 4, 30 г KH 2 PO 4, рН 6.00). Залейте жидкое агаровой среды на 10 см чашки Петри (25 мл / планшет).

  1. На следующий день распространилась всю поверхность каждого обогащенного пептонной агаром с 1 мл na22 Е. палочка культивировали в течение ночи в 2xYT СМИ (16 г триптон, экстракт 10 г дрожжей, 5 г NaCl в 1 л стерильной воды, рН 7,0) при 37 ° С Эти бактерии образуют обильный источник пищи, который сформирует толстый слой, поддерживающий рост больших количеств беременных взрослых. Оставьте семенами пластины ночи при комнатной температуре, чтобы позволить рост бактерий. Этот процесс может быть ускорен путем инкубации при 37 ° С в течение 4-5 часов.
  2. Трансфер голодали животных посеянных 8P пластин. Промыть животных покинуть голодал NGM пластины с использованием 5-6 мл буфера M9 или воды и добавляют 1-2 мл этой суспензии к каждому 8P пластины.
  3. Разрешить рост и размножение животных ЕНТIL планшеты заселен при слиянии на беременных взрослых.
  4. Изолировать яйца, необходимые для приготовления C. Элеганс эмбриональные клетки, от беременных взрослых, используя 5-6 мл лизирующего раствора.

Лизис решение рецепт

5 мл свежей Bleach, 1,25 мл 10 N NaOH и 18,5 мл стерильной H 2 O. Эта смесь должна быть подготовлена ​​свежий перед каждым использованием.

  1. Вымойте яйца, выделенные из беременных взрослых с использованием яиц буфер:

Яйцо буфер рецепт

118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 2 мМ MgCl 2, 25 мМ Hepes, рН 7,3, осмолярность 340 мОсм.

  1. Снимите яичную скорлупу, которая окружает яйца обработкой хитиназы. Хитиназа является ферментом, с высокой активностью в кислом рН 25. Растворить хитиназу (Sigma, каталожный номер. C6137) в яичном буфере с рН 6,5 до конечной концентрации 2 мг / мл. Храните хитиназы акциираствор при -20 ° С в 1 мл аликвоты в стерильные 15 мл конические пробирки. Аликвоты могут храниться при температуре -20 ° С до нескольких месяцев.
  2. Расти C. Элеганс культивируемые клетки на автоклавного покровные (диаметр 12 мм), покрытых с арахисовым лектина. Растворить арахисовое лектин в стерильной воде (0,5 мг / мл). Арахис решение лектин не следует фильтровать или в автоклаве. Кроме того, не нужно лечить с помощью УФ-света. Магазин 2 мл аликвоты при -20 ° С в течение до 6 месяцев.
  3. Полная среда клеточной культуры (500 мл) содержит 500 мл L-15 культуральную среду от Gibco, 50 мл фетальной бычьей сыворотки (инактивированной нагреванием), 7,7 г сахарозы (45 мОсм), 5 мл 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (2%). Полную среду затем фильтруют с помощью фильтра с порами 0,20 мкм.

Обратите внимание, что буфер яйцо и культурная среда имеют осмолярность 340 и 345 мОсм соответственно. В самом деле, в отличие от клеток млекопитающих, C. Elegans клетки имеют относительно высокую осмолярность, который должен быть принят во подсчета при приготовлении растворов, которые придут в непосредственный контакт с плазматической мембраной клеток. Рецепты этих реагентов были скорректированы, чтобы достичь желаемого осмолярность, которое было измерено с помощью осмометр 1. Не стоит использовать осмометр если эти рецепты следуют точно и ухода используется в подготовке этих реагентов. Однако следует использовать Osmoter если другие решения должны быть подготовлены, чьи рецепты не сообщается здесь или в любой из публикаций, использующих C. Элеганс культивируемых клеток.

