Методическая статья

Большеберцовой Перерезка Нерв - стандартную модель для доступа индуцированную денервацией атрофии скелетных мышц у мышей

DOI:

10.3791/50657

⸱

3 ноября 2013 г.

 , 
1Keenan Research Centre of the LiKaShing Knowledge Institute, St Michaels Hospital, 2Department of Surgery, McMaster University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большеберцовой модели перерезки нерва хорошо переносятся, проверены, и воспроизводимые модели атрофии скелетных мышц. Модель хирургического протокола описаны и продемонстрированы в C57Black6 мышей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большеберцового нерва модель пересечение является хорошо переносимым, проверять и воспроизводимые модели индуцированную путем денервации атрофию скелетных мышц у грызунов. Хотя первоначально разработан и широко используется в крысу из-за его больших размеров, большеберцового нерва у мышей достаточно большой, что его можно легко манипулировать с помощью либо раздавить или рассечение, оставив малоберцовой и икроножной нервные ветви седалищного нерва нетронутым и тем самым сохраняя их мышцы цель. Таким образом, эта модель предлагает преимущества индуцировать меньше заболеваемости и препятствием к передвижению чем седалищного нерва модель рассечения, а также позволяет исследователям изучать физиологические, клеточные и молекулярные биологические механизмы, регулирующие процесс атрофии мышц у генетически модифицированных мышей. Большеберцового нерва поставляет икроножной, камбаловидной мышцы и подошвенной мышцы, так что его пересечение позволяет исследовать денервированного скелетных мышц состоит из быстрые волокна типа волокон II и / или замедленного типа I подергиваниеволокон. Здесь мы показываем, большеберцовой модели перерезки нерва в C57Black6 мыши. Мы определяем атрофия икроножных мышцах, как представитель мышцы, через 1, 2 и 4 недели после денервации мышцы путем измерения веса и типа волокна конкретной площади поперечного сечения на парафин гистологические иммуноокрашиванию для быстрого миозина подергивания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Скелетные денервации мышцы, из-за травматического повреждения периферического нерва, болезнь или фармакологического вмешательства, приводит к немедленному потерю мышечной добровольный сократительной функции. Мышцы одновременно начинает атрофироваться и эта атрофия обратима, если своевременной, качественной реиннервация происходит 1,2. При отсутствии реиннервации, миофибрилл атрофии прогрессирует, и необратимые изменения биологических в мышце происходят с фиброз мышц и мышечных волокон смерти. Здесь мы показываем, большеберцовой модели перерезки нерва, модель денервацией индуцированной атрофии скелетных мышц и фиброза у мышей. Эта модель позволяет ученым изучать физиологические, клеточные и молекулярные биологические механизмы, лежащие в основе атрофии мышц в естественных условиях в икроножной и камбаловидной мышц. В то время как исторически использовались преимущественно в крысах, более поздние применение этой модели в нокаут и трансгенных линий мышей частности, позволяет исследователям оценить роль ихконкретный белок (белки), представляющие интерес в индукции, развитие и поддержание или, альтернативно, разрешение, атрофия мышц и фиброза в естественных условиях.

Большеберцовый нерв является смешанным моторно-сенсорной периферического нерва у грызунов задние конечности, и является одной из трех ветвей терминала седалищного нерва. Перерезка большеберцового нерва denervates икроножной, камбаловидной и подошвенной мышцы (и три маленьких глубоких мышц сгибателей стопы в том числе задней большеберцовой, длинного сгибателя пальцев и длинного сгибателя hallicus) и является хорошо стандартизацию и апробацию модели у крыс 3,4 . Икроножной и камбаловидной мышцы можно легко расчлененный на последовательные моменты времени после большеберцовой рассечения нерва, фиксировали и обрабатывали для оценки гистологии мышц и мышечных волокон морфометрии или быстро замораживали для извлечения мышц РНК и белка с целью изучения, например, клеточных сигнальных сетей регулирующих атрофию мышц. GAstrocnemius мышц является смешанным мышечного типа волокна (тип I и тип II, хотя преимущественно тип II) и камбаловидной мышце состоит из большую долю волокон типа I, тем самым обеспечивая быстрых и медленных мышечных за оценку 5,6. Большеберцовой модели перерезки нерва подходит для изучения процесса денервации атрофию мышц и в короткий срок (в днях) 7 и долгосрочные (от недель до месяцев) 4,8.

