"Freeze-трещин," метод подвергая внутренние ткани нематод C. Элеганс к антител для локализации белка, демонстрируется.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Чтобы окрасить C. Элеганс с антителами, относительно непроницаемой кутикулы должны быть обойдены с помощью химических или механических методов. "Заморозить взлома" является одним из методов, используемое для физического тянуть кутикулу от нематод путем сжатия нематоды между двумя прикрепленных горками, замораживая их, и потянув слайды друг от друга. Freeze-крекинга обеспечивает простой и быстрый способ получить доступ к тканям без химической обработки и могут быть использованы с различными фиксаторов. Однако, это приводит к потере многих образцов и требуемое сжатие механически искажает образец. Практика требуется, чтобы максимизировать восстановление образцов с хорошей морфологией. Freeze-крекинг могут быть оптимизированы для конкретных условий фиксации, сбора проб или низкой неспецифической окрашивания, но не по всем параметрам сразу. Для антител, которые требуют очень жестких условий фиксации и терпеть химических обработок, необходимых для химически проницаемыми кутикулу, ЛЕЧЕНИИможет быть предпочтительным т интактных нематод в растворе. Если антитело требует более легкий исправление или, если оптимальные условия фиксации неизвестны, сублимационной крекинг обеспечивает очень полезный способ быстро анализе антитело и может дать определенную внутриклеточную и клеточный информации для локализации представляющим интерес антигеном.
Введение
Для определения клеточного и внутриклеточную локализацию белков, ученые традиционно помечены ткани с антителами, выбранными специфически распознавать специфические белки 1. В некоторых модельных организмов, таких как C. Элеганс, окрашивание антител часто заменяется молекулярно-генетических методов, которые быстрее дают результаты. Они включают трансформирующие организмов с конструкциями, состоящими из гена слияния между промотором и кодирования областей интересующего гена и зеленый флуоресцентный белок. Тем не менее, молекулярные методы с учетом ряда артефактов, в том числе проблем с зная истинного промотор и изменения в экспрессии конструктов на ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько шагов протокола представлены варианты настройки и подготовки в зависимости от конкретных условий эксперимента. Для этих случаев альтернативные шаги представлены в виде A, B, C и т.д. Протокол с альтернативными шагами изложен на рисунке 1.
1. Подготовка Polylysine покрытием Слайды
Три различных типа слайдов могут быть использованы, в зависимости от желаемого компромисса между легкостью подготовки, относительной адгезии и неспецифическое связывание антитела. Информация о подготовке альтернатив скольжения приведены ниже на стадиях 1А-1С в порядке возрастания адгезии и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Когда черви правильно сжатый, трещины, и слегка фиксированной, практически весь червь может быть доступным для окрашивания антител (см. рисунок 2). Расположение ядер, как показано окрашивание DAPI указывает, какие части червя целы Когда черви подвергают более жесткой фиксатора, такого как формальдегид, морфология червя может быть искажено (как видно на неестественно волнистой появления Мышцы на фиг.3А-D). Другой распространенной проблемой является неравномерное фиксация или проникновени.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол замораживания взлома является одним из нескольких методов окрашивания антител в С. Элеганс. Это обеспечивает относительно простой способ окрасить червей, но требует специфических реагентов и практики для достижения оптимальных результатов. Критические шаги (изложенные на рисунке 1) включают в себя: 1) подготовка слайд (см. шаги 1 и 2) ручной сжатие нематод (см. пункты 2 и 3) быстрое фиксацию (см. шаг 3). Во-первых, чтобы максимизировать сцепление нематод в слайдах, то лучше подготовить.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Автор заявляет, что у нее нет никаких конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Финансирование было предоставлено NSF CCLI # 0633618 и университета Огайо. Некоторые штаммы были предоставлены Caenorhabditis генетический центр. Аспирант Reetobrata Басу появляется в видео.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Горка из поли-L-лизина (марка ESCO) | Fisher | 12-545-78 | Горки марки Sigma также подходят |
| для гидробромида поли-L-лизина | Sigma | P1524 | ВАЖНО: Марка и высокая молекулярная масса полилизина критическая |
| горка с одинарной матовой кромкой | Fisher | 48312-002 | Другие бренды подходят |
| азид натрия | Sigma | S2002-25G | TOXIC, надевайте перчатки и маску во время взвешивания порошка до 10% запаса. Надевайте перчатки при пропитывании стокового раствора |
| коплина для окрашивания банки | VWR | 47751-792 | Другие бренды подходят |
| 5-слайдовая почтовая машина | Электронная микроскопия Science | 71549-01 | Одна из многих различных марок маленького держателя предметного стекла, подходит для окрашивания |
| параформальдегида | VWR | MK262159 | <сильное>ВАЖНО: Обычные растворы формалина (37% формальдегида) НЕ подходят. Либо 1) Растворите кризатлалин параформальдегид в фосфатном буфере и храните в небольших аликвотах замороженными. Или 2) купите параформальдегид класса электронной микроскопии в аликвотах. TOXIC - надеть перчатки; Утилизируйте излишки пуха раковины водой. |
| Раствор глутарового альдегида, 25% в воде | Sigma | G 5882 | <сильный>ВАЖНО: приобретите глутаральдегид класса электронной микроскопии в ампулах; TOXIC - надеть перчатки; Утилизируйте излишки пуха раковины водой. |
| Triton X-100 | VWR | EM-9410 | Другие бренды подходят |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | ICN820451 | другие бренды подходят |
| Donkey Serum, лиофилизированная | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | Другие бренды подходят |
| Cy3 Donkey anti-Mouse IgG с множественной маркировкой | Jackson Immunoresearch | 715-165-150 | Эта компания рекомендуется для высококачественных многометочных (аффинно обедненных) антител. Выберите подходящий краситель и антиген (животное, используемое для получения первичных антител). |
| n-пропилгаллат | Fisher | ICN10274750 | других марок подходит |
| DAPI, 4',6'-диамидино-2-фенилиндола дигидрохлорид | Sigma | D 9542 | TOXIC. Наденьте перчатки и разложите на небольшие аликвоты и файзе, чтобы свести к минимуму воздействие |
| Ватман #1 диаметр 15 см фильтры | Fisher | 09805G | |
| Покровное стекло #1 1/2 прямоугольник 24 x 60 мм | VWR | 48393-252 | #1 1/2 толщина оптически лучшая папка |
| предметного стекла микроскопа | VWR | 48429-092 | Подходят другие бренды |
Ссылки
- Harlow, E., Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York City, New York. (1988).
- Mello, C., Fire, A. DNA Transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
- Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