2. Яйцо Изоляция

  1. Рекомендуется, чтобы начать с по крайней мере четыре 8P пластин для сбора достаточного количества яиц на 12 лунок культивируемых клетках (в 24-луночных планшетах).
  2. Перед началом процедуры таять один тюбик арахисовое лектин маточного раствора. Поместите автоклавного покровные в нижней части лунки в 24-луночный планшет и добавляют 200 мкл лектина арахиса к покровные. Инкубировать в течение 1 часа или Until клетки готовы к покрытием. Полностью удалить арахисовое лектин и промывают лунки один раз 1 мл стерильной автоклавного воды. Полное удаление арахиса лектина от покровных имеет важное значение для предотвращения слипания клеток.
  3. Вымойте беременной взрослых от агара с использованием стерильного автоклавного воды. Сбор суспензии в два стерильных конической трубе 50 мл. Оставьте пробирки во льду в течение вплоть до 5 мин, чтобы позволить осаждение червей в нижней части трубок (*). Удалить воду с передачи пластиковой пипетки и заменить его свежим стерильным автоклавного воды. Гранул червей на настольной центрифугирования при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин (*). Повторите этот последний шаг, по крайней мере 3.
  4. Передача червей в стерильный 15 мл коническую пробирку и гранул их при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин (*). Не следует использовать более высокую скорость центрифугирования, чтобы избежать сбора бактерий в нижней части трубки, а также. Иногда после центрифугирования черви не полностью осаждали. Мтер друг вымыть и перед удалением супернатанта, поместить пробирки в течение 5 мин на льду. В охлажденной воды червей осадок на дне пробирки.
  5. Удалить воду и добавить 5-6 мл лизирующего раствора (см. Материал создан). Rock подвеску на медленном огне 5-10 минут, а затем приступить к мониторингу червя лизис под стереомикроскопа через каждые 2-3 мин. Каплю суспензии могут быть также размещены на покровное для облегчения контроля. Инкубационный период варьируется в зависимости от свежести отбеливателя; купить маленькие бутылки отбеливателя и открыть новую бутылку каждый месяц.
  6. При ~ 70-80% червей лизируют (10 мин от начала инкубации), остановить реакцию лизиса, добавив 9 мл яичного буфера рН 7,3 (см. Материал создан). Центрифугируют суспензию с 200 мкг (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин. С этого момента есть горелку на, на скамейке, чтобы предотвратить повторное загрязнение яиц (*).
  7. Осторожно удалите супернатант, используя стерильный пластиковый пипетки передачи и мыть гранул 3-4х с яйцом буфера, пока раствор не станет прозрачным. Убедитесь в том, чтобы смешать гранулы хорошо в буфере яйца во время каждого мытья.
  8. Яйца отделены от туш животных с использованием 30% раствора сахарозы. Ресуспендируют гранул в 2 мл стерильной буфера яйцо и добавить 2 мл 60% раствора сахарозы (фондовый в стерильной буфера яиц). Хорошо перемешайте и центрифуги в течение 20 мин при 200g (~ 1200 оборотов в минуту) (*).
  9. Осторожно снимите трубки из центрифуги. Яйца с плавающей в верхней части раствора. Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники, передать все яйца в свежих стерильные 15 мл коническую трубку.
  10. Добавьте 10 мл стерильного буфера яиц в пробирку и центрифугируют при 200 х г (~ 1200 оборотов в минуту) в течение 10 мин. Повторите промыть 3 раза. Убедитесь в том, что яйца полностью ресуспендировали в буфере яйца во время каждого мытья.

3. Эмбриональные клетки диссоциация

Провести следующие этапы процедуры в стерильных условиях с использованием ламинаре. В то время как животныеплатье на бактерии пластин, промываний и лечения с лизиса раствора, содержащего отбеливатель должны устранить большинство, если не все бактерии. Таким образом, используя ламинарный капот на данный момент процедуры предотвращает новую загрязнения яиц подвески.

  1. Ресуспендируют осаждали яйца в 1 мл 2 мг / мл хитиназы (складочном в яичном буфера рН 6,5 (*)) и передать их в новую стерильную 15 мл коническую трубку. Rock трубку в течение 10-30 мин при комнатной температуре. Точное время инкубации изменяется в зависимости от свежести фермента и температурой в помещении и, следовательно, должен быть определен для каждого препарата. Рекомендуется начать мониторинг яйца под перевернутой культивирования клеток микроскопом после 10 мин инкубации. Примечание: по нашему опыту, низкий рН увеличивает ферментативную активность хитиназы. По этой причине мы используем яйцо буфер при рН 6,5 распустить хитиназы (рецепт сообщалось выше, где рН доводят до 6,5 с помощью NaOH).
  2. При ~ 80% из яичной скорлупы перевариваютсялечение хитиназа (рис. 1 AB), осаждения яиц путем центрифугирования при 900 мкг в (~ 2500 оборотов в минуту) в течение 3 мин (*). Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники, удалить тщательно супернатант и добавить 3 мл L-15 среды (*).
  3. Передача яйца в диаметре пластины диаметром 6 см и осторожно отделить клетки с использованием 10 мл стерильного шприца, снабженного 18 G иглу. Монитор степень диссоциации, помещая каплю суспензии в свежем пластиковой чашке Петри и просмотра под микроскопом. Не аспирации воздуха в шприц во время этой процедуры, чтобы не повредить клетки. Продолжить диссоциацию до ~ 80% клеток не диссоциируют.
  4. Суспензию фильтруют с помощью стерильного 5 мкм Millipore фильтр. Клеточные суспензии должен быть отфильтрован, чтобы удалить клеточные скопления, непереваренные яйца и выведенных личинок. Фильтр дополнительные 4-5 мл свежих L-15 СМИ через фильтр, чтобы восстановить все клетки. Не прилагайте чрезмерных усилий во время стадии фильтрации, чтобы избежать DAmaging фильтр и / или клеток.