В отличие от модели седалищный нерв пересечение (вторая модель индуцированную путем денервации атрофию мышц, обычно используемые в грызунов), большеберцовой рассечения нерва вызывает меньше осложнений у животных, что делает его более привлекательным модели. Перерезка седалищного нерва denervates все мышцы ног (ниже колена) и ног, нарушая способность животного передвигаться на 2, тогда как перерезка большеберцового нерва оставляет малоберцовой и икроножной нервные ветви седалищного нерва нетронутым, что позволяет сохранитьих целевые мышцы и сенсорные территорий. Мыши не в состоянии подошвенной гибкого или инвертировать ногой, но способен передвигаться легко и веса несет одинаково с обеих задних конечностей, тем самым значительно уменьшая заболеваемость модели. Походка анализ исследований по оценке походки были выполнены у крыс после большеберцовой и седалищного нерва травм и продемонстрировать, что размеры и вес несущих лучше сохраняется с травмой голени 9,10. Кроме того, в большеберцовой модель рассечения нерва, малоберцовый нерв может быть мобилизован в более поздний момент времени и передается в качестве источника задержкой реиннервации, если исследование конструкция требует 3. В отличие от этого, задержка реиннервации в седалищный нерв модель пересечение требует использования нерва трансплантата на седалищный нерв дефицит, очень значительно увеличивает техническую сложность модели и ограничивает его использование для квалифицированных хирургов.

В то время как модель большеберцовой перерезки нерва Requires знакомство оператора стерильной оперативной техники в хирургии животных, как большеберцового нерва и икроножные мышцы Он иннервирует легко доступны и идентифицируемых для манипуляций, так что лица, не являющиеся хирургов или опытных животных с хирургией, может легко освоить эту модель .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Перед использованием этой модели, следователи должны были получать разрешение на хирургический протокол от использования животных их учреждение руководящего органа. Модель одобрена Научно-исследовательским этике совета, Hamilton Health Sciences Corporation, Университет МакМастер (АУП # 10-04-24) и осуществляется в строгом соответствии с рекомендациями канадского совета по уходу за животными.

1. Подготовка Мышь

  1. Взвесьте мыши. Анестезии с 5% изофлурана или 2% галотан. Цепь, используемую должны обеспечивать адекватную очистку анестезирующего средства для защиты хирурга. Через 2-3 мин дыхание животного будет медленным. Убедитесь рефлекс моргания отсутствует и щепотку межпальцевых промежутков в лапе, чтобы подтвердить хирургической анестезии (то есть никакой реакции со стороны мыши). Применение глазной смазки для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время операции.
  2. Бритье боковой бедра и ягодицы от седалищногоступень до колена и дезинфекции proviodine. Брить будет держать месте разреза волос свободно для обеспечения адекватного визуализации операционного поля и свести к минимуму вмешательство в рассечение нервов и рассечения. Седалищной вырезки, который превосходит и кзади от бедренной кости, могут быть идентифицированы путем пальпации.

2. Оперативного вмешательства

  1. Уменьшите ингаляционного изофлурана до 2% (галотан 1%) и наведите курсор на его стороне (стороне предназначен для хирургии вверх), в операционной или рассекает микроскопом. Альтернативно операция может быть выполнена с хирургической лупы с увеличением 3.5X является удовлетворительным для взрослого человека (20-25 г) мыши.
  2. Дон стерильные перчатки. Определить седалищной вырезки при пальпации. Используя скальпель, надрезать кожу боковой бедра от седалищной вырезки до колена (около 1 см).
  3. Аккуратно развести кожу. Определить двуглавой мышцы бедра, которая является плоской поверхностные мышцы бедра боковойнепосредственно под кожей. Использование тонких ножниц, разделите двуглавой мышцы бедра вдоль мышечных волокон и удерживать открытые с пружиной втягивающего подвергайте седалищного нерва и его филиалов.
  4. Определить седалищного нерва немедленно глубоко к двуглавой мышцы бедра. Это может быть идентифицирован по его характерной блестящий белый цвет и приблизительно 0,8 мм в диаметре. Она идет от седалищной вырезки до колена, разветвления на большеберцовой кости, малоберцовая и икроножных нервов на уровне подколенной ямки.
  5. Аккуратно отделить от большеберцовой и малоберцовой икроножных нервные ветви с сверхвысокой щипцов и весной microdissecting ножницами. Большеберцовый нерв является крупнейшим отрасли и, как правило, центральным. Важно, чтобы не раздавить нерва при отделении ветвей. Холдинг нерва только на внешнем слое adventicial с ультрадисперсных щипцами, и держать нервы слабину (не учили), позволит избежать давки нерва и тяги травмы.
  6. Для полного и прочного denervatiна, вырезать большеберцового нерва с microdissecting ножницами дистально это возможно, тщательно избегая подколенных сосудов. Кроме того, для временной денервации с ожидаемым полным реиннервация в течение 2-4 недель, большеберцовый нерв может быть просто раздавлен с сверхвысокой щипцами в течение 15 секунд, а не перерезанным. (Периферические нервы восстанавливаются после травмы и будет reinnervate целевой мышцы.)
  7. При полной денервации требуется, шов конца пересеченного большеберцового нерва на передней поверхности двуглавой мышцы бедра с 10-0 нейлона и повторно приблизительный двуглавой мышцы бедра с 5-0 Vicryl для предотвращения аберрантной повторного иннервации икроножной и камбаловидной мышц.
  8. Закройте кожи с работающим 5-0 Vicryl шва.

3. Послеоперационный уход

  1. Выключите ингаляционного анестетика, но поддерживать поток кислорода. Администрирование buprinorphine (или заменить) обезболивающее подкожно.
  2. Перенесите мышью на чистую клетку с неПостельные принадлежности в то время пробуждения от наркоза. Держите на одеяло потепление в пределах клетки и под непосредственным наблюдением, пока не ambulating.
  3. Передача и дома в мягкой нижней клетке (не проволока) с достаточно мягкой подстилкой.
  4. Проверьте оперативного конечности в день в течение состояния операционной раны и нога для развития пролежней каблук или доказательства жевания. Незначительные проблемы можно управлять с помощью местных антибиотиков или антисептиков, таких как proviodine. Endpoint показатели требуют эвтаназии животных потеря веса, что свидетельствует о плохом уходе самостоятельно (взъерошенные меха), и сгорбленная осанка. Кроме того, животные с серьезного нарушения раны или язвы, которые не заживают в течение 1-2 недель с актуальными антибиотиками или, кажется, есть боль должна быть принесена в жертву.