4. Культивирования клеток

  1. Гранул диссоциированных клеток путем центрифугирования при 900 мкг (~ 2500 оборотов в минуту) в течение 3 мин (*). Использование P1000 пипетки и стерильные наконечники тщательно удалить все супернатант. Ресуспендируют клетки осаждали в полной L-15 среды и пластины 1 мл / лунку. Количество добавленного среды зависит от количества используемого 8P пластин, слиянии червей на пластинах, и типа экспериментов, которые будут выполнены на клетках. Плотность клеток может быть определена с помощью гемоцитометра. Для патч-зажим записи обшивки плотность ~ 230000 клеток / см 2 является оптимальным.
  2. Держите пластину 24 скважин в пластиковом Tupperware контейнер, содержащий влажные бумажные полотенца, чтобы избежать испарения питательной среды. Хранить контейнер в увлажненном инкубаторе при 20 ° С и атмосферном воздухе.
  3. Клетки, как правило, готовы к экспериментам в пределах 24 часов, когда морфологическая дифференцировка и экспрессион GFP маркеров являются полными. Клетки могут быть в культуре в течение до 2 недель, но они, как правило, самый здоровый до 7-9 дней после посева. Среда должна быть заменена раз в день, чтобы поддерживать здоровые клетки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. Элеганс культивируемые клетки дифференцируются и экспресс клеток специфические маркеры

Кристенсен и его коллеги с помощью окрашивания трипановым синим показали, что> 99% эмбриональной С. Элеганс клетки выживают процедуру изоляции. На 9-й день и 22 после посева, 85% и 65%, соответственно все еще ​​живы 1. Изолированные эмбриональных С. Элеганс клетки должны придерживаться подложку, чтобы отличать. Клетки, которые не придерживаются образованию комков и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С. Элеганс является мощным модельным организмом для расшифровки генетических путей, участвующих в разработке, поведения и старения. Ее удобство происходит, главным образом от той легкости, с которой он может быть генетически манипулировать и от его короткого жизненного цикла. Несмотря на удобство, С. Элеганс имеет свои ограничения. C. Elegans клетки крошечные и заключены в герметичной кутикулы, что ограничивает применение методов, которые требуют прямого доступа к клеткам, таким как электрофиз...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Агар ГранулированныйVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Экстракт дрожжей BactoVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) ЖидкийInvitrogen11415-064
Фетальная бычья сывороткаInvitrogen16140-063
Пенициллин-стрептомицинSigmaP4333-100ML
Хитиназа из Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
СахарозаSigma57903-1KG
D-(+)ГлюкозаSigma67528-1KG
Этиленгликоль-бис (2-amin– thylether), N,N,N',N'- тетракислотная кислота (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
NaClSigma
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 G
K2HPO4P2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Этанол
автоклавный дистиллированный H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μ l Синие градуированные наконечники для пипетокСША Scentific1111-2821
10 мл Стерилизованная пипетка в индивидуальной упаковкеСША Аромат1071-0810
Эргономичный переменный объем (100-1000 μ м) Пипетка с эжектором наконечникаVWR International Inc.89079-974
Портативная пипетка, DrummondVWR International Inc.53498-103
Переводная пластиковая пипетка стерильнаяVWR International Inc.14670-114
Коническая трубка 15 мл США Scentific1475-1611
Коническая трубка 50 млСША Scentific1500-1811
Стерильные иглы 18 калибраBecton, Dickinson and Co.
Стерильные шприцы 10 млBecton, Dickinson and Co.
Пластиковые шприцевые фильтры Corning 0,20 μ m размер пор Corning431224
Acrodic 25 мм Шприцевой фильтр с 5 & мкм; m versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
Чашка Петри 60x15 мм стерильнаяVWR International Inc.82050-548
Чашка Петри 100x15 мм стерильнаяVWR International Inc.82050-912
Стеклянные покровные стекла диаметром 12 ммVWR International Inc.48300-560
Планшеты для культивирования прозрачных клеток 24 лунки с плоским дном и крышкой Thomas scientific6902A09
Dumont #5 - Тонкие щипцы Fine Science Tools11254-20
Центрифуга 5702Eppendorf022629883
Ламинарный колпак Инвертированный
микроскоп с объективом
с увлажненным наружным воздухом
Холестерин 57653-1KG MgCl Sigma 305196305482 x10Инкубатор

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

Похожие статьи