4. Денервированных икроножной и камбаловидной мышц Harvest

  1. В послеоперационный желаемый момент времени, весят мыши и жертвы с CO 2 передозировки.
  2. Бритье медиальной иоперативное и противоположной ноги управления и чистый с алкоголем. Наведите в операционной или рассекает микроскоп, или в качестве альтернативы использовать хирургические лупы просмотра для увеличения.
  3. По оперативным конечности, надрезать медиальной телячьей кожи с помощью скальпеля от лодыжки до колена и по окружности вокруг лодыжки. Осторожно потяните кожу щипцами от мышц и проксимально к бедру. Это подвергает все мышцы ног. Определить икроножной мышцы, которая является икроножную мышцу, которая идет от колена до лодыжки на задней поверхности ноги и находится непосредственно под кожей. Определить дистальных вставки двуглавой мышцы бедра, проксимального к икроножной мышцы на внутренней стороне колена. На своей дистальной вставки двуглавой мышцы бедра появляется тонкий и покрытый пленкой и перекрывает наиболее проксимальную часть икроножной. С помощью ножниц и тупым концом, аккуратно отделить дистальный вставки двуглавой мышцы бедра из газовойtrocnemius мышцы.
  4. На своей дистальной вставки в пяточной, сужается икроножной мышцы в ахиллово сухожилие. Определить ахиллово сухожилие, которое появляется белая и жилистые. Держите ахиллова сухожилия пинцетом, стараясь не держать или раздавить икроножной мышцы, и разделить ахиллова сухожилия с пяточной костью вставки с помощью ножниц.
  5. Все еще держа сухожилия, осторожно поднимите икроножной мышцы (бледно-красный) с глубокой камбаловидной (глубокий красный), из дистального вставки к его происхождению в колене (камбаловидной могут быть собраны отдельно).
  6. Рассеките икроножной от ноги путем деления происхождение от икроножной медиальной и латеральной chondyles бедренной кости с помощью ножниц. Очень нежный тяги на мышцы облегчает этот процесс. Будьте осторожны, чтобы не раздавить мышцы.
  7. Камбаловидной теперь будет четко видимым, сразу под местом икроножной. Поднимите камбаловидную от своей вставки на ахиллово сухожилие или егоИгин на задней теленка. Если камбаловидную непреднамеренно поднял с икроножной, осторожно отделить его от собранного образца. Икроножной (светло-красный) и камбаловидной (темно-красный) остаются просто идентифицировать в собранных образца из-за их разницы в цвета.
  8. Взвесьте мышцы отдельно на точность масштаба.
  9. Разделение мышцы вертикально, половина для оснастки замораживание в жидком азоте (для последующего белка и / или экстракции РНК), а половина для гистологического исследования (т.е. морфометрического оценки, иммуногистология) фиксации либо в 10% формалине, или замороженные фиксации в изопентан, охлаждаемую жидким азотом , по желанию.
  10. Повторите процедуру с шага 4.3 выше на контроль, неоперированного, боковые собрать управления икроножной и камбаловидной мышц.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большеберцовой перерезки нерва denervates икроножной, камбаловидной и подошвенной мышцы голени. Здесь мы оцениваем развитие атрофии в икроножной мышце, в качестве представителя мышцы. Икроножной мышцы собирают от 2-3 месяцев C57Black 6 мышей (Jackson Laboratories) денервированной в течение 1, 2 или 4 недели. Мышцы веса постепенно уменьшаться (рис. 1), так же как и площадь поперечного сечения типа II быстро мышечных волокон (рис. 2), с течением времени. Икроножной мышцы смешанного ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большеберцовой модели перерезки нерва денервацией индуцированной атрофии скелетных мышц является обычно используемым и хорошо проверенных модели у крыс. Мы адаптировали эту модель для использования в мышах, что позволяет следователю, чтобы воспользоваться наличием генетически модифицированных мышей и изучить процесс атрофии мышц в естественных условиях в отсутствие белков решающее значение для регуляции мышечной массы 7,8. Икроножной и камбаловидной мышцы, и денервированны в этой модели могут быть ле...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нет конфликта интересов не были объявлены.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами от CIHR исследований нервно-мышечной партнерства (JNM - 90959, для JAEB).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Реагенты и материалы
10-0 Нейлоновый шовный материалEthicon2850G
5-0 Викриловый шовный материалEthiconJ553G
Equipment
Пружинные микрорассекающие ножницыТонкие хирургические инструменты15021-15
Ультратонкие щипцыFine Surgical Инструменты11370-40
Неблокирующийся микроиглодержатель (драйвер)Тонкие хирургические инструменты12076-12
Пружинный ретракторТонкие хирургические инструменты17000-02

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fu, S. Y., Gordon, T. Contributing factors to poor functional recovery after delayed nerve repair: prolonged denervation. J. Neurosci. 15, 3886-3895 (1995).
  2. Kobayashi, J., Mackinnon, S. E., Watanabe, O., Ball, D. J., Gu, X. M., Hunter, D. A., Kuzon, W. M. The effect of duration of muscle denervation on functional recovery in the rat model. Muscle Nerve. 20, 858-866 (1997).
  3. Bain, J. R., Veltri, K. L., Chamberlain, D., Fahnestock, M. Improved functional recovery of denervated skeletal muscle after temporary sensory nerve innervation. Neuroscience. , 103-503 (2001).
  4. Batt, J., Bain, J., Goncalves, J., Michalski, B., Plant, P., Fahnestock, M., Woodgett, J. Differential gene expression profiling of short and long term denervated muscle. FASEB J. 20, 115-117 (2006).
  5. Sher, J., Cardasis, C. Skeletal muscle fiber types in the adult mouse. Acta Neurol. Scand. 54, 45-56 (1976).
  6. Agbulut, O., Noirez, P., Beaumont, F., Butler-Browne, G. Myosin heavy chain isoforms in postnatal muscle development of mice. Biol. Cell. 95, 399-406 (2003).
  7. Nagpal, P., Plant, P. J., Correa, J., Bain, A., Takeda, M., Kawabe, H., Rotin, D., Bain, J. R., Batt, J. A. The ubiquitin ligase nedd4-1 participates in denervation-induced skeletal muscle atrophy in mice. PLoS ONE. 7, e46427(2012).
  8. Plant, P. J., Bain, J. R., Correa, J. E., Woo, M., Batt, J. Absence of caspase-3 protects against denervation-induced skeletal muscle atrophy. J. Appl. Physiol. 107, 224-234 (2009).
  9. Varejao, A. S., Meek, M. F., Ferreira, A. J., Patricio, J. A., Cabrita, A. M. Functional evaluation of peripheral nerve regeneration in the rat: walking track analysis. J. Neurosci. Methods. 108, 1-9 (2001).
  10. Willand, M. P., Holmes, M., Bain, J., Fahnestock, M., de Bruin, H. Electrical muscle stimulation after immediate nerve repair reduces muscle atrophy without affecting reinnervation. Muscle Nerve. 48, 219-225 (2013).
  11. Sterne, G. D., Coulton, G. R., Brown, R. A., Green, C. J., Terenghi, G. Neurotrophin-3-enhanced nerve regeneration selectively improves recovery of muscle fibers expressing myosin heavy chains 2b. J. Cell Biol. 139, 709-715 (1997).
  12. Plant, P. J., North, M. L., Ward, A., Ward, M., Khanna, N., Correa, J., Scott, J. A., Batt, J. Hypertrophic airway smooth muscle mass correlates with increased airway responsiveness in a murine model of asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 46, 532-540 (2012).
  13. Bain, J. R., Mackinnon, S. E., Hunter, D. A. Functional evaluation of complete sciatic, peroneal, and posterior tibial nerve lesions in the rat. Plast. Reconstr. Surg. 83, 129-138 (1989).
  14. Hare, G. M., Evans, P. J., Mackinnon, S. E., Best, T. J., Midha, R., Szalai, J. P., Hunter, D. A. Walking track analysis: utilization of individual footprint parameters. Ann. Plast. Surg. 30, 147-153 (1993).
  15. McLean, J., Batt, J., Doering, L. C., Rotin, D., Bain, J. R. Enhanced rate of nerve regeneration and directional errors after sciatic nerve injury in receptor protein tyrosine phosphatase sigma knock-out mice. J. Neurosci. 22, 5481-5491 (2002).
  16. Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. J. Vis. Exp. (54), e3092(2011).
  17. Rogoz, K., Lagerstrom, M. C., Dufour, S., Kullander, K. VGLUT2-dependent glutamatergic transmission in primary afferents is required for intact nociception in both acute and persistent pain modalities. Pain. 153, 1525-1536 (2012).
  18. Thornell, L. E. Sarcopenic obesity: satellite cells in the aging muscle. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 14, 22-27 (2011).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